쥐의 재현 가능한 집중 치료실 지향 내독소 모델

요약

여기에서, 우리는 쥐에서 재현 가능한 중환자 실 지향 내독소 모델을 제시한다.

초록

패혈증과 패혈성 쇼크는 중환자실에서 사망의 주요 원인으로 남아 있습니다. 패혈증 관리가 크게 개선되었음에도 불구하고 사망률은 여전히 20 ~ 30 %입니다. 패혈증 관련 다기관 부전 및 사망을 감소시키기 위한 새로운 치료 접근법이 시급히 필요하다. 견고한 동물 모델은 하나 또는 여러 가지 치료 접근법뿐만 아니라 생리 학적 및 분자 매개 변수에 대한 효과를 테스트 할 수 있습니다. 이 기사에서는 간단한 동물 모델을 제시합니다.

첫째, 전신 마취는 휘발성을 사용하거나 복강 내 마취에 의해 동물에서 유도됩니다. 정맥 내 카테터 (꼬리 정맥), 기관 절제술 및 동맥 내 카테터 (꼬리 동맥)의 삽입 후, 기계적 환기가 시작됩니다. 평균 동맥 혈압, 동맥 혈액 산소 포화도 및 심박수의 기준선 값이 기록된다.

인산염 완충 식염수에 용해 된 리포 폴리 사카라이드 (1 밀리그램 / 킬로그램 체중)의 주사는 톨과 같은 수용체 4를 통해 강력하고 재현 가능한 염증 반응을 유도합니다. 유체 교정뿐만 아니라 노르 에피네프린의 적용은 잘 확립 된 프로토콜을 기반으로 수행됩니다.

이 기사에서 제시 한 동물 모델은 배우기 쉽고 진정, 기계 환기, 지속적인 혈압 모니터링 및 반복적 인 혈액 샘플링을 갖춘 중환자 실에서 임상 패혈증 치료를 지향합니다. 또한이 모델은 신뢰할 수 있으므로 동물 연구의 3R (감소, 대체, 정제) 원칙에 따라 제한된 수의 동물로 재현 가능한 데이터를 사용할 수 있습니다. 패혈증 연구에서 동물 실험을 쉽게 대체 할 수는 없지만 반복적 인 측정은 동물을 줄이고 패혈성 동물을 마취 상태로 유지하면 고통을 줄일 수 있습니다.

서문

패혈증과 더 심한 형태인 패혈성 쇼크는 감염의 근거에 있는 증후군으로, 사이토카인의 방출과 함께 염증 반응이 과도하게 일어나 면역 방어가 억제되고 치명적인 결과^1,2로 생리적^, 생화학적 변화를 일으킨다. 이 불균형 한 염증 반응은 폐, 신장 및 간과 같은 다양한 중요한 기관에서 장기 기능 장애 및 장기 부전을 초래합니다. 37%³의 패혈증은 환자가 중환자실(ICU)에 입원해야 하는 가장 흔한 이유 중 하나입니다. 패혈증의 사망률은 현재 약 20-30 % ⁴입니다. 신속하고 효과적인 항생제 치료가 가장 중요합니다⁵. 유체 및 혈관 압착기 소생술은 조기에 설치되어야하며, 그 외에는 치료가 순전히 지원적입니다⁶.

패혈증은 장기 기능 장애를 동반하는 박테리아, 곰팡이, 바이러스 또는 기생충에 대한 입증되거나 의심되는 감염으로 정의됩니다. 패혈성 쇼크 기준은 추가적인 심혈관 붕괴가 유체 치료에만 반응하지 않을 때 충족되며, 2 밀리몰 / 리터 이상의 젖산 수치가 존재할 때^{충족됩니다 2}. 패혈증 관련 장기 부전은 모든 기관에서 발생할 수 있지만 심혈관 시스템, 뇌, 신장, 간 및 폐에서 매우 흔합니다. 패혈증으로 고통받는 대부분의 환자는 환자의 기도를 확보하고, 흡인으로부터 보호하며, 저산소증을 예방하거나 극복하기 위해 영감을받은 산소의 높은 비율로 긍정적 인 최종 호기 환기를 적용하기 위해 기관 내 삽관이 필요합니다. 기관관과 기계적 환기를 용인하기 위해 환자는 일반적으로 진정이 필요합니다.

그람 음성균의 막의 성분으로서 리포폴리사카라이드(LPS)와 같은 내독소는 톨형 수용체(TLR)4⁷을 통해 강한 염증 반응을 유도한다. 정의된 경로의 활성화는 안정한 염증 반응을 보장한다. 사이토카인 유도 호중구 화학유인제 단백질 1(CINC-1), 단핵구 화학유인제 단백질 1(MCP-1), 및 인터루킨 6(IL-6)과 같은 사이토카인은 이 모델⁸에서 중증도 및 결과에 대한 예후 인자로 알려져 있다. 정맥내 LPS 적용은 래트 ^8,9에서 패혈증의 다양한 측면을 연구하는데 성공적으로 사용되어 왔다.

패혈증의 치료는 특히 예측 동물 모델의 부족으로 인해 여전히 도전입니다. 전신 염증의 활성화와 함께 내독소혈증이 약리학적 치료법의 개발을 위한 적절한 모델이라면 논쟁의 여지가 있다. 그러나, 잘 알려진 LPS 유도 TLR 4 경로를 통해 중요한 지식을 얻을 수 있다.

프로토콜

이 프로토콜에 제시된 모든 실험은 스위스 취리히 광저우의 수의학 당국 (승인 번호 134/2014 및 ZH088/19)의 승인을 받았습니다. 또한이 실험에서 수행 된 모든 단계는 스위스 중소 과학 아카데미 (SAMS)의 동물 실험 지침 및 유럽 실험실 동물 과학 협회 연맹 (FELASA)의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 마취 유도 및 동물 모니터링

1. 250-300 그램 (g)의 체중을 가진 수컷 Wistar 쥐를 병원균이없는 조건의 환기 케이지에 보관하십시오. 22 ± 1 °C의 주변 온도에서 12-12 시간의 빛 / 어두운 사이클을 제공하고 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수 있습니다.
2. 마취 유도 박스에서 이소플루란(농도 3-5%)을 사용한 휘발성 유도에 의해 전신 마취를 30초 동안 유도하거나(그림 1A) 또는 대안으로 케타민/자일라진(체중 100g 당 10/1밀리그램(mg))을 1회 주사하여 마취를 유도합니다.
3. 동물을 작업장으로 옮기고 전체 실험 기간 동안 동물을 난방 매트에 놓습니다. 체온을 36.5 ~ 37 °C 사이로 유지하십시오.
4. 노즈콘을 사용하여 산소를 공급하십시오 (600 mL / 분). 휘발성 마취가 마취 유지를 위해 선택된 경우 이소플루란 2-3%를 첨가한다. 동물이 자발적으로 호흡하고 있는지 확인하십시오.
5. 기관 절제술과 동맥 및 정맥 카테터를 설치하기 전에 발가락 핀치 반사가 없어 마취 수준을 확인하십시오.
6. 주변 산소 포화도 모니터링(정상 산소 포화도 98 - 100%)을 통해 충분한 산소화를 확인합니다.
7. 눈을 보호하기 위해 연고 (비타민 A 연고)를 사용하십시오.
8. 도 1B에 표시된 바와 같이 멸균 수술기구와 카테터를 사이드 테이블에 준비한다.
9. 또한 그림 1C에 표시된 대로 압력 및 산소 포화도 모니터링을 준비합니다.

2. 정맥 내 접근

1. 정맥 접근을 용이하게하기 위해 쥐의 근위 꼬리에 지혈대를 바르십시오 (그림 2A).
2. 꼬리를 알코올로 3 번 소독하십시오.
3. G26 정맥내 카테터를 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나로 유도한다.
   참고 : 우리의 경험에 비추어 볼 때 여기 정맥이 피부에 더 가깝게 위치하기 때문에 쥐 꼬리의 원위 부분에 정맥 내 접근을 배치하는 것이 더 쉽습니다. 또한, 캐너레이션에 실패한 경우, 근접하게 이동할 수 있는 충분한 공간이 있습니다.
4. 엄격하게 공기 주입을 피하십시오.
5. 정맥 내 카테터를 놓은 후 지혈대를 풀어줍니다.
6. 정맥 카테터를 접착 테이프로 제자리에 고정시킵니다(그림 2B).
7. 주사기 펌프를 정맥 내 접근에 연결하여 지속적인 유체 및 약물 적용을 수행합니다.
8. 볼루스액, 약물 적용 및 정맥 혈액 샘플링을 위해 3 방향 스토콕을 사용하십시오.

3. 기관지 절제술

1. 동물의 앞쪽 목 부위를 면도하십시오.
2. 면도 된 피부를 프로비돈 요오드 용액으로 3 번 소독하십시오.
3. 메스를 사용하여 약 2cm 세로 절개를 수행하십시오 (블레이드 번호 10 포함).
4. 2-0 실크 봉합사로 피부를 수축시킵니다.
5. 수술 가위로 후두와 기관을 무뚝뚝하게 준비하십시오 (그림 3A).
6. 3-5^번째 기관 걸쇠에서 외과 용 마이크로 가위로 기관을 열어야합니다.
7. 멸균 기관 캐뉼라를 기관지에 삽입하십시오. 일방적 인 환기를 피하기 위해 캐뉼라를 너무 깊게 삽입하지 마십시오.
8. 2-0 실크 봉합사를 사용하여 캐뉼라를 제자리에 고정하십시오.
9. 캐뉼라를 환기 장치에 연결하여 압력 또는 볼륨 조절 환기를 가능하게 합니다(그림 3B).

4. 동맥 접근

1. 쥐 꼬리를 포비돈 - 요오드 용액으로 3 번 소독하십시오.
2. 복부 쪽에서 세로 1cm 정도의 메스 (블레이드 번호 10 포함)를 사용하여 피부를 자릅니다.
3. 조심하십시오, 꼬리 동맥의 부상을 피하기 위해 너무 깊게 자르지 마십시오.
4. 수술 현미경을 사용하여 동맥을 조심스럽게 노출시킵니다. 외과 용 마이크로 가위로 동맥 주위의 근막을 자르십시오.
5. 6-0 실크 봉합사를 사용하여 동맥의 원위 부분을 Ligate하십시오.
6. 근위 6-0 실크 봉합사를 준비하되 실크를 조이지 마십시오 (그림 4A).
7. G-26 카테터를 원위 및 근위 실크 봉합사 사이의 동맥에 도입하십시오.
8. 카테터가 동맥에 있으면 근위 실크 봉합사를 조이고 카테터를 제자리에 고정시킵니다 (그림 4B).
9. 카테터를 압력 변환기에 연결하여 지속적인 동맥압 측정(정상 평균 동맥압: 60 - 100mmHg)을 제공합니다(그림 4C).
10. 또한, 압력 트랜스듀서에 연결된 카테터와 동맥 혈액 샘플링을 위한 G-26 카테터 사이에 3방향 스톱콕을 배치하십시오.

5. 기준선 측정, 패혈증 유도 및 후속 측정

1. 동물이 정상 상태에 도달 한 후 LPS를 주입하십시오.
2. 정상 상태에 도달하면 혈액 샘플을 수집하십시오 (일반적으로 15-30 분 후).
3. 혈액 샘플의 체액 손실을 링거의 용액으로 1:4의 비율로 대체합니다.
4. 패혈증을 유도하려면 LPS를 볼루스 또는 연속 LPS 적용으로 주입하십시오.
5. 볼루스 적용을 위해, 1 mg/mL의 농도로 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해된 LPS/킬로그램 체중(kg) 1 mg을 주입하십시오.
6. 연속 적용을 위해, 주사기 펌프를 사용하여 전체 실험에 걸쳐 300μg의 LPS/kg/시간을 주입하십시오(LPS의 원액: PBS에 1mg/mL).
7. 공기 색전증을 방지하기 위해 항상 공기 주입을 피하십시오.
8. 실험을 시작하기 전에 유체 대체 프로토콜, 혈관 수축기 적용 프로토콜 및 낙태 기준 (예 : 유체 교체에도 불구하고 30 분 이상 동안 50 mmHg 이하의 평균 동맥 혈압으로 정의 된 저혈압)을 정의하십시오.
   참고 : 링거 용액을 10 mL / kg / 시간의 속도로 지속적으로 주입하는 것이 좋습니다.
9. 주입된 양으로부터 유체의 임의의 연속 투여(예를 들어, 연속 LPS 적용을 위해)를 빼서 결과가 대조군의 그것들과 비교되도록 한다.
   참고 : 실험이 끝날 때, 그리고 조직 학적 또는 생화학 적 검사와 같은 추가 분석을 위해 간, 신장 또는 비장과 같은 장기를 수확하기 전에 동물은 열등한 카바 정맥을 절개하여 안락사 할 수 있습니다. 안락사의 권장 방법은 열등한 정맥 카바를 절개하고 얼음처럼 차가운 식염수를 왼쪽 심장에 주사하기 전에 동물을 마취의 외과 적 평면으로 데려 오는 것입니다 특히 장기의 염증 마커를 평가해야하는 경우. 법적 요구 사항 및 현지 지침을 준수해야합니다. 패혈증 관련 장기 부전을 검증하기 위해, 신장의 관형 손상을 확인하기 위해 카스파제-3와 같은 프로-아폽토시스 마커와 α1-마이크로글로불린을 분석할 수 있다. CINC-1, MCP-1 및 IL-6과 같은 마커의 기관 특이적 분석은 또한 기관 특이적 염증 반응에 대한 정보를 제공할 수 있다.

결과

제시된 시스템은 이전에 보고된 바와 같이 혈역학적으로 안정한 동물로 내독소혈증을 허용한다⁹. LPS 자극이 없는 동물에서 평균 동맥압이 안정적으로 유지되고 LPS 처리된 동물은 CINC-1(867 ng/mL), MCP-1(5027 ng/mL), IL-6(867 ng/mL)8과 같은 혈장 사이토카인(적용 후 6^시간)에 의해 측정된 음성 염기 과잉 및 강한 염증 반응과 같은 패혈증의 특성을 발달시키고,

토론

여기에 설명 된 프로토콜은 매우 재현 가능하지만 배우기 쉬운 패혈증 모델을 허용하며, 이는 연구 질문에 따라 적응 될 수 있습니다. 심박수, 혈압 및 말초 동맥 산소 포화도와 같은 장기 기능을 언급하는 필수 생체내 데이터는 연속적으로 수집될 수 있고, 혈액 샘플링은 실험 전반에 걸쳐 반복적으로 수행될 수 있다. 또한, 유체 교체 프로토콜 및 혈관 프레서 지원과 관련된 수정을 설치할 수 있?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-0 silk sutures	Ethicon, Sommerville, NJ	K833	Standard surgical
26 intravenous catheter	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	391349	Standard anesthesia equipment
6-0 LOOK black braided silk	Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA	SP114	Standard surgical
Alaris Syringe Pump	Bencton Dickinson
Betadine	Mundipharma, Basel, Switzerland	7.68034E+12	GTIN-number
Curved fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	504513	Facilitates vascular preparation
Fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	501976	Tips need to be polished regularly
Infinity Delta XL Anesthesia monitoring	Draeger, Lübeck, Germany
Isoflurane, 250 mL bottles	Attane, Piramal, Mumbai, India	LDNI 22098	Standard vet. equipment
Ketamine (Ketalar)	Pfitzer, New York, NY
Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli, serotype 055:B5	Sigma, Buchs, Switzerland
Q-tips small	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	EH11.1	Standard surgical
Ringerfundin	Bbraun, Melsungen, Germany
Tec-3 Isofluorane Vaporizer	Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL	not available anymore	Standard vet. equipment
Xylazine (Xylazin Streuli)	Streuli AG, Uznach, Switzerland