JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

이 작품은 신경 조직의 제어를위한 지역 자기력의 엔지니어링에 상향 식 접근 방식을 제시한다. 자기 나노 입자 (MNPs)로로드 된 뉴런 과 같은 세포는 수직 자화와 마이크로 패턴 플랫폼에 의해 도금및 제어됩니다. 또한 자기 특성화, MNP 세포 섭취, 세포 생존 가능성 및 통계 분석이 설명되어 있습니다.

초록

조직 된 신경망으로 뉴런을 직접 하는 능력은 재생 의학에 대 한 큰 의미를 가지고, 조직 공학, 그리고 바이오 인터페이싱. 많은 연구는 화학 및 지형 단서를 사용 하 여 신경 세포를 지시 하는 것을 목표로. 그러나, 넓은 지역에 미크론 규모에 조직 통제의 보고는 부족합니다. 여기서, 마이크로 패턴, 자기 원소에 내장된 자기 플랫폼을 사용하여 미리 설정된 부위에 뉴런을 배치하고 미크로네 스케일 해상도로 뉴런 아웃성장을 유도하는 효과적인 방법이 설명되었습니다. 자기 나노 입자 (MNP)를 가진 뉴런을 적재하는 것은 자기 그라데이션에 의해 영향을 받을 수 있는 민감한 자기 단위로 변환한다는 것을 보여주었습니다. 이 접근법에 따라, 일반적인 뉴런과 같은 모델인 PC12 세포가 도금되고 초파라자성 나노 입자로 로드되는 독특한 자기 플랫폼이 제작되었습니다. 안정적인 수직 자화를 가진 강자성(FM) 다층의 박막이 증착되어 자기 패턴을 향한 효과적인 어트랙션력을 제공하도록 증착되었다. 이러한 MNP 로드 PC12 셀은 자기 플랫폼 위에 도금및 분화되어 자기 패턴에 우선적으로 부착되었으며, 중성염 아웃성장이 패턴 형상과 잘 정렬되어 지향 네트워크를 형성하였다. 자기 특성의 정량적 특성화 방법, 세포 MNP 섭취량, 세포 생존가능성 및 결과의 통계적 분석이 제시된다. 이 접근법은 신경망 형성의 제어를 가능하게하고 자기력의 조작을 통해 신경-전극 인터페이스를 향상, 이는 네트워크의 체외 연구를위한 효과적인 도구가 될 수 있으며 새로운 치료 생체 통합 방향을 제공 할 수 있습니다.

서문

뉴런의 마이크로패턴은 조직 재생1,2,3,4,5 및 신경전자기기6,7,8의개발에 큰 잠재력을 지니고 있다. 그러나 생물학적 조직에서와 같이 높은 공간 해상도에서 뉴런의 미크론 스케일 포지셔닝은 중요한 과제를 제기합니다. 이 규모에 미리 디자인된 구조물을 형성하는 것은 현지으로 소마 운동성 및 축축한 성장을 통제하여 신경 세포 프로세스의 지도가 필요합니다. 이전 연구는 화학 및 물리적 단서의사용을 제안9,10,11,12 신경 성장을 안내하기위한. 여기서, 새로운 접근법은자기장 그라데이션(13,14,15,16,17)에의한 세포 포지셔닝을 제어하여 원격으로 조작할 수 있는 자기 민감성 단위로 MPP를 탑재하는 세포를 선회하는 데 초점을 맞추고 있다.

마그네틱 칩 및 MNP 로드 셀을 사용하여 세포 반응을 유도하는 데 필요한 힘을 특징으로 하는 Kunze 등은 세포 내부의 기계적 장력에 의해 초기 축하 신장을 유발할 수 있음을입증하였다(18). Tay 등은 향상된 자기장 그라데이션을 갖춘 미세 가공 기판이 칼슘 표시기염료(19)를사용하여 MP와 함께 투제된 신경 회로의 무선 자극을 허용한다는 것을 확인하였다. 더욱이, Tseng 외. 세포 내부의 나노 입자를 결합하여 세포장력(20)에접근하는 국소화된 나노입자 매개 력을 초래하였다. 이것은 기계적 힘에 세포 반응을 공부하는 것을 도운 마이크로 자기 기판의 정의된 패턴의 제조로 이끌어 냈습니다. 국소화된 나노입자 매개력의 적용으로부터 발생하는 세포장력은세포(20)내의 나노입자를 결합함으로써 달성되었다. 상보금속 산화물 반도체(CMOS)-미세유체 하이브리드 시스템은 CMOS 칩에 마이크로 전자석 배열을 내장하여 자기비드(21)로태그된 개별 세포의 움직임을 제어하는 이외 에 의해 개발되었다.

Alon 외. 마이크로 스케일, 미리 프로그래밍 된 자기 패드를 자기 "핫스팟"으로 사용하여 세포(22)를찾습니다. 특정 활성은 또한 특정 세포립23에서나노 입자를 국소화하기 위해 마이크로 패턴 자기 배열을 사용하여 세포 내에서 자극 될 수있다. 셀룰러 MNP 섭취량은 거머리, 쥐 및 마우스 기본 뉴런24,25,26에서성공적으로 입증되었다. 여기서, 이것은 이전에 MPNPs27의높은 upup을 보여주기 위하여 보고된 쥐 PC12 pheochromocytoma 세포주에서 입증되었습니다. 최근에는 암 치료제28,29,30,31에서약물 전달 및 열요법을 포함한 다양한 의료 응용 프로그램이 있었습니다. 구체적으로, 연구는 MP와 뉴런 네트워크32,33,34, 35의응용프로그램을다룹니다. 그러나, 단일 세포 수준에서 의원을 사용 하 여 뉴런의 자기 조직 추가 조사를 받을 자격이.

이 작품에서, 상향식 접근 방식은 신경 배열을 제어하기 위한 미리 디자인된 플랫폼을 통해 현지 자기력을 설계하기 위하여 기술되었습니다. FM 다층의 미크로네 스케일 패턴의 제조가 제시되었습니다. 이 독특한 FM 다층 구조는 안정적인 수직 자화를 만들어 모든 자기 패턴에 대한 효과적인 어트랙션 력을 초래합니다. 인큐베이션을 통해 MP는 PC12 세포에 로드되어 자기 에 민감한 장치로 변형시켰습니다. MNP 로드 된 세포, 도금 및 자기 플랫폼 위에 분화, 자기 패턴에 우선적으로 부착되었고, neurite 아웃 성장은 패턴 모양과 잘 정렬되어 지향 네트워크를 형성하였다. FM 다층 및 MP의 자기 특성을 특성화하기 위해 여러 가지 방법이 기재되었으며, 세포 MNP 섭취량 및 세포 생존 가능성 감수성에 대한 기술도 제시되었다. 또한, 뉴런 성장의 형태학적 매개 변수와 결과의 통계 적 분석은 상세하다.

프로토콜

참고: 생물 안전 캐비닛에서 모든 생물학적 반응을 수행합니다.

1. 자기 플랫폼 제작

  1. 리소 그래피
    1. 스크리버 펜을 사용하여 유리 슬라이드를 2 x 2cm2cm로 자른다. 아세톤으로 유리 슬라이드를 청소한 다음 이소프로파놀을 울트라 초음파 욕조에서 각각 5분 동안 청소합니다. 초고순도(UHP) 질소로 건조시다.
    2. 60s용 6,000rpm의 스핀 코팅을 사용하여 포토레지스트로 유리를 코팅하고 두께1.5μm에 도달하고 60s용 100°C에서 굽습니다. 포토마스크 나 마스크리스 리소그래피를 사용하여 원하는 패턴으로 포토 레지스트에 적합한 파장을 사용하여 샘플을 광원에 노출시하십시오.
    3. 제조업체의 지침에 따라 증류수(DW)로 희석된 개발자에서 40대 를 개발합니다. DW에서 45s로 세척하고 UHP 질소 가스로 건조시십시오. 광학 현미경으로 패턴을 검사합니다.
  2. 스퍼터 증착
    1. 증착 시스템의 메인 챔버에 샘플을 삽입하고 기본 압력 (~5 × 10-8 Torr)을 기다립니다. 가스 흐름을 엽니다. 본 원에서 표준 스퍼터링(28sccm[분당 표준 입방cm)에 대한 아르곤 흐름을 설정합니다. 스퍼터 대상을 점화한 다음 스퍼터 압력을 3mTorr로 설정합니다.
    2. 원하는 속도를 달성할 때까지 각 대상의 전력을 늘립니다.
      참고: Pd 요금: 0.62 A/s = 16s에서 1.0 nm; Co80Fe20 비율: 0.32 A/s, 0.2 nm 에서 6.25 s.
    3. 회전을 켭니다. 각각 대상 셔터를 열고 닫아 Co80Fe20과 Pd 대상을 번갈아 가며 FM 다층을 증정합니다. Co80Fe20 (0.2 nm)/Pd (1.0 nm)의 14 개의 바이레이어를 입금하고 추가 2 nm Pd 캡핑 레이어로 마무리하십시오.
    4. 리프트 오프: 샘플을 아세톤에 30분 간 담그고 이소프로판올로 헹구세요. 그런 다음 UHP 질소로 건조하고 사용전까지 깨끗하고 건조한 환경에서 샘플을 유지합니다.

2. 운송 측정을 통한 자기 장치의 특성화

  1. FM 다층으로 증착된 100 μm 너비의 교차 모양의 자기 막대가 있는 Si 기판 또는 유리 슬라이드를 사용합니다(그림 1C 인셋 참조). 양면 테이프를 사용하여 샘플을 홀더에 부착합니다.
  2. 와이어 본더를 사용하여 4개의 와이어를 샘플에 결합하고, 하나는 교차 전극의 각 다리에 연결됩니다. 자기장이 시료에 수직이 되도록 자기장으로 운송 측정 시스템 내부의 샘플 홀더 및 샘플을 설정합니다. 실온에서 측정을 수행합니다.
  3. 장치의 횡방향 전압(VT)측정을 수행; 그림 1C(인세트)의 표시를 따르십시오: 접점 1과 3 사이에 1mA의 전류를 적용합니다. 접촉 2와 4 사이의 VT를 측정합니다. 그런 다음 2와 4 사이의 전류를 적용하고 1과 3 사이의 전압을 측정합니다. 마지막으로, 측정의 전압 차이를 계산하고 VT를얻기 위해 2로 분할합니다. 스위칭 시스템을 사용하여 두 측정 구성 간에 자동으로 변경합니다.
  4. 자기장을 0.4 T에서 -0.4 T 사이의 단계로 5mT의 단계로 쓸어 내고 VT를 필드의 함수로 측정합니다. 횡방향 저항(VT/I)대 자기장을 플롯하여 필름의 수직 자화에 비례하는 비정상적인 홀 신호를 결정합니다.

3. 자기 측정에 의한 MP 및 자기 다층의 특성화

  1. FM 다층용 자기 측정
    1. SI 기판에 FM 다층입금(섹션 1.2 참조). 샘플을 4 x 4mm2 크기의 6 제곱으로 자른다. 샘플을 다른 위에 쌓고 자기장의 방향에 수직으로 캡슐에 정렬합니다(그림 1D 인세트 참조).
    2. 캡슐을 자력계에 삽입하고 실온에서 자화를 측정합니다. 자기장을 -0.4 T와 0.4 T 사이로 쓸어 버리면 됩니다.
    3. 자기 층의 두께, 샘플의 크기 및 기판 수를 고려하여 자기 물질의 총 부피를 계산합니다. 자기 물질의 총 부피로 자화를 분할합니다.
    4. 자기장(단위 부피당)과 자기장을 플롯합니다. 높은 자기장 반응으로부터 기판의 횡자기 배경을 빼고 그래프에서 FM의 포화 자화를 추정한다.
  2. MP용 자기측정
    1. 지정된 대량의 MP를 합성 폴리머 캡슐에 삽입합니다. 작은 자화 포화 값을 측정하는 경우 더 큰 볼륨을 고려하십시오.
    2. 의원이 용매에 일시 중단되는 경우 캡슐을 하룻밤 동안 열어 두어 MP를 건조하십시오. 캡슐을 자력계에 삽입하고 실온에서 자화를 측정합니다. 자기장을 -0.2 T와 0.2 T 사이로 쓸어 버리면 됩니다.
    3. 지정된 볼륨을 입자 농도로 곱하여 MP의 총 질량을 계산합니다. 결과를 1g으로 정규화합니다.
    4. 정규화된 자화(그램당)와 자기장을 플롯합니다. 그래프에서 MP의 자화 포화도를 추정합니다.

4. 콜라겐 코팅 프로토콜

  1. 코팅 플라스틱 접시
    1. 0.01 M HCl을 자동 증류수(DDW)의 500mL에 HCl 490 μL을 추가하여 준비합니다.
      참고: 화학 후드에서만 이 단계를 수행합니다.
    2. 콜라겐 타입 1(쥐 꼬리로부터용액) 0.01 M HCl에서 1:60-1:80을 희석하여 50 μg/mL의 최종 작동 농도를 얻습니다. 35mm 배양 접시에 희석 용액 1.5mL를 놓습니다. 후드에 접시를 1 시간 동안 그대로 둡니다.
    3. 용액을 제거하고 멸균 1x 인산염 완충식식염(PBS)으로 3배 세척합니다. 요리는 세포 씨를 위해 준비가되어 있습니다.
  2. 코팅 유리 슬라이드
    1. 콜라겐 타입 1 (쥐 꼬리에서 용액) 1:50 에서 30% v/v 에탄올을 희석합니다. 35mm 접시를 코팅하려면 20 μL의 콜라겐을 30% 에탄올 의 1mL에 추가하십시오.
    2. 용액으로 접시를 덮고 모든 솔루션이 증발할 때까지 기다려 몇 시간 동안 접시를 덮어 둡시다. 멸균 1x PBS로 3배 세척; 유리 슬라이드는 셀 시드를 위한 준비가 되어 있습니다.

5. 셀룰러 MNP 의 섭취와 생존 가능성

  1. 셀룰러 MNP 섭취
    1. 10% 말 세럼(HS), 5% 태아소 혈청(FBS), L-글루타민 1%, 페니실린/스트렙토마이신 1%, 로스트웰파크 의료연구소(RPMI) 배지에 0.2% 앰포테리신, 필터 를 사용하여 0.22 μm 을 사용하여 PC12 세포 배양을 위한 기본 성장 배지를 준비한다.
    2. 말 혈청(HS), L-글루타민 1%, 페니실린/연쇄절제술 1%, RPMI 배지에 0.2% 암포테리신을 추가하여 PC12 분화 매체를 준비하고 0.22 μm 나일론 필터를 사용하여 필터를 사용한다.
    3. 기본 성장 배지의 10 mL를 가진 비 처리 된 배양 플라스크에서 세포를 성장; 2-3일마다 플라스크에 기본 성장 배지 10mL를 추가하고 8일 후에 세포를 하위 배양한다.
    4. 세포 섭취의 경우, 원심분리기 튜브에서 20 ×0g 및 실온에서 8분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 상체를 폐기하십시오.
    5. 신선한 기본 성장 배지의 3 mL에서 세포를 다시 중단합니다. 다시, 원심 분리는 200 g및 실온에서 5 분 동안 세포 현탁액을 ×, 상체를 폐기합니다. 신선한 분화 배지의 3mL에서 세포를 다시 중단합니다.
    6. 주사기와 바늘을 사용하여 세포 클러스터를 분해하는 세포를 10배 흡입합니다. 혈전계를 사용하여 세포를 계산하고, 일반 코팅되지 않은 35mm 접시에 106 세포를 시드.
    7. 접시에 MNP 서스펜션의 계산된 부피와 분화 매체의 부피를 추가하여 원하는 MNP 농도 및 총 부피를 달성한다. 세포, MP 및 분화 배지를 혼합; 24시간 동안 37°C에서 5% CO2 가습 인큐베이터로 접시를 배양한다.
    8. 실온에서 20 ×0 g에서 5 분 동안 셀 서스펜션을 원심 분리하고 상복부을 폐기하십시오. 신선한 분화 배지의 1 mL에서 세포를 다시 중단하고 혈류계를 사용하여 세포를 계산합니다.
  2. MNP 로드 셀 분화
    1. 수행 프로토콜(섹션 5.1)을 수행합니다. 종자 8 × 104 MNP로드 셀에 35mm, 콜라겐 형 l-코팅 된 접시분화 배지의 존재(섹션 4.1에서 콜라겐 코팅 프로토콜 참조). 24 시간 후, 추가 1:100 신선한 뮤린 베타 신경 성장 인자 (β-NGF) (최종 농도 50 ng/mL).
    2. 분화 매체를 갱신하고 2 일마다 신선한 뮤린 β-NGF를 추가하십시오. 광학 현미경 검사를 사용하여 2 일마다 세포를 이미지합니다. 네트워크 형성 후(PC12 세포의 경우 6-8일), 공초점 현미경을 이용하여 세포를 이미지화하고, 입자의 형광을 관찰한다.
  3. MNP 로드 셀에 대한 생존 가능성 분석: 2,3-bis-(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-2H-테트라졸륨-5-카르바카니드(XTT) 세포 생존성 테스트.
    1. 5.1.1 단계에 따라 기본 성장 매체를 준비합니다. 다양한 농도(0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL 기본 성장 매체)에서 MPP를 가진 PC12 세포를 육성하고 또한 평평한 96웰 플레이트(총 부피 100 μL/well)에서 삼중판에 대한 제어에 대한 MPP없이 육성한다. 37°C에서 5% CO2,가습된 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 배양한다.
    2. 배경 보정을 위해 셀없이 매체를 포함하는 빈 우물을 준비합니다. XTT 시약 용액을 해동하고, 사용직전에 37°C 배스내로 N-메틸 디벤조피라진 메틸 황산염을 함유한 반응 용액을 해동한다. 명확한 해결책이 얻어지을 때까지 부드럽게 소용돌이치십시오.
    3. 하나의 96웰 플레이트의 경우 XTT 시약 5mL와 활성화 용액 0.1 mL을 혼합하십시오. 각 우물에 반응 용액의 50 μL을 추가하고, 우물에서 염료를 균일하게 분배하기 위해 접시를 약간 흔들어 5 시간 동안 인큐베이터에 플레이트를 배양합니다.
    4. 450 nm의 파장에서 효소 연결 면역 소르벤트 분석기(ELISA) 판독기를 사용하여 빈 우물에 대한 샘플의 흡광도를 측정합니다. 630 nm의 파장을 사용하여 기준 흡광도를 측정하고 450 nm 측정에서 빼낸다.
    5. XTT 시약으로 배양된 배양 배지에서 450nm의 약간의 자발적흡광도가 발생함에 따라, 다른 우물의 평균 흡광도를 빼낸다. 셀 샘플과 동일한 테스트된 농도에서 MP의 병렬 샘플에서 신호 값을 뺍니다.
  4. MNP 로드 셀에 대한 생존 가능성 분석: 레사쥐린 기반 세포 생존 가능성 테스트
    1. 5.1.1 단계에 따라 기본 성장 매체를 준비합니다. 다양한 농도(0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL, 기본 성장 매체에서 0.5 mg/mL) 및 24시간 동안 평평한 96웰 플레이트에서 MPPs를 제어하지 않고 MPP를 가진 PC12 세포를 경작한다. 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 배양한다. 세포 없이 배지를 포함하는 빈 우물을 준비합니다.
    2. 1x PBS로 셀을 씻으시면 됩니다. 37°C 인큐베이터에서 2h에 대한 배지에 레사쥐린 기반 시약(10%w/v)을 첨가한다.
    3. ELISA 리더에 샘플의 150 μL 알리쿼트를 배치하고 560 nm의 흡사 파장및 590 nm의 방출 파장에서 흡광도를 측정합니다. 셀 샘플과 동일한 테스트된 농도에서 MP의 병렬 샘플에서 신호 값을 뺍니다.

6. 유도 결합 플라즈마 (ICP)를 사용하여 세포 내부MNP 농도의 특성화

  1. 5.1.1 단계에 따라 기본 성장 매체를 준비합니다. 다른 농도 (0.1 mg / mL, 0.25 mg /mL, 기본 성장 매체에서 0.5 mg /mL) 및 평평한 96 웰 플레이트 (총 부피 100 μL /웰)에서 삼중 판에서 제어로 MPPs없이 MPP와 PC12 세포를 육성합니다. 5%CO2,가습인 인큐베이터에서 24시간 동안 37°C에서 배양한다.
  2. 서스펜션을 원심분리관(각각 잘 분리)으로 옮기고, 원심분리기 세포는 실온에서 5분 동안 × g에서 200g으로 옮기고 상부체를 폐기한다. 신선한 분화 배지의 1 mL에서 세포를 다시 중단하고 혈류계를 사용하여 세포를 계산합니다.
  3. 적어도 15 분 동안 각각 잘 각각 에 70 % 질산의 100 μL로 처리하여 세포를 lyse. lysed 셀에 DDW 5mL을 추가하고 솔루션을 필터링합니다.
  4. ICP를 사용하여 철 농도를 측정하고 세포 수를 사용하여 세포당 Fe 농도를 기록합니다.

7. 자기 플랫폼의 세포 분화 및 성장

  1. 패턴기판을 70% v/v/에탄올로 청소하고 기판을 후드에 35mm 배양 접시에 놓습니다. 패턴기판 아래에 큰 자석(~1500 Oe)을 1분 동안 놓고 먼저 자석에서 접시를 위아래로 이동한 다음 자석을 후드에서 꺼내서 자석을 제거합니다. 자외선을 15분 동안 켭니다.
  2. 4.2항에 따라 기판을 콜라겐 유형 1로 코팅합니다. 세포 MNP 섭취량(섹션 5.1), 35mm 배양 접시에105세포를 종자 후 세포를 중단하고, 분화 배지의 2mL를 추가한다. 37°C에서 5% CO2,가습인 인큐베이터로 배양한다.
  3. 24 시간 후, 추가 1:100 신선한 뮤린 β-NGF (50 ng/mL의 최종 농도). 분화 매체를 갱신하고 2 일마다 신선한 뮤린 β-NGF를 추가하십시오. 가벼운 현미경 을 사용하여 2 일마다 세포를 이미지하고, 네트워크 형성 후, 세포에 면역 염색을 수행 (섹션 8.1).

8. MNP로드 셀 염색

  1. 튜불린 면역 염색
    1. 10mL의 16%w/v PFA 용액, 10x PBS 4mL, DDW 26mL을 혼합하여 4% 파라포름데히드(PFA) 용액을 준비한다. 비이온 계면활성제500μL을 1x PBS50mL에 추가하여 50mL의 1% PBT를 50mL로 준비한다. 1% PBT의 25mL와 1x PBS의 25mL를 혼합하여 0.5% PBT의 50mL를 준비한다. 1% 소 세럼 알부민과 1%의 일반 당나귀 세럼을 0.25% PBT로 혼합하여 블로킹 솔루션을 준비합니다.
      참고: 화학 후드 내부에서만 PFA를 사용하십시오.
    2. 셀에서 상체 배지를 제거합니다. MNP로드 셀을 화학 후드 내부의 실온에서 15분 동안 4% PFA로 수정합니다. MNP로드 셀을 1x PBS로 3배, 세척할 때마다 5분씩 화학 후드 안에 세척합니다.
    3. MNP 로드 셀을 10분 동안 0.5% PBT로 페메아빌화합니다. MNP 로드 된 세포를 실내 온도에서 45 분 동안 차단용으로 먼저 배양한 다음 토끼 방지 α-tubulin 항체를 차단용으로 4 °C에서 밤새 차단합니다. 1x PBS로 MNP 로드 셀 3배, 세척 시 5분 세척.
    4. MNP로드 세포를 Cy2-conjugated 당나귀 항토끼 이차 항체로 어둠 과 실온에서 45분 동안 배양합니다. MNP로드 셀을 1x PBS로 3배, 세척할 때마다 5분 세척합니다.
    5. 공초점 이미징을 수행합니다. 튜룰린의 경우 492nm의 여기 파장과 510nm의 방출 파장을 사용하십시오. MP의 경우 (로다민)의 경우 578 nm의 흥분 파장과 613 nm의 방출 파장을 사용합니다.
  2. 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌 (DAPI)로 핵 염색
    1. MNP로드 셀을 1x PBS로 3배, 세척할 때마다 5분 세척합니다. 시료 주위의 여분의 액체를 제거하고, DAPI를 함유한 마운팅 매체의 1방울(~50 μL)을 추가하여 22mm x 22mm의 면적을 커버하고, 어둠과 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    2. MNP로드 셀을 1x PBS로 3배, 세척할 때마다 5분 세척합니다. 공초점 이미징을 수행합니다. DAPI의 경우 358nm의 난회 파장과 461nm의 방출 파장을 사용하십시오. MP의 경우 (로다민)의 경우 578 nm의 흥분 파장과 613 nm의 방출 파장을 사용합니다.

9. 측정 및 통계 분석

  1. MNP 로드 셀 분화의 형태 분석
    1. 세포체로부터의 다양한 거리에서 교차의 수를 측정하기 위해 NGF로 치료 후 최대 3일 동안 배양된 세포의 상 영상을 습득한다.
      참고: 나중에 수행하면 세포가 네트워크를 개발하여 단일 세포 분해능 측정을 방지할 수 있습니다.
      1. 이미지 프로세싱 프로그램인 ImageJ에서 이미지를 열고 반자동 중성염 추적 및 길이측정(36)을가능하게 하는 NeuronJ 플러그인을 사용합니다. neurite 추적자 플러그인을 사용하여 neurites를 추적하고 데이터를 이진 이미지로 변환합니다. 소마의 중심을 정의합니다.
      2. NeuronJ 플러그인에서 사용할 수 있는 Sholl 분석을 수행합니다. 최대 반지름을 정의합니다. 실험을 세 번 반복합니다. 각 실험에서 100개 이상의 세포를 분석합니다.
  2. 셀 현지화 분석
    1. 인큐베이션 3일 후 자기 영역에 국소화된 세포의 백분율을 결정하기 위해 MNP 섭취 유무에 관계없이 세포의 공초점 현미경 이미지를 획득한다. DAPI 염색(섹션 8.2)을 사용합니다.
    2. 수동으로 패턴 (감기 세포) 및 그렇지 않은 세포 위에 또는 부분적으로 세포를 계산합니다. 세 가지 실험을 반복합니다. MNP와 섭취량 없이 400개 이상의 세포를 분석합니다.
    3. 총 세포 수의 자기 패턴 위에 있는 세포의 상대적 비율을 계산합니다.
    4. 단일 샘플 Z-테스트를수행하여 세포 분포가 동위혈세포 착륙의 결과인지, 또는 자기 패턴에 바람직한 바이어스가 있는지 를 분석한다.
  3. 성장 지향성 분석
    1. 중성염 외성장 방향성에 미치는 영향을 정량화하기 위해 8일간의 배양 후 MNP 치료 유무에 관계없이 세포의 공초점 현미경 이미지를 획득한다. 면역 염색(섹션 8.1)을 수행합니다.
    2. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 두 조건에서 셀 중성염과 마그네틱 스트라이프 사이의 각도를 측정합니다.
      참고: 마그네틱 스트라이프에 있는 소마에서 유래한 중성염만 분석합니다.
    3. 줄무늬(Δθ)의 방향을 기준으로 중성염 각도의 분포를 플롯합니다. Δθ분포의 치제곱 테스트를 수행하여 분포가 정상또는 균일하지 않음을 입증합니다.

결과

기하학적 모양이 다른 자기 플랫폼이 제작되었습니다(그림1A). 자기 패턴은 스퍼터링에 의해 증착되었다 : Co80Fe20 및 Pd의 14 다층, 각각 0.2 nm 및 1 nm. 전자 현미경 검사법은 ~18nm(도1B)로자기 패턴의 총 높이를 드러냈다. 이 독특한 FM 다층 증착은 MNP로드 셀의 전체 자기 패턴과가장자리(22,<...

토론

대표적인 결과는 미크로네 규모의 신경망 형성을 제어하고 조직하기 위한 제시된 방법론의 효과를 입증한다. MNP로드 PC12 세포는 실행 가능한 상태로 남아 있으며 FM 전극에서 특정 부위로 자기 힘에 매료된 자기 민감성 장치로 변형되었습니다. 이것은 세포가 얇은 선이 아닌 육각형의 더 큰 정점에게 우선적으로 부착된 그림 5C에서가장 잘 설명됩니다. 더욱이, 세포의 분기는...

공개

저자는 경쟁 적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 말

이 연구는 과학 기술부, 이스라엘, 그리고 이스라엘 과학 재단 (569/16)에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solutionELECTRON MICROSCOPY SCIENCES15710
6-well cell culture plateFALCON353846
96-well cell culture plateSPL life sciences30096
Amphotericin B solutionBiological Industries03-028-1B
AZ 1514H photoresistMicroChemicals GmbH
AZ 351 B developerMicroChemicals GmbH
Bovine serum albumin (BSA)Biological Industries03-010-1B
Cell and Tissue cultur flaskBiofilTCF00225075.0 cm^2 250 mL Vent cap, Non-treated
Cell culture dishGreiner Bio-One627-16035 mm
Cell Proliferation Kit (XTT-based)Biological Industries20-300-1000
Centrifuge tubeBiofilCFT02150050 mL
Co80Fe20 at% sputter targetACI Alloys99.95%
Collagen type ICorning Inc.354236Rat Tail, concentration range 3-4 mg/mL
Confocal microscopeLeicaTCS SP5
Cy2-conjugated AffiniPure Donkey Anti-rabbit secondary antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-165-152
DAPI fluoromount-GSouthernBiotech0100-20
Disposable needleKDL23 G
Disposable  syringeMedispo116022764010 mL
Donor horse serumBiological Industries04-124-1A
ELISA readerMerk MilliporeBioTek synergy 4 hybrid microplate reader
Ethanol 70%ROMICAL LTD19-009102-80
Ethanol absolute (Dehydrated)Biolab-chemicals52505
Fetal bovine serum (FBS)Biological Industries04-127-1A
Fresh murine β-NGFPeprotech450-34
GMW C-frame electromagnet .Buckley systems LTD3470, 45 mm
Hydrochloric acid 32%DAEJUNG CHEMICAL & METALS4170-4100
ImageJUS National Institutes of Health, BethesdaNeuronJ plugin
Inductively coupled plasma (ICP)Ametek SpectroSPECTRO ARCOS ICP-OES, FHX22 MultiView plasma
Keithley source-measureKeithley2400
Keithley switching systemKeithley3700
L-glutamineBiological Industries03-020-1B
Light microscopeLeicaDMIL LED
Maskless photolithographyHeidelberg Inst.MLA150
Microscope SlidesBAR-NAORBN1042000C
Nitric acid 70%Sigma-Aldrich438073
Normal donkey serum (NDS)SigmaD9663
PBS 10xhylabsBP507/1LD
PC12 cell lineATCCCRL-1721
Pd sputter targetACI Alloys99.95%
Penicillin-streptomycin nystatin solutionBiological Industries03-032-1B
PrestoBlue cell viability reagentMolecular probesA-13261resazurin-based
Rabbit antibody to α-tubulinSanta Cruz Biotechnology, Inc.
RF magnetron sputtering systemOrion AJA Int.Orion 8
RPMI 1640 with l-glutamineBiological Industries01-100-1A
Sonication bathKUDOSSK3210HPFrequency: 53 kHz. Ultrasonic power: 135 W
SQUID magnetometerQuantum Design, CA
Triton X-100CHEM-IMPEX INTERNATIONAL1279non-ionic surfactant
XTT cell viability reagent

참고문헌

  1. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5 (1), 293-347 (2003).
  2. Kim, Y., Haftel, V. K., Kumar, S., Bellamkonda, R. V. The role of aligned polymer fiber-based constructs in the bridging of long peripheral nerve gaps. Biomaterials. 29 (21), 3117-3127 (2008).
  3. Dvir, T., Timko, B. P., Kohane, D. S., Langer, R. Nanotechnological strategies for engineering complex tissues. Nature Nanotechnology. 6 (1), 13-22 (2011).
  4. Antman-Passig, M., Shefi, O. Remote Magnetic orientation of 3D collagen hydrogels for directed neuronal regeneration. Nano Letters. 16 (4), 2567-2573 (2016).
  5. Hardelauf, H., et al. Micropatterning neuronal networks. Royal Society of Chemistry. 139 (1), 3256-3264 (2014).
  6. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nature Nanotechnology. 8 (2), 83-94 (2013).
  7. Sahyouni, R., et al. Interfacing with the nervous system: a review of current bioelectric technologies. Neurosurgical Review. 42 (2), 227-241 (2019).
  8. Mcguire, A. F., Santoro, F., Cui, B. Interfacing cells with vertical nanoscale devices: applications and characterization. Annual Review of Analytical Chemistry. 111226 (1), 1-12 (2018).
  9. Marcus, M., et al. Interactions of neurons with physical environments. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  10. Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
  11. Park, M., et al. Control over neurite directionality and neurite elongation on anisotropic micropillar arrays. Small. 12 (9), 1148-1152 (2016).
  12. Rutten, W. L. C., Ruardij, T. G., Marani, E., Roelofsen, B. H. Neural networks on chemically patterned electrode arrays: towards a cultured probe. Acta Neurochirurgica Supplement. 97 (2), 547-554 (2007).
  13. Bongaerts, M., et al. Parallelized manipulation of adherent living cells by magnetic nanoparticles-mediated forces. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6560 (2020).
  14. Kilgus, C., et al. Local gene targeting and cell positioning using magnetic nanoparticles and magnetic tips: comparison of mathematical simulations with experiments. Pharmaceutical Research. 29 (5), 1380-1391 (2012).
  15. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine. 7 (9), 1425-1442 (2012).
  16. Gahl, T. J., Kunze, A. Force-mediating magnetic nanoparticles to engineer neuronal cell function. Frontiers in Neuroscience. 12, 299 (2018).
  17. Goranov, V., et al. 3D Patterning of cells in magnetic scaffolds for tissue engineering. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
  18. Kunze, A., et al. Engineering cortical neuron polarity with nanomagnets on a chip. ACS Nano. 9 (4), 3664-3676 (2015).
  19. Tay, A., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Letters. 17 (2), 886-892 (2017).
  20. Tseng, P., Judy, J. W., Di Carlo, D. Magnetic nanoparticle-mediated massively parallel mechanical modulation of single-cell behavior. Nature Methods. 9 (11), 1113-1119 (2012).
  21. Lee, H., Liu, Y., Ham, D., Westervelt, R. M. Integrated cell manipulation system - CMOS/microfluidic hybrid. Lab on a Chip. 7 (3), 331-337 (2007).
  22. Alon, N., et al. Magnetic micro-device for manipulating PC12 cell migration and organization. Lab on a Chip. 15 (9), 2030 (2015).
  23. Tseng, P., Di Carlo, D., Judy, J. W. Rapid and dynamic intracellular patterning of cell-internalized magnetic fluorescent nanoparticles. Nano Letters. 9 (8), 3053-3059 (2009).
  24. Marcus, M., et al. Iron oxide nanoparticles for neuronal cell applications: uptake study and magnetic manipulations. Journal of Nanobiotechnology. 14, 37 (2016).
  25. Petters, C., Dringen, R. Accumulation of iron oxide nanoparticles by cultured primary neurons. Neurochemistry International. 81, 1-9 (2015).
  26. Sun, Z., et al. Characterization of cellular uptake and toxicity of aminosilane-coated iron oxide nanoparticles with different charges in central nervous system-relevant cell culture models. International Journal of Nanomedicine. 8, 961-970 (2013).
  27. Pinkernelle, J., Calatayud, P., Goya, G. F., Fansa, H., Keilhoff, G. Magnetic nanoparticles in primary neural cell cultures are mainly taken up by microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 32 (2012).
  28. Shubayev, V. I., Pisanic, T. R., Jin, S. Magnetic nanoparticles for theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews. 61 (6), 467-477 (2009).
  29. Pankhurst, Q. A., Connolly, J., Jones, S. K., Dobson, J. Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. Journal of Physics D: Applied Physics. 36 (13), 167-181 (2003).
  30. Krishnan, K. M. Biomedical nanomagnetics: a spin through possibilities in imaging, diagnostics, and therapy. IEEE Transactions on Magnetics. 46 (7), 2523-2558 (2010).
  31. Johannsen, M., et al. Thermotherapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles: feasibility, imaging, and three-dimensional temperature distribution. European Urology. 52 (6), 1653-1662 (2007).
  32. Roet, M., et al. Progress in neuromodulation of the brain: A role for magnetic nanoparticles. Progress in Neurobiology. 177, 1-14 (2019).
  33. Polak, P., Shefi, O. Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 11 (6), 1467-1479 (2015).
  34. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PloS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  35. Riggio, C., et al. The orientation of the neuronal growth process can be directed via magnetic nanoparticles under an applied magnetic field. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 10 (7), 1549-1558 (2014).
  36. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  37. Marcus, M., et al. Magnetic organization of neural networks via micro-patterned devices. Advanced Materials Interfaces. 7 (19), 2000055 (2020).
  38. Kachlon, Y., Kurzweil, N., Sharoni, A. Extracting magnetic anisotropy energies in Co/Pd multilayers via refinement analysis of the full magnetoresistance curves. Journal of Applied Physics. 115 (17), 173911 (2014).
  39. Gura, S., Margel, S. Nucleation and growth of magnetic metal oxide nanoparticles and its use. European Patent Office Publ of Application with search report. , (1999).
  40. Baranes, K., Kollmar, D., Chejanovsky, N., Sharoni, A., Shefi, O. Interactions of neurons with topographic nano cues affect branching morphology mimicking neuron-neuron interactions. Journal of Molecular Histology. 43 (4), 437-447 (2012).
  41. Baranes, K., Chejanovsky, N., Alon, N., Sharoni, A., Shefi, O. Topographic cues of nano-scale height direct neuronal growth pattern. Biotechnology and Bioengineering. 109 (7), 1791-1797 (2012).
  42. David-Pur, M., Bareket-Keren, L., Beit-Yaakov, G., Raz-Prag, D., Hanein, Y. All-carbon-nanotube flexible multi-electrode array for neuronal recording and stimulation. Biomed Microdevices. 16 (1), 43-53 (2014).
  43. Walia, S., et al. Flexible metasurfaces and metamaterials: A review of materials and fabrication processes at micro-and nano-scales. Applied Physics Reviews. 2, 11303 (2015).
  44. Ngo, D. T., et al. Perpendicular magnetic anisotropy and the magnetization process in CoFeB/Pd multilayer films. Journal of Physics D: Applied Physics. 47 (44), (2014).
  45. Barsukov, I., et al. Field-dependent perpendicular magnetic anisotropy in CoFeB thin films. Applied Physics Letters. 105 (15), 152403 (2014).
  46. Zhang, S., Gao, H., Bao, G. Physical principles of nanoparticle cellular endocytosis. ACS Nano. 9 (9), 8655-8671 (2015).
  47. Marcus, M., Skaat, H., Alon, N., Margel, S., Shefi, O. NGF-conjugated iron oxide nanoparticles promote differentiation and outgrowth of PC12 cells. Nanoscale. 7 (3), 1058-1066 (2015).
  48. Marcus, M., et al. Magnetic targeting of growth factors using iron oxide nanoparticles. Nanomaterials. 8 (9), 707 (2018).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

173PMA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유