전체 마운트 면역형광 염색, 컨포칼 이미징 및 마우스 내 동방방 및 방실 결절의 3D 재구성

요약

우리는 쥐 심장에서 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN)의 전체 마운트 면역 형광 염색을위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

초록

동방 결절 (SAN)의 심박 조율기 세포에 의해 생리 학적으로 생성 된 전기 신호는 방실 결절 (AVN)을 포함하는 전도 시스템을 통해 전도되어 전체 심장의 흥분과 수축을 허용합니다. SAN 또는 AVN의 기능 장애는 부정맥을 유발하여 전기 생리학 및 부정맥 발생에서 근본적인 역할을 나타냅니다. 마우스 모델은 부정맥 연구에 널리 사용되지만 SAN 및 AVN에 대한 구체적인 조사는 여전히 어렵습니다.

SAN은 상대 정맥과 크리스타 터미널의 교차점에 위치하고 AVN은 관상 동맥, 삼첨판 고리 및 Todaro의 힘줄의 구멍에 의해 형성된 Koch의 삼각형의 정점에 위치합니다. 그러나 크기가 작기 때문에 기존 조직학에 의한 시각화는 여전히 어렵고 3D 환경 내에서 SAN 및 AVN을 연구할 수 없습니다.

여기에서는 라벨링된 마우스 SAN 및 AVN의 로컬 시각화를 허용하는 전체 마운트 면역형광 접근법에 대해 설명합니다. 전체 마운트 면역형광 염색은 수동 절편이 필요 없는 조직의 더 작은 부분을 위한 것입니다. 이를 위해 마우스 심장을 해부하고 원치 않는 조직을 제거한 다음 고정, 투과 및 차단합니다. SAN 및 AVN 내의 전도 시스템의 세포는 항 -HCN4 항체로 염색됩니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 및 이미지 처리를 통해 결절 세포와 작동하는 심근 세포를 구별하고 SAN과 AVN을 명확하게 국소화할 수 있습니다. 또한, 추가 항체를 결합하여 신경 섬유와 같은 다른 세포 유형도 표지 할 수 있습니다.

기존의 면역 조직학과 비교하여 전체 마운트 면역 형광 염색은 심장 전도 시스템의 해부학 적 무결성을 보존하여 AVN을 조사 할 수 있습니다. 특히 해부학 적 구조와 주변의 작동하는 심근 및 비 근육 세포 세포와의 상호 작용에 대해서도 마찬가지입니다.

서문

부정맥은 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 흔한 질병이며 전 세계적으로 심각한 이환율과 사망률의 원인입니다. 심장 박동기의 개발과 같은 치료 및 예방의 엄청난 발전에도 불구하고 부정맥 치료는 주로 근본적인 질병 메커니즘에 대한 지식이 매우 제한적이기 때문에 여전히 어렵습니다 ^1,2,3. 정상적인 전기 생리학과 부정맥의 병태생리학을 더 잘 이해하면 미래에 새롭고 혁신적이며 인과 관계가 있는 치료 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 부정맥 발생을 종합적으로 연구하려면 마우스가 전기 생리학 연구에 널리 사용되기 때문에 마우스와 같은 동물 모델에서 특정 심장 전도 시스템을 국소화하고 시각화하는 것이 중요합니다.

심장 전도 시스템의 주요 부분은 특수 심박 조율기 세포에서 전기 충격이 생성되는 동방 결절 (SAN)과 심방과 심실 사이의 유일한 전기적 연결 인 방실 결절 (AVN)입니다⁴. SAN과 AVN의 전기 생리 학적 특성이 변경 될 때마다 아픈 부비동 증후군이나 방실 차단과 같은 부정맥이 발생하여 혈역학 적 악화, 실신 및 심지어 사망으로 이어질 수 있으므로 전기 생리학 및 부정맥 발생에서 SAN과 AVN의 필수적인 역할을 강조합니다⁵.

SAN 또는 AVN에 대한 포괄적인 연구에서는 두 구조의 정확한 위치 파악과 시각화가 필요하며, 이상적으로는 생리학적 환경 내에서 가능합니다. 그러나 작동하는 심근 내의 크기와 위치가 작기 때문에 명확한 거시적으로 보이는 구조를 설정하지 않고 SAN 및 AVN의 해부학 및 전기 생리학을 연구하는 것은 어렵습니다. 해부학적 랜드마크를 사용하여 SAN 및 AVN ^6,7,8이 포함된 영역을 대략적으로 식별할 수 있습니다. 간단히 말해서, SAN은 근육 크리스타 터미널 (CT)에 인접한 우심방의 기병 간 영역에 위치하며, AVN은 삼첨판 막, 관상 동맥동의 ostium 및 Todaro의 힘줄에 의해 설정된 Koch의 삼각형 내에 위치합니다. 지금까지 이러한 해부학 적 랜드 마크는 주로 SAN 및 AVN을 개별 구조로 국소화, 제거 및 연구하는 데 사용되었습니다 (예 : 기존 조직학). 그러나 SAN 및 AVN의 복잡한 전기 생리학(예: 작동하는 심근의 인접 세포의 조절 효과)을 더 잘 이해하려면 생리학적 3D 환경 내에서 전도 시스템을 연구해야 합니다.

전체 마운트 면역 형광 염색은 주변 조직의 무결성을 유지하면서 현장에서 해부학 적 구조를 연구하는 데 사용되는 방법입니다⁹. 컨포칼 현미경 및 이미지 분석 소프트웨어를 활용하여 SAN 및 AVN은 이러한 영역에서 특이적으로 발현되는 이온 채널을 표적으로 하는 형광 표지된 항체로 시각화할 수 있습니다.

다음 프로토콜은 SAN 및 AVN 현미경 위치 파악 및 시각화를 위해 잘 정립된 전체 마운트 염색 방법을 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 특히, 이 프로토콜은 (1) 염색 및 현미경 분석을 위해 이러한 샘플을 준비하기 위해 해부학적 랜드마크로 SAN 및 AVN을 국소화하는 방법 (2) 참조 마커 HCN4 및 Cx43의 전체 마운트 면역형광 염색을 수행하는 방법(3)을 설명하고, SAN 및 AVN의 컨포칼 이미징을 수행하기 위해 컨포칼 현미경을 위한 SAN 및 AVN 샘플을 준비합니다(4). 우리는 또한 심장 내의 심장 전도 시스템을 철저히 조사 할 수있는 자율 신경 섬유와 같은 주변 작동 심근 또는 비 근육 세포 세포의 추가 염색을 포함하도록이 프로토콜을 수정하는 방법을 설명합니다.

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프로토콜

동물 관리 및 모든 실험 절차는 뮌헨 대학의 동물 관리 및 윤리위원회의 지침에 따라 수행되었으며 마우스에 대한 모든 절차는 독일 뮌헨 바이에른 정부의 승인을 받았습니다(ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J 마우스는 잭슨 연구소로부터 구입하였다.

참고: 그림 1 은 실험에 필요한 기기를 보여줍니다. 도 2 는 총 심장 해부학의 그림을 나타낸다. 도 3 은 성인 마우스 심장에서 SAN 및 AVN의 위치를 나타낸다. 도 4 는 공초점 현미경에 로딩된 준비된 샘플을 나타낸다.

1. 준비

1. PBS 30mL에 16% 포름알데히드 용액 10mL를 희석하여 4% 포름알데히드 용액(4% PFA)을 준비합니다.
2. 수크로오스 분말 15g과 30g을 각각 PBS 100mL에 녹여 15% 수크로오스 용액과 30% 수크로오스 용액을 제조한다. 슈크로스 분말이 완전히 용해된 후, 4°C에서 저장하기 전에 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과한다.
3. 3%-4% 아가로스 겔을 준비하고, 3g 또는 4g의 아가로스 분말과 100mL의 1x TAE(50x TAE 원액에서 희석)를 비이커에 추가합니다. 비커를 자기 교반기에 놓고 아가 로스가 완전히 녹을 때까지 끓입니다.
4. 직경 30mm의 페트리 접시에 아가로스 겔(3%-4%)을 100mL 부드럽게 부어 해부 접시를 준비합니다. 페트리 접시를 실온의 벤치에 두어 식히고 굳 힙니다.
5. 블로킹 용액과 세척액을 표 1에 제공된 레시피에 따라 준비한다. 사용 당일에 준비된 모든 용액을 준비하십시오. 장기 보관은 권장하지 않습니다.
6. 항체 용액을 차가운(4°C) 1x PBS로 희석하여 준비하고, 희석액을 빛으로부터 보호하고(예: 알루미늄 호일을 감싸서) 사용할 때까지 희석액을 얼음 위에 보관합니다. 배양 직전에 항체를 희석하십시오. 희석된 항체를 실온에 방치하지 마십시오.
   참고: 적절한 항체 희석은 기존의 면역형광 염색을 수행하여 비교 가능한 조직 샘플로 테스트해야 합니다. 여기에서, 10 μm의 두께로 절단된 동결 절편을 염색하여 항체를 시험하였다.

2. 장기 적출 및 조직 준비

1. 마우스를 이소플루란 기화기에 연결된 배양 챔버에 넣어 마취합니다. 4-5 % 이소 플루 란 (각각 96-95 % 산소)을 전달하도록 기화기를 설정하십시오.
   알림: 완전 마취는 자세 반응의 상실과 마우스가 등을 대고 놓일 때까지 챔버를 부드럽게 굴려 반사를 교정함으로써 확인됩니다.
2. 마우스를 수술대 위의 앙와위 자세로 놓습니다. 마우스 코를 이소플루란 기화기에 연결된 내부 튜브가 있는 수정된 Bain 회로에 연결된 마취 마스크에 넣습니다. 마취를 유지하려면 1 L / min의 유속으로 산소에 1-2 % 이소 플루 란을 사용하십시오. 마스크의 외부 튜브를 통해 마우스에서 과도한 마취 증기를 제거하고 과도한 마취 가스를 흡수하는 활성탄 용기를 통해 흡입합니다.
3. 완전 마취가 이루어지면 진통제를 위해 펜타닐을 주사하십시오 (0.1 μg / 25 g 체중 i.p.).
4. 발가락 핀치 반사가 감지되지 않으면 홍채 가위를 사용하여 경정맥에서 교합체까지 명확하게 절단하여 모피와 피부를 제거합니다. 홍채 가위를 사용하여 갈비뼈 아래에서 왼쪽에서 오른쪽으로 다시 잘라 복부를 조심스럽게 엽니 다.
5. 구부린 집게를 사용하여 xiphoid를 약간 살려 장기를 손상시키지 않고 다이어프램을 왼쪽에서 오른쪽으로 절단할 수 있습니다. 홍채 가위를 사용하여 양쪽의 내측 겨드랑이 선에서 흉곽을 잘라 두개골로 뒤집고 심장에 접근 할 수 있도록합니다.
6. 홍채 가위를 사용하여 횡격막 수준에서 하대 정맥과 하강 흉부 대동맥을 자릅니다. 정점 부위에 27G 바늘로 심장을 뚫은 다음 바늘을 좌심실 (LV)에 조심스럽게 밀어 넣습니다. 5-10mL의 얼음처럼 차가운 PBS를 LV에 부드럽게 주입하여 심장을 관류시킵니다.
   알림: 심장의 색이 빨간색에서 회색으로 바뀌어 PBS로 성공적으로 관류되었음을 나타냅니다.
7. 핀셋을 사용하여 심장의 정점을 조심스럽게 들어 올려 큰 혈관을 자르고 심장을 제거합니다.
8. 상대정맥(SVC)의 손상을 방지하기 위해 심장에서 가능한 한 멀리 떨어진 큰 동맥과 정맥을 절단하여 심장을 절제하십시오. SVC는 나중에 처리하는 동안 중요한 랜드마크 역할을 하므로 보존합니다.
9. 심장 제거 후 이소 플루 란 기화기를 끄십시오.
10. 해부 현미경으로 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 해부 접시에 심장을 넣으십시오. 심장의 왼쪽 / 오른쪽 및 앞 / 뒤를 결정한 후 접시 바닥에있는 심장의 앞쪽으로 심장을 돌립니다 (뒤쪽에있는 큰 혈관을 노출시키기 위해).
11. 정점과 좌심방 부속기 (LAA)를 통해 작은 핀을 해부 접시 바닥의 아가 로스에 넣어 심장을 고정시킵니다 (그림 2A). 가는 핀셋과 가위를 사용하여 SVC 주변의 비심장 조직과 하대정맥(IVC)(예: 폐, 지방, 심낭)을 조심스럽게 제거하여 기층 간 영역을 노출시킵니다(그림 3A).
12. 마이크로 가위로 심실과 심방 사이의 홈을 평행하게 절단하여 대부분의 심실을 제거합니다. 나중에 Plexiglas 링에 로딩하기 위해 심실 조직의 작은 부분을 보존하십시오.
13. 고정 및 탈수를 위해, 샘플(심방, SVC 및 IVC 함유)을 4% PFA에 넣고 4°C에서 밤새 하였다.
14. 다음날, 심장을 4°C에서 24시간 동안 15% 수크로스 용액으로 옮긴다.
15. 다음날, 심장을 4°C에서 24시간 동안 30% 수크로스 용액으로 옮긴다.
    참고: 2.13, 2.14 및 2.15단계의 고정 및 탈수를 위해 샘플을 더 이상 교반하거나 흔들지 않고 4°C에 둡니다.

3. 전체 마운트 면역 형광 염색

1. PBS에 희석된 1% Triton X-100으로 심장을 세척하고 4°C에서 밤새 블로킹 용액(표 1)에서 차단 및 투과화시켰다.
2. 심장을 1.5mL 튜브에 넣고 블로킹 용액으로 희석한 토끼 항-마우스 코넥신-43(1:200의 희석) 및 래트 항-마우스 HCN4(1:200의 희석) 항체와 함께 4°C에서 7일 동안 배양합니다.
   참고: 데이터시트를 배향으로 사용하기 전에 1차 항체의 최적 농도를 테스트해야 합니다. 1차 항원의 숙주 종이 다른 항원과 상이한 한, 관심있는 다른 항원도 이 단계에서 염색될 수 있다. Triton X-100의 농도가 높을수록¹⁰ 이전에 입증 된 바와 같이보다 효율적인 항체 염색을 얻는 데 도움이 될 수 있지만 농도는 개별적으로 결정될 수 있습니다.
3. 7 일 후, 피펫을 사용하여 1 차 항체가 포함 된 용액을 제거하고 1 % Triton X-100 용액으로 심장을 3 회 (오비 탈 셰이커에서 실온에서 1 시간 동안) 씻어 낸다.
4. 세척 후, 심장=알렉사 플루오르 488 염소 항-래트 IgG (1:200의 희석) 및 알렉사 플루오르 647 염소 항-래빗 IgG (1:200의 희석)와 함께 4°C에서 7일 동안 인큐베이션한다.
5. 7일 후, 피펫을 사용하여 2차 항체를 포함하는 모든 용액을 제거한다. 그런 다음 세척액 (표 1)을 사용하여 3 회 (오비 탈 쉐이커에서 실온에서 1 시간 동안마다) 심장을 씻으십시오.
6. 핵을 염색하려면 심장을 DAPI 용액(10μg/mL)에서 4°C에서 밤새 배양합니다.
7. 다음날, 세척액으로 심장을 3 번 씻으십시오 (오비 탈 셰이커의 실온에서 1 시간 동안).
   참고: 단계 3.1, 3.2, 3.4 및 3.6에서 차단, 투과화, 항체 인큐베이션 및 DAPI 염색을 위해, 샘플을 4°C에서 정상 상태로 두고, 교반이 필요하지 않다. 염색된 조직은 4°C에서 세척액으로 완전히 덮고 보존할 수 있었고 컨포칼 현미경에서 이미징될 때까지 며칠 동안 빛으로부터 보호될 수 있었습니다.

4. 컨포칼 현미경

1. 플렉시 유리 링을 준비하고 플라스틱으로 채 웁니다 (그림 1). 플라스틱의 중앙에는 심장을 적재하기 위해 중앙에 작은 홈이 형성됩니다. 평평한 이미징 평면을 획득하고 공간을 조정하고 4.4단계에서 샘플과 커버슬립 사이의 기포를 피하기 위해 얕은 홈을 만드십시오.
2. SAN과 AVN의 이미징에 동일한 심장 샘플을 순차적으로 사용합니다. SAN 영상의 경우 심장에 직접 부하를 가하는 반면 AVN 영상의 경우 전에 미세 해부를 수행하십시오.
   1. SAN 이미징
      1. 해부학 적 랜드 마크로 SAN을 식별하십시오 : 그것은 기병 간 영역 (상대 정맥과 하대 정맥 사이의 영역) 내에서 심장의 등쪽에 위치합니다. 크리스타 터미널리스 (CT)는 SAN과 RAA 사이의 근육 줄무늬입니다.
      2. 심장의 뒷면이 위를 향하도록 하여 심장을 플라스틱 홈에 넣습니다. 심장이 PBS로 완전히 덮일 때까지 PBS를 심장에 추가하여 구멍 내의 모든 공기를 대체합니다(일반적으로 PBS 몇 방울이면 충분합니다).
      3. 해부 현미경으로 RAA, LAA 및 좌심실의 나머지 부분을 플라스틱으로 부드럽게 눌러 심장을 고정시킵니다. 전체 기병 간 영역과 크리스타 터미널이 명확하게 보일 수 있는지 확인하십시오 (플라스틱으로 덮여 있지 않음). 이미징 될 영역은 그림 3A에 나와 있습니다.
   2. AVN 이미징
      1. SAN의 이미징을 완료한 후 동일한 샘플을 회수한 후 AVN 이미징에 사용합니다. AVN 미세 해부의 경우 심장 = 해부 현미경 아래의 해부 접시에 놓습니다.
      2. 오른쪽이 위를 향하도록 심장의 방향을 잡습니다 (우심실의 나머지 부분 포함). LV 자유 벽의 나머지 부분 (현재 하단에 있음)에 핀을 넣어 조직을 고정시킵니다 (그림 2B).
      3. 나머지 RV 자유 벽을 삼첨판 막과 상대 정맥을 통해 위쪽으로 자릅니다. 그런 다음 RV와 RA를 뒤집어 심실 및 심방 중격을 노출시킵니다. (그림 3B)
         알림: 관상 동맥 부비동 (CS)은 AVN을 국소화 할 수있는 Koch의 삼각형을 찾는 중요한 해부학 적 랜드 마크이므로 손상되지 않도록주의하십시오. CS는 심장 뒤쪽의 좌측 방실 홈에서 횡 방향으로 움직이며 CS 구멍 개구부는 심방 중격의 하부에있는 IVC와 삼첨판 사이에 위치합니다 (그림 3A 및 B).
      4. 우심방의 심내막 표면에서 찾을 수있는 Koch의 삼각형을 확인하고, 삼첨판 막 (TV)의 중격 전단지의 힌지 라인에 의해 앞쪽으로, Todaro의 힘줄에 의해 뒤쪽으로 경계를 이룹니다. 기저부는 관상 동맥의 구멍에 의해 형성됩니다 (그림 3B). AVN 이미징의 대상 영역이므로 명확하게 표시되어야 합니다.
      5. Koch의 삼각형이 명확하게 노출된 상태에서 Plexiglas 링 내의 플라스틱 홈으로 심장을 옮깁니다(즉, 플라스틱으로 덮여 있지 않음). Koch 삼각형 주변의 조직을 플라스틱으로 부드럽게 눌러 샘플을 고정합니다. 심장이 PBS로 완전히 덮일 때까지 PBS를 심장에 추가하여 구멍 내의 모든 공기를 대체합니다(일반적으로 PBS 몇 방울이면 충분합니다).
3. 플렉시 글라스 링의 가장자리에 실리콘을 바르면 플라스틱으로 채워진 플렉시 글라스 링 내에로드 된 하트를 커버 슬립으로 덮을 수 있습니다.
4. 플라스틱의 뒷면을 부드럽게 눌러 PBS의 일부를 짜내고 이미징 영역 내의 기포를 피하면서 커버슬립에 하트를 부착합니다.
   알림: 플라스틱의 뒷면을 누르는 동안 관심 영역이 접히거나 덮이지 않았는지 확인하십시오. 샘플 과압축이 없는 평평한 이미징 평면은 해부학을 보존하고 샘플의 적절한 컨포칼 이미징에 필요합니다. SAN의 경우 기병 간 영역이 명확하게 노출되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. AVN의 경우 Koch의 삼각형이 완전히 노출되어야합니다.
5. 전체 마운트 염색 샘플을 컨포칼 현미경의 플랫폼에 거꾸로 놓습니다. 커버 슬립에 부착된 노출된 SAN/AVN은 이제 현미경 플랫폼의 바닥에 있습니다(그림 4).
   참고: 이미지를 촬영하기 위해 에어리스캔 유닛이 장착된 칼자이스 LSM800과 소프트웨어 ZEN 2.3 SP1 검정색을 사용합니다.
6. Alexa Fluor 647 접합 항 HCN4의 여기를 위해 플레이트 "BP420-480 + LP605"를 선택하십시오. 마스터 게인을 650-750으로 변경합니다.
7. 타일 스캔 기능을 사용하여 전체 SAN 및 AVN 영역의 개요 이미지를 촬영합니다. 그런 다음 스캔할 관심 영역 주변의 개요 이미지에 사각형을 클릭하고 추가하여 HCN4 포지티브 영역을 선택합니다.
8. 컨포칼 현미경의 나머지 채널(Alexa Fluor 488 및 DAPI)에 대한 플레이트 및 마스터 게인을 포함한 파라미터를 확인하고 4.6단계에 설명된 대로 설정합니다.
9. 샘플의 위에서 아래로 초점을 천천히 조정하여 전체 샘플을 미리 보고 Z 스택 범위의 첫 번째 와 마지막 을 설정합니다. 광학 샘플의 두께를 기준으로 Z 스택에 대한 최적 간격을 설정합니다. 20x 대물렌즈를 사용하고 Z 스택의 간격으로 0.8-1μm를 사용합니다.
10. 모든 매개 변수가 올바르게 설정되면 SAN 및 AVN의 전체 영역을 스캔합니다.
11. 소프트웨어(예: Imaris 버전 8.4.2)를 사용하여 이미지의 3D 재구성을 수행합니다.
    1. 이미지 처리 선택 | 기준선 빼기 - 배경 얼룩을 제거합니다.
    2. 선택한 채널 및 처리할 관심 영역에 대한 설정에서 표면 생성을 선택합니다.

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결과

위에서 설명한 프로토콜을 사용하면 SAN과 AVN 모두의 컨포칼 현미경 이미징을 안정적으로 수행할 수 있습니다. HCN4를 표적으로 하는 형광 항체를 사용한 전도 시스템의 특정 염색과 Cx43을 표적으로 하는 형광 항체를 사용한 작동 심근의 염색을 통해 온전한 해부학 내에서 SAN (그림 5, 비디오 1) 및 AVN (그림 6, 비디오 2...

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토론

심장 해부학은 전통적으로 얇은 조직 학적 섹션¹¹을 사용하여 연구되었습니다. 그러나 이러한 방법은 전도 시스템의 3차원 구조를 보존하지 않으므로 2D 정보만 제공합니다. 여기에 설명된 전체 마운트 면역형광 염색 프로토콜을 사용하면 이러한 한계를 극복할 수 있으며 SAN 및 AVN 이미징에 일상적으로 사용할 수 있습니다.

파라핀 임베딩, 절편 및 항원 회수?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia
Isoflurane vaporizer system	Hugo Sachs Elektronik	34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910	Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters
Modified Bain circuit	Hugo Sachs Elektronik	73-4860	Includes an anesthesia mask for mice
Surgical Platform	Kent Scientific	SURGI-M
In vivo instrumentation
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Iris scissors	Fine Science Tools	14084-08
Spring scissors	Fine Science Tools	91500-09
Tissue forceps	Fine Science Tools	11051-10
Tissue pins	Fine Science Tools	26007-01	Could use 27G needles as a substitute
General lab instruments
Orbital shaker	Sunlab	D-8040
Magnetic stirrer	IKA	RH basic
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL	Eppendorf	Z683884-1EA
Microscopes
Dissection stereo- zoom microscope	VWR	10836-004
Laser Scanning Confocal microscope	Zeiss	LSM 800
Software
Imaris 8.4.2	Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 black	Zeiss
General Lab Material
0.2 µm syringe filter	Sartorius	17597
100 mm petri dish	Falcon	351029
27G needle	BD Microlance 3	300635
50 ml Polypropylene conical Tube	Falcon	352070
5ml Syringe	Braun	4606108V
Cover slips	Thermo Scientific	7632160
Eppendorf Tubes	Eppendorf	30121872
Chemicals
0.5 M EDTA	Sigma	20-158	Components of TEA
16% Formaldehyde Solution	Thermo Scientific	28908	use as a 4% solution
Acetic acid	Merck	100063	Components of TEA
Agarose	Biozym	850070
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153-100G
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-094
Normal goat serum	Sigma	NS02L
Sucrose	Sigma	S1888-1kg
Tris-base	Roche	TRIS-RO	Components of TEA
Triton X-100	Sigma	T8787-250ml	Diluted to 1% in PBS
Tween 20	Sigma	P2287-500ml
Drugs
Fentanyl 0.5 mg/10 mL	Braun Melsungen
Isoflurane 1 mL/mL	Cp-pharma	31303
Oxygen 5 L	Linde	2020175	Includes a pressure regulator
Antibodies
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488	Cell Signaling Technology	#4412	diluted to 1:200
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647	Invitrogen	#A-21247	diluted to 1:200
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)	Invitrogen	H3570	diluted to 1:1000
Rabbit Anti-Connexin-43	Sigma	C6219	diluted to 1:200
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5)	Invitrogen	MA3-903	diluted to 1:200
Other
Plexiglass ring			Self-designed and 3D printed
Plasticine	Cernit	49655005
Silikonpasten, Baysilone	VWR	291-1220
Animals
Mouse, C57BL/6	The Jackson Laboratory