만디큘러 뮤린 모델의 치열 교정 치아 운동 중 PDL 콜라겐 섬유의 3D 이미징

요약

우리는 마우스에서 치열 교정 치아 운동을 생성하기위한 프로토콜과 교단없이 치주 인대의 콜라겐 섬유및 혈관의 3D 시각화방법을 제시한다.

초록

치열 교정 치아 운동은 외부 힘의 결과로 연하고 단단한 조직 리모델링을 변경한 복잡한 생물학적 과정입니다. 이러한 복잡한 리모델링 과정을 이해하기 위해서는 3D 컨텍스트 내에서 치아 및 치주 조직을 연구하여 단면 및 조직 동맥을 최소화하는 것이 중요합니다. 마우스 모델은 종종 개발 및 구조 생물학뿐만 아니라 작은 크기, 높은 신진 대사 속도, 유전학 및 취급의 용이성으로 인해 생체 역학에서 활용됩니다. 원칙적으로 이것은 또한 치과 관련 연구를위한 훌륭한 모델을 만듭니다. 그러나, 주요 장애물은 그들의 작은 치아 크기, 특히 어금니입니다. 이 논문은 마우스 하악 형 어어의 치주인 섬유 구성 요소의 3D 이미징을위한 치열 교정 치아 운동을 생성하기위한 단계 프로토콜및 두 가지 방법을 제공하는 것을 목표로합니다. 제시된 첫번째 방법은 신선한 콜라겐 조직의 위상 향상 화상 진찰을 가능하게 하는 마이크로 CT 설치를 기반으로 합니다. 두 번째 방법은 절개없이 뼈를 통해 이미징을 가능하게하고 내인성 형광을 보존하는 에틸 신나메이트를 사용하는 뼈 청산 방법입니다. Flk1같은 기자 마우스와이 클리어링 방법을 결합 -Cre; TdTomato는 PDL과 폐포 뼈에서 3D 혈관을 이미지화 할 수있는 최초의 기회를 제공했습니다.

서문

치열 교정 치아 운동 (OTM)의 기본 기본 생물학적 과정은 뼈 리모델링입니다. 이러한 리모델링 과정의 트리거는 세포외 매트릭스(ECM) 스트레스, 괴사 뿐만 아니라 혈관 파괴 및 형성^1,2,3과같은 치주 인대(PDL)의 구조의 변화에 기인한다. 폐포 뼈 리모델링을 위한 다른 가능한 트리거는 골의 골세포에 의한 강제 감지뿐만 아니라 폐포 뼈 자체의 기계적 변형과 관련이 있습니다. 그러나 OTM에서의 역할은 여전히 완전히^4,5를해명하지 는 않습니다.

OTM 동안 PDL의 구조 기능 관계를 밝히기 위한 많은 연구에도 불구하고 명확한 기능 적 메커니즘은 아직^6,7로정의되지 않았습니다. 이에 대 한 주요 이유는 연조직 (PDL)의 데이터를 검색에 도전 이다 (시멘트와 폐포 뼈). 구조 정보를 수집하는 허용된 메서드는 일반적으로 PDL 구조를 방해하고 수정하는 고정 및 절위를 필요로 합니다. 또한 이러한 메서드의 대부분은 왜곡되지 않더라도 부분 및 지역화된 정보만 제공하는 2D 데이터를 생성합니다. PDL의 구조와 기능이 균일하지 않기 때문에 전체 치아 PDL-뼈 복합체의 그대로 3D 구조를 해결하는 접근 방식이 보증됩니다.

본 백서는 마우스에서 OTM을 생성하는 방법과 시료의 단면 없이 PDL에서 콜라겐 섬유의 3D 시각화를 가능하게 하는 두 가지 방법을 설명한다.

Murine 모델은 의학, 발달 생물학, 약물 전달 및 구조 연구에서 생체 내 실험에 널리 사용됩니다. 그(것)들은 특정 단백질 및 기능을 제거하거나 강화하기 위하여 유전으로 변형될 수 있습니다; 빠르고 반복 가능하며 예측 가능한 개발 제어를 제공합니다. 그들은 또한 때문에 작은 크기⁸이미지에 쉽게 8. 그들의 많은 장점에도 불구 하 고, 치과 연구에서 마우스 모델은 자주 사용 되지 않습니다., 임상 조작 보증 하는 경우에 특히, 주로 작은 크기의 치아 때문에. 쥐^9,10,11,개^12개,13개,돼지^{14개,15,16, 원숭이(17)와} 같은 동물모델은 쥐보다 더 자주 사용된다. 최근 고해상도 이미징 기술이 개발되면서 OTM의 복잡한 프로세스를 해독하기 위해 마우스 모델을 활용하는 장점은 매우 많습니다. 이 논문은 뼈 리모델링을 유발하는 일정한 힘 수준으로 하악에서 어금니치아의 매혹적인 움직임을 생성하는 방법을 제시한다. 설치류에 있는 OTM 실험의 대부분은 하악의 이동성및 혀의 존재가 또 다른 복잡성 수준을 추가하기 때문에, 맥심증에서 행해지됩니다. 그러나 하악은 3D 구조적 무결성이 원할 때 많은 장점이 있습니다. 그것은 쉽게 전체 뼈로 해부 될 수있다; 일부 종에서는 섬유성 심기심을 통해 두 개의 헤미 하악으로 분리 될 수 있습니다. 컴팩트하고 평평하며 부비동 공간이 없는 치아만 들어 있습니다. 대조적으로, 맥슬아는 두개골의 일부이며 다른 장기 및 구조와 밀접하게 관련되어 있으므로 폐포 뼈를 관련 치아와 해부하기 위해 광범위한 단면이 필요합니다.

위상 향상을 가능하게 하는 고해상도 마이크로 CT 내부의 로딩 시스템에 결합된 집 습도 챔버를 사용하여, 앞서 설명한 바와 같이 3D로 신선한 섬유 조직을 시각화하는 방법을 개발하였다^{9,18,19,20,21,22, 23.} 신선한 조직은 동물이 염색이나 고정없이 희생 된 직후 스캔되어 조직 유물과 생체 역학 적 특성의 변경을 줄입니다. 이러한 3D 데이터는 다른 곳에서 설명된 바와 같이 섬유의 분포 및 방향 분석에 활용될 수 있다^19.

여기에 제시된 두 번째 3D 전체 조직 이미징 방법은 단면 없이 뼈를 통해 PDL 섬유의 이미징을 가능하게 하는 하악의 광학 클리어링을 기반으로 한다. 흥미롭게도 뼈 자체의 콜라겐 섬유의 시각화를 가능하게하지만, 이것은 여기에서 논의되지 않습니다. 일반적으로 조직 정리를 위한 두 가지 방법이 있습니다. 첫 번째는 간단한 침지, 과수화 또는 하이드로겔 포함을 통해 1.4보다 큰 굴절률을 가진 수성 용액에 샘플을 침지하는 수성 기반 클리어링입니다. 그러나, 이 방법은 조직의 구조적 보존뿐만 아니라 투명성의 수준에서 제한되므로 조직의 고정이 필요하다. 고투명 샘플을 산출하고 고정이 필요하지 않은 두 번째 방법은 용매 기반 클리어링^{방법(24,25)이다.} 우리는 하악 시료에 대한 에틸-3-페닐프로프-2-에노이트(ethyl cinnamate, ECi)를 기반으로 수정된 용매 계 청산 방법을 생성하였다. 이 방법은 비독성 식품 등급 클리어링 에이전트, 최소한의 조직 수축 및 형광 단백질보존을 사용하는 장점이 있습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH의 지침과 하버드 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (프로토콜 번호 01840)의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 치열 교정 치아 운동

1. 마우스 침대를 생성하려면 쐐기 모양의 45° 각진 헤드레스트가 있는 플랫 플라스틱 플랫폼을 사용하십시오. 헤드레스트는 플라스틱 상자를 절단하여 생성할 수 있습니다.
   1. 플랫폼의 헤드 엔드를 상승하여 헤드레스트와 테이블 평면 사이에 약 30° 각도를 생성합니다. 구부러진 두꺼운 종이 클립(직경 0.036")을 머리 쪽 끝에 부착하여 상부 절개를 잡습니다.
   2. 꼬리 끝에서, 치열 교정 전원 체인을 부착하여 하부 절개를 보유할 수 있는 높은 표면을 생성합니다. 예제 플랫폼의 그림 1을 참조하십시오.
2. 10 mg/kg에서 자일라진의 내관 주사와 케타민 100mg/kg을 사용하여 마우스를 마취1 mL 주사기와 27 게이지 바늘.
3. 마세테화된 마우스를 맞춤형 플랫폼에 놓고 클립 루프의 상부 절개를 연결하여 위턱을 고정합니다. 아래 절개에 매여 있는 치열 교정 파워 체인으로 마우스 아래턱을 엽니다. 미니 대장균 입 리트랙터로 뺨을 후퇴 유지합니다.
4. 5-6배 배율에 도달할 수 있는 수술 현미경 또는 기타 입체 스코프 아래에 플랫폼을 배치합니다.
5. 각막 탈수를 방지하기 위해 마우스 눈에 식염수 50 μL (약 1 방울)을 적용합니다. 20분마다 식염수보충.
6. 알루미늄 와이어(직경 0.08mm) 길이 1cm를 자른다. 미세 수술 바늘 홀더를 사용하여 제 1 과 제 2 어금니 사이의 접촉 점을 울부 짖는 중형 영역에서 목이 쪽에서 와이어를 슬링으로 밀어. 스프링 엔드에 나사로 연결하기 위해 첫 번째 어어 앞에 2mm 프리 엣지를 둡니다.
7. 니켈 티타늄 (NiTi) 코일 조각을 잘라, 길이 약 7 ~ 9 스레드.
   참고: 코일의 탄성 특성은 치열 교정 운동에 일정한 힘을 제공합니다. 코일의 총 훈련되지 않은 길이는 절개와 어금니 사이의 간격보다 짧아야 합니다. 치아에 코일을 고정하려면 양쪽 끝에 2 개의 스레드가 추가로 필요합니다. 알루미늄 와이어는 마이크로 CT 스캔 중에 빔 경화와 같은 스캐닝 아티팩트를 줄이기 위해 선택된다.
8. NiTi 코일 스프링(와이어 직경 0.15mm, 내부 코일 직경 0.9mm; 10g의 힘을 전달함)을 하부 제1 어어와 하부 절개 사이에 삽입합니다. 1.6단계에서 첫 번째 어금니 주위에 삽입된 와이어 합자를 사용하여 코일 스프링의 2실 주위로 와이어를 단단히 비틀어 어금니 측의 코일을 고정시합니다.
9. 균일한 힘 레벨을 보장하려면 첫 번째 어금니와 절개 사이에 정확히 3개의 활성 스레드를 사용합니다. 절개에서 전원 체인을 일시적으로 제거하고 코일을 고정하기 위해 절개 위에 2 ~3개의 비훈련되지 않은 스레드를 반복합니다. 나사수 무료 치지발 여백으로 스레드를 밀어 내다.
10. 코일의 절개 테두리에 흐르는 복합 수지층을 놓고 치과 경화 빛으로 치료하십시오. 수지를 경화한 후 전원 체인을 교체합니다.
11. 동일한 경화 광을 사용하여 NiTi 코일을 20s에 가열합니다. 이것은 NiTi 코일을 조여줄 것입니다. 완성된 배치는 그림 1C를 표시합니다.
12. 콘트라탈측을 그대로 두거나 제1및 제2 어금니 사이에 와이어와 같은 샴을 삽입한다.
13. 마취된 마우스를 가열된 빛 아래에 놓고 회복될 때까지 마우스를 따뜻하게 유지합니다.
14. 마우스를 개별 케이지에 다시 넣고 매일 모니터링합니다. 치열 교정 운동 중에 는 식단 변경이 필요하지 않습니다.
    참고: 한쪽에 있는 OTM 장치는 약간의 불편함을 유발하지만 수유를 손상시키지 않습니다. 그러나, 양쪽에 장치를 삽입하는 것은 불편의 추가 양으로 인해 권장되지 않습니다. 통증의 외부 징후를 보이지 않는 한 진통제는 필요하지 않습니다.

2. 신선한 헤미 하악에 PDL 섬유의 마이크로 CT 스캔

1. 헤미 하악을 장착(그림 2)
   1. 치열 교정 운동의 원하는 기간 후, 자궁 경부 탈구를 통해 마우스를 희생. 하악을 제거하고 헤미 하악으로 분리합니다.
      참고: 시료가 고정되지 않으므로 턱의 해부를 가능한 한 빨리 수행하는 것이 중요하며 30 분 이내에 이상적입니다.
   2. 깨끗한 보풀이 없는 닦아 주변의 연조직을 부드럽게 제거합니다.
   3. 최소 4배 배율의 스테레오 현미경으로 미세 수술 가위와 핀셋을 사용하여 교정 장치를 제거하십시오.
   4. 1.5mL 부피, 마이크로 원심분리기 튜브에 물으로 촉촉해진 보풀이 없는 닦아냅니다.
   5. 포장 가능한 치과 복합 수지를 무대의 샘플 슬롯에 넣은 다음 신선한 헤미 하악을 복합재료에 넣습니다. 장착하기 전에 치과 복합체와 접촉하는 뼈 표면이 연조직과 건조하지 않고 제대로 치료되지 않도록 하십시오.
   6. 첫 번째 어금니가 무대의 중간 홈을 중심으로 될 때까지 헤미 하악의 위치를 조정합니다. 폐색 표면이 수평인지 확인합니다. 포지셔닝에 만족하면 복합체를 치료합니다.
      참고: 추가 소량의 치과 복합재는 헤미 하악의 측면에 배치될 수 있으며/또는 시료 안정화를 돕기 위해 절개 전체에 배치할 수 있습니다.
   7. 샘플 스테이지의 습도 풀 내부에 감쇠된 보풀이 없는 물기를 놓습니다. 첫 번째 어금니의 오클루물 표면에 치과 용 복합체를 놓습니다. 챔버를 닫기 전에 시편 수준에서 엑스레이 경로를 차단하지 않도록 하십시오.
   8. 마이크로 CT에 챔버를 부착합니다. 챔버를 마이크로 CT 샘플 단계로 나사로 나사로 전환하여 이미징 중 의 움직임을 최소화합니다.
   9. 모루 끝이 복합체로 둘러싸여 있지만 힘이 증가하지 않을 때까지 모루를 수직으로 낮추면서 엑스레이를 켜고 2D 이미지를 가져 가라.
   10. 모루가 복합체에 내장되면 x선 소스를 닫습니다. 그런 다음 마이크로 CT 챔버를 열고 투명 플렉시 유리 창을 통해 복합체를 치료합니다.
2. 마이크로 CT 설정
   1. 소스 전압을 40kV로 설정하고 전류를 200 μA로 설정합니다. 10배율 검출기를 사용하여 뷰 프레임 내에 샘플을 배치합니다. 캡처된 이미지에 대해 2의 비닝을 사용합니다.
      참고: PDL은 뼈와 치아보다 밀도가 훨씬 낮기 때문에 PDL을 시각화하려면 더 높은 전력과 노출 시간이 필요합니다. 이 프로토콜은 PDL을 시각화하기 위한 설정을 제공합니다.
   2. 단일 이미지 노출 시간을 25s로 설정합니다. 샘플 스테이지의 회전을 183도 이상의 범위로 설정합니다. 2,500프로젝션에 대한 스캔을 설정합니다. 엑스레이 소스 필터를 사용하지 마십시오, 결과 스캔은 각 측면에 0.76 μm의 복셀 크기를 가지고있다.
   3. 마이크로 CT 지침에 따라 적절한 재건을 위한 참조 스캔을 수집합니다. 총 투영으로 참조 이미지 의 1/3 수를 사용합니다. 백 프로젝션 필터링 알고리즘을 사용하여 추가 비닝 없이 볼륨을 재구성합니다.

3. 클리어링 방법(그림 3)

1. 5 개의 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브를 준비하십시오.
2. 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에서 다음 솔루션 1.4mL을 준비: 인산염 완충식식염수(PBS)의 파라포름데히드(PFA) 4%, 디온화(DI) 물 50% 에탄올(EtOH), DI 수의 70% EtOH, 100% EtOH 2튜브를 준비한다.
   참고: PFA는 샘플 고정에 사용됩니다. ECi 클리어링은 고정되지 않은 샘플에서도 작동합니다. 고정되지 않은 샘플을 지우려면 PFA 단계를 건너뜁니다.
3. 해부 된 헤미 하악을 4 % PFA에 놓습니다. 알루미늄 호일로 덮고 6 시간 동안 실온에서 부드러운 설정에 로커에 배치합니다.
4. 헤미 하악을 50 % EtOH로 이동합니다. 16 시간 동안 빛에서 덮여 로커에 배치합니다.
5. 헤미 하악을 70 % EtOH로 이동합니다. 16 시간 동안 빛에서 덮여 로커에 배치합니다.
6. 헤미 하악을 100 % EtOH로 이동합니다. 16 시간 동안 빛에서 덮여 로커에 배치합니다.
7. 3.6을 반복합니다. 두 번째 100 % EtOH 튜브에서.
8. 유리 또는 폴리 프로필렌 튜브에 ECi의 5 mL을 준비합니다.
   참고: ECi는 폴리스티렌을 녹여주지만 폴리프로필렌은 녹지 않습니다. 또한, 형광 단백질을 가진 조직을 사용하지 않을 경우 시료는 청산 절차 중에 빛에 노출될 수 있다.
9. 헤미 하악을 ECi 튜브로 이동합니다. 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 최소 12시간 동안 부드러운 설정으로 로커에 놓습니다.
   참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 탈수된 시료는 실온에서 ECi에 보관할 수 있습니다. ECi의 동결 또는 융점은 6.5 ~ 8.0 °C이다. 4 °C에 보관하지 마십시오.
10. 헤미 하악은 형광 현미경으로 이미징할 준비가 되어 있습니다.
    참고: 이미징 중에 광학적으로 투명하게 유지하려면 샘플을 ECi에 침지해야 합니다.

결과

이 논문은 어떤 단면없이 PDL 내부의 콜라겐 섬유의 3D 이미징을위한 두 가지 방법뿐만 아니라 OTM을 생산하는 방법을 제시한다. 동물 연구 목적으로 치아의 정렬이 필요하지 않을 때, 모든 루트 수준에서 폐포 뼈의 리모델링을 생성하는 경우 치아 운동은 치열 교정으로 간주됩니다. 신뢰할 수 있는 OTM을 생성하기 위해서는 치아에 적용된 일정한 힘 레벨이 필요합니다. 여기서, 활성화된 형상 기억 Ni...

토론

마우스에서 OTM을 생성하는 것은 크기, 유전학 및 취급 이점으로 인해 매우 원합니다. 하악을 사용하면 조직 해부와 샘플 준비 및 이미징 측면에서 쉽게 취급할 수 있습니다. 여기서 우리는 OTM의 7 일 이내에 뼈 내부의 치아의 번역 운동으로 OTM을 생성하는 방법을 제시했습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 활성화 된 코일은 약 1mm의 움직임에 대한 일정한 힘 수준을 제공하기 때문에, 치아 운동의 전체...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2