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요약

여기에 제시된 미오신 5a를 발현하고 정화하는 절차이며, 체외 형광 현미경 기반 의 앙상블 과 단일 분자를 모두 사용하여 이러한 방법이 비근육 근신 2b의 특성화를 위해 어떻게 수정될 수 있는지에 대한 논의가 뒤따릅니다.

초록

Myosin 단백질 결합 하 고 필라멘트 액 틴 (F-actin)와 상호 작용 하 고 phylogenetic 나무를 통해 유기 체에서 발견 된다. 그들의 구조와 효소 특성은 셀에서 실행하는 특정 기능에 맞게 조정됩니다. Myosin 5a 는 세포에서 멜라노솜과 소포를 수송하기 위해 F-actin을 가공적으로 걷습니다. 반대로, 비근육 미오신 2b는 약 30개의 분자를 포함하는 양극성 필라멘트로 작동합니다. 그것은 근신 분자가 액틴을 결합하고, 파워 스트로크를 부여하고, 주기를 반복하기 전에 해리하기 위해 비동기적으로 작동하는 필라멘트의 중심으로 반대 극성의 F-actin을 이동합니다. 비근육 근신 2b는 다른 비근육 근신 2 동종포형태와 함께 세포 접착, 세포키네시스 및 장력 유지를 포함하는 역할을 합니다. 미신의 메카노케미케는 정제된 단백질을 사용하여 체외 운동성 작용을 수행하여 연구할 수 있습니다. 글라이딩 액틴 필라멘트 분석에서, myosins는 현미경 커버슬립 표면에 묶여 있고 형광으로 표지된 F-actin을 변환합니다, 이는 추적될 수 있습니다. 단일 분자/앙상블 운동성 분석에서, 그러나, F-actin은 F-actin에 형광표지 된 미신 분자의 커버슬립 및 운동에 결합된다. 본 보고서에서, 친화성 크로마토그래피를 이용한 Sf9 세포로부터의 재조합 묘신 5a의 정제가 설명되어 있다. 이 다음, 우리는 두 형광 현미경 기반 분석법을 설명합니다: 글라이딩 액틴 필라멘트 분석및 반전된 운동성 분석. 이러한 분석에서 액틴 전좌 속도 및 단일 분자 실행 길이 및 속도와 같은 매개 변수는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 추출될 수 있다. 이러한 기술은 또한 비근육 근신 2 동종의 단일 필라멘트의 움직임을 연구하기 위해 적용될 수 있으며, 비근육 근신 2b의 맥락에서 본원에 논의된다. 이 워크플로우는 비근육 myosins의 단일 분자 및 앙상블 역학을 연구하는 데 사용할 수 있는 프로토콜 및 정량적 도구 집합을 나타냅니다.

서문

묘신은 아데노신 삼위산염(ATP) 가수분해1에서유래한 에너지를 이용하여 액틴 필라멘트에 힘을 발휘하는 모터 단백질이다. 미신에는 머리, 목 및 꼬리 도메인이 포함되어 있습니다. 헤드 도메인에는 액틴 결합 영역뿐만 아니라 ATP 바인딩 및 가수 분해 사이트가 포함되어 있습니다. 목 도메인은 광 사슬, 칼모둘린 또는 칼모둘린과 같은 단백질2,3에결합하는 IQ 모티브로 구성됩니다. 상기 tail 영역은 두 개의 무거운 사슬의 이압, 화물 분자의 결합, 헤드 도메인과의 자동 억제 작용을 통한 미신의 조절을 포함하되 이에 국한되지 않는 미오신의 각 클래스에 특정한 여러 기능을갖는다.

미오신의 운동 특성은 클래스마다 크게 다릅니다. 이러한 특성 중 일부는 듀티 비율(myosin이 액틴에 바인딩되는 myosin의 기계적 사이클의 일부)과 처리성(분리 전에 트랙에서 여러 단계를 하는 모터의 능력)을 포함한다.4. 미신의 40개 이상의 클래스는 서열 분석5,6,7,8에기초하여 결정되었다. 2급 묘신은 가장 먼저 연구되었기 때문에 "종래"로 분류됩니다. 따라서 다른 모든 묘신 은 "틀에 얽매이지 않는" 것으로 분류됩니다.

미신 5a (M5a)는 클래스 5 묘신이며, 해리하기 전에 액틴을 따라 여러 단계를 취할 수 있음을 의미 가공 모터입니다. 그것은 높은 관세 비율을가지고, 그것은 액틴9,10,11,12,13,14에바인딩 되는 기계적 사이클의 큰 부분을 보낸다는 것을 나타내는. 다른 묘신과 공통적으로, 헤비 체인은 액틴 결합 및 ATP 가수분해 부위를 모두 포함하는 N 단말 모터 도메인을 포함하고 있으며, 레버 암 역할을 하는 넥 영역이 있으며, 에센셜 라이트 체인(ELC)과 칼모둘린(CaM)15에결합하는 6개의 IQ 모티브가 있습니다. 꼬리 영역에는 분자를 분화하는 α-헬리칼 코일, 결합화물을 위한 구형 꼬리 영역이 포함됩니다. 그것의 운동은 멜라노세포와 Purkinje뉴런16,17의폐래 망상에 있는 멜라노좀의 수송에 그것의 관여를 반영합니다. M5a는 프로토 타입화물 운송 모터(18)로간주됩니다.

클래스 2 묘신, 또는 종래의 묘신은, 비근육 myosin 2 (NM2) 등방형, NM2a, 2b 및 2c19이외에 골격, 심장 및 부드러운 근육의 수축을 전력하는 myosins를 포함한다. NM2 동위원소는 모든 세포의 세포질에서 발견되며 사이토카네시스, 접착, 조직 형태 발생 및 세포 이동19,20,21,22에서공유된 역할을 갖는다. 본 논문은 비근육 미오신 2b(NM2b)23의맥락에서 종래의 묘신 프로토콜에 대해 설명한다. NM2b는 M5a에 비해 낮은 관세율을 가지며 M5a의 V최대 치인 ≈18s-124에비해 V최대 0.2 s-1 -123으로 효소적으로 느립니다. 특히 두 개의 헤드가 있는 잘린 NM2b 구문은 actin에서 쉽게 처리하지 않습니다. 오히려, 액틴과의 각 만남은분자(25)의해리에 이어 파워 스트로크를 초래한다.

NM2b에는 두 개의 미신 중형 체인이 포함되어 있으며, 각 체인은 1개의 구형 헤드 도메인, 1개의 레버 암(1개의 ELC 및 하나의 규제 라이트 체인(RLC)을 포함하며, α 백리향 코일 로드/꼬리 도메인, 약 1,100개의 아미노산이 이 두 개의 무거운 사슬을 이산화합니다. NM2b의 효소 활성 및 구조 상태는 RLC23의인산화에 의해 조절된다. ATP 및 생리이온 강점(약 150mMM염)이 있는 NM2b는 두 머리가 비대칭 상호 작용에 참여하고 꼬리가23개소에서 머리 위로 다시 접는 컴팩트한 변형을 채택한다. 이 상태에서, 미신은 actin과 강하게 상호 작용하지 않으며 매우 낮은 효소 활동을 가지고 있습니다. 칼모둘린의존성 미오신 광사슬 키나아제(MLCK) 또는 로-관련 단백질 키나아제에 의한 RLC 인산화시, 분자는 꼬리 부위를 통해 다른 미오신과 연결하여 약 30개의 근신분자(23)의양극성 필라멘트를 형성한다. 앞서 언급한 RLC의 인산화는 또한 NM2b의 액틴 활성화 ATPase 활성을 약 4배26,27,28로증가시키는 것으로 이어진다. 양극성 필라멘트 배열은 양쪽 끝에 많은 미오신 모터를 특징으로하며, 수축 및 장력 유지 보수의 역할에 최적화되어 있으며, 반대극성을 가진 액틴 필라멘트는 서로 비교하여 움직일 수 있습니다23,29. 이에 따라 NM2b는 액틴과 상호작용할 때 모터의 앙상블 역할을 하는 것으로 나타났다. 이 필라멘트 내의 많은 수의 모터를 통해 NM2b 필라멘트가 액틴 필라멘트에서 공정하게 움직일 수 있으므로29개의특징을 나타내는 시험관 내 필라멘트 공정성을 가능하게 합니다.

세포에서 미신의 역할을 이해하는 과정에서 진전이 있었지만, 단백질 수준에서 그들의 개별적인 특성을 이해할 필요가 있다. 간단한 단백질 단백질 상호 작용 수준에서 actomyosin 상호 작용을 이해 하려면, 세포의 내부 보다는, 우리는 표현 하 고 체 외 연구에 사용 하기 위해 재조합 myosins를 정화할 수 있습니다. 그러한 연구의 결과는 궁극적으로 복잡한 세포 과정을 구동 특정 myosins의 생물학적 특성에 대해 mechano생물학자에게12,13,14,25,29를알려줍니다. 전형적으로, 이것은 전체 길이 또는 잘린 미오신 구조에 친화성 태그를 추가하고 친화성 크로마토그래피(29,30,31)를통해 정화함으로써 달성된다. 추가적으로, 생성은 합성 불소호로 단백질 라벨링을 위한 유전으로 응응가능한 형광또는 태그를 포함하도록 설계될 수 있다. 이러한 형광 라벨을 추가함으로써, 단일 분자 이미징 연구는 myosin 역학 및 운동학을 관찰하기 위하여 수행될 수 있습니다.

정제 후, 미신은 여러 가지 방법으로 특징지어질 수 있다. ATPase 활동은 색법 방법으로 측정할 수 있으며, 상이한 조건 하에서 모터의 전반적인 에너지 소비 및 액틴 친화성에 대한 통찰력을제공한다(32). 그것의 운동성의 mechanochemistry에 관하여 배우기 위하여는, 추가 실험이 필요합니다. 이 논문은 정제된 myosin 단백질의 운동특성을 특성화하는 데 사용할 수 있는 두 가지 체외 형광 현미경-현미경 기반 방법을 자세히 설명합니다.

이러한 방법의 첫 번째는 미오신 모터의 앙상블 특성을 정량적으로 연구하고 정제 된 단백질(33)의배치의 품질을 질적으로 연구하는 데 사용할 수있는 글라이딩 액틴 필라멘트 분석입니다. 이 논문은 이 분석법에 대한 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경의 사용에 대해 논의하지만, 이러한 실험은 많은 실험실34에서흔하게 발견되는 디지털 카메라를 탑재한 광야 형광 현미경을 사용하여 효과적으로 수행될 수 있다. 이 분석에서, 미오신 모터의 포화 층은 커버 슬립에 부착된다. 이는 니트로셀룰로오스, 항체, 막, SiO 2-유도표면(예: 트리메틸클로로실레인)을 이용하여 달성될 수있으며,그 중 에서도29,33,35,36,37, 38을이용하여 달성할 수 있다. 형광으로 표지된 액틴 필라멘트는 커버슬립 챔버를 통과하며, 이 챔버는 표면에 부착된 미오신에 결합한다. ATP (및 NM2 의 연구에서 키나아제)를 추가하면 챔버는 표면에 묶인 myosins에 의한 액틴 필라멘트의 전좌를 관찰하도록 이미지화됩니다. 추적 소프트웨어를 사용하여 각 글라이딩 액틴 필라멘트의 속도와 길이를 상호 연관시킬 수 있습니다. 분석 소프트웨어는 또한 주어진 미오신 제제의 품질을 결정하는 데 유용 할 수있는 이동 및 고정 액틴 필라멘트의 수를 측정 할 수 있습니다. 정체된 필라멘트의 비율은 또한 의도적으로 다른 단백질에 actin의 표면 테더링에 의해 변조될 수 있고근신(39)의부하 의존성을 결정하기 위하여 측정될 수 있다. 각 액틴 필라멘트는 다수의 사용 가능한 모터에 의해 추진될 수 있기 때문에, 이 분석법은 매우 재현가능하며, 최종 측정 속도는 시작 묘신 농도의 변경 또는 솔루션에 추가 인자의 존재와 같은 변투로 견고하다. 이는 변성, 온도, 이온 강도, 용액 점도 및 표면 테더에 의해 유도되는 부하의 효과와 같은 상이한 조건하에서 근신 활성을 연구하기 위해 쉽게 수정될 수 있다는 것을 의미한다. ATP 가수분해가 불가능한 강한 결합미오신 "죽은 머리"와 같은 요인이 지연된 액틴 필라멘트를 유발할 수 있지만, 이러한 문제를 완화하고 정확한 측정을 허용하는 여러 가지 방법이 존재합니다. 미신의 운동 특성은 클래스마다 크게 다르며, 사용되는 특정 묘신에 따라 이 분석에서 액틴 필라멘트의 글라이딩 속도는 20nm/s(미신 9)40,41,최대 60,000nm/s(샤라산 미신 11)42미만에서 다를 수 있다.

두 번째 분석법은 글라이딩 액틴 필라멘트분석12의형상을 반전시다. 여기서, 액틴 필라멘트는 표지슬립 표면에 부착되어 M5a 또는 NM2b의 개별 양극성 필라멘트의 단일 분자의 움직임이 시각화된다. 이 분석법은 액틴에 대한 단일 미오신 분자 또는 필라멘트의 실행 길이 및 속도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 커버슬립은 비특이적 결합을 차단하고 비오틴 폴리에틸렌 글리콜(biotin-PEG)과 같은 표면을 동시에 기능화하는 화학 화합물로 코팅됩니다. 수정된 아비딘 유도체의 첨가는 표면을 프라이밍하고 생체개화 액틴이 챔버를 통과하여 챔버의 바닥에 안정적으로 결합된 F-actin층을 초래한다. 마지막으로, 활성 및 형광표 미오신(전형적으로 1-100 nM)은 챔버를 통해 흐르고, 그 후 고정액소필라멘트를 통해 미오신 움직임을 관찰하도록 이미지화된다.

이 양식은 비근육과 근육 myosins 둘 다의 역학을 검토하기 위하여 이용될 수 있는 빠르고 재현가능한 방법을 나타냅니다. 이 보고서는 M5a와 NM2b를 각각 정화하고 특성화하는 절차를 각각 설명합니다. 다음은 두 가지 유형의 분석에서 모션을 성공적으로 캡처하기 위해 수행 될 수있는 일부 myosin 특정 적응에 대한 논의에 선행됩니다.

발현 및 분자 생물학
관심있는 myosin에 대한 cDNA는 M5a-HMM을 표현하는 경우 C 단말플래그 태그 (DYKDDDDK) 또는 N-단말 플래그 태그NM23,43,44, 44,45, 46, 46의전체 길이 분자를 표현하는 경우 인코딩 수정 된 pFastBac1 벡터에 복제되어야합니다. NM2b의 C-단말 플래그 태그는 플래그 친화성 컬럼에 대한 단백질의 선호도가 약화됩니다. 대조적으로, N 단자 플래그 태그 단백질은 일반적으로 FLAG 선호도열(23)에잘 결합한다. N-말단 태그 단백질은 효소 활성, 기계적 활성 및 인산화 의존성조절(23)을유지한다.

이 논문에서는, 마우스 M5a 무거운 메로미신 (HMM)와 같은 구조가 플래그 태그와 myosin 무거운 사슬의 C-종점 사이에 GFP와 같은 구조를 사용하였다. NM2b와 달리 M5a-HMM은 N 또는 C 단말 FLAG 태그로 태그를 성공적으로 지정하고 정제할 수 있으며 두 경우 모두 결과 구성이 활성화됩니다. M5a 헤비 체인은 아미노산 1090에서 잘렸으며 GFP와 M5a47의코일 코일 영역 사이의 3개의 아미노산 링커(GCG)를 함유하고 있다. GFP와 플래그 태그 사이에 추가 링커가 추가되지 않았습니다. M5a-HMM은 칼모둘린과 공동 표현되었다. 전신 인간 NM2b 구조는 ELC 및 RLC와 공동 표현되었다. RLC의 N-termini는 5개의 아미노산 (SGLRS)의 링커를 통해 GFP와 융합되었다. 플래그 태그에 직접 부착된 것은 할로태그였습니다. HaloTag와 미신 헤비 체인의 N-종자 사이에는 두 개의 아미노산 (AS)으로 만든 링커가 있었습니다.

두 myosin 제제는 약 2 x 106 세포/mL의 밀도로 바쿨로바이러스에 감염된 Sf9 세포 배양의 1리터로부터 정제되었다. 각 하위 단위에 대한 baculovirus의 볼륨은 제조업체의 지침에 의해 결정된 바이러스의 감염의 복합성에 의존합니다. M5a의 경우, 세포는 칼모둘린을 위한 2개의 다른 바쿨로바이러스-1, M5a 무거운 사슬을 위해 1개로 공동 감염되었다. NM2b의 경우, 세포는 ELC에 대한 3개의 다른 바이러스-1, RLC용, NM2b 중형 체인에 대해 하나씩 공동 감염되었다. myosins의 다양성으로 작업 하는 실험실에 대 한 (또는 다른 다 복합 단백질), 이 방법은 무거운 빛 사슬의 많은 조합을 허용 하 고 칼모둘린 등 일반적으로 사용 되는 라이트 체인 많은 다른 myosin 무거운 사슬과 공동 변환될 수 있기 때문에 이 접근 은 효율적입니다. 모든 세포 작업은 오염을 피하기 위해 적절한 멸균 기술을 가진 생물 안전 캐비닛에서 완료되었습니다.

M5a와 NM2b의 발현을 위해, 재조합 묘신을 생산하는 Sf9 세포는 원심분리를 통해 2-3일 후 감염 후, 원심분리를 통해 수집하고-80°C에 저장하였다. 세포 펠릿은 2,800 x g에서 30 분 동안 4 °C에서 공동 감염된 Sf9 세포를 원심분리하여 수득하였다. 단백질 정제 과정은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

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프로토콜

1. 단백질 정제

  1. 세포 리시스 및 단백질 추출
    1. 표 1을기반으로 1.5배 추출 버퍼를 준비합니다. 4°C에서 필터를 하고 보관하십시오.
    2. 얼음에 세포 펠릿을 해동 시작합니다. 펠릿이 해동하는 동안 1.2 mM 디티오트리톨(DTT), 5 μg/mL leupeptin, 0.5 μM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF) 및 2개의 프로테아제 억제제 정제를 통해 100mL의 추출 버퍼를 보충하십시오. 얼음을 유지합니다.
    3. 펠릿이 해동되면 세포 배양 10mL당 보충 추출 버퍼 1mL을 추가하십시오. 예를 들어, 세포 펠릿이 세포 배양 500mL로부터 형성된 경우, 펠릿에 50mL의 보충 추출 버퍼를 추가한다.
    4. 얼음 위에 보관하면서 세포 펠릿을 초음파 처리합니다. 각 펠릿에 대해 다음 조건을 사용합니다: 5 s ON, 5 s OFF, 5분, 전원 4-5.
    5. 모든 균질화된 용액을 비커로 수집하고 ATP(0.1M 스톡 솔루션; pH 7.0)를 추가하여 ATP의 최종 농도가 1mM입니다. 차가운 방에서 15 분 동안 저어줍니다. ATP는 활성 미오신을 액틴으로부터 분리하여 다음 원심 분리 단계에서 분리할 수 있도록 합니다. 따라서 ATP 고갈 및 액틴 재구속 가능성을 최소화하기 위해 즉시 다음 단계로 진행하는 것이 필수적입니다.
    6. 4°C에서 1h에 대해 48,000 x g의 리자수리슈 원심분리기. 이 발생 하는 동안, 제조 업체의 지침에 따라 100 mL 인산염 완충 식염수 (PBS)와 안티 플래그 친화성 수지 (세포의 1 L에서 형성 된 펠릿)의 50 % 슬러리의 1-5 mL을 세척하기 시작합니다. 예를 들어, 수지 5mL의 경우, 50% 슬러리의 10mL를 세척한다. 마지막 세척 단계에서는 충분한 부피로 PBS의 1-5mL로 수지를 50 % 슬러리를 만듭니다.
    7. lysate 원심분리에 따라, 1-4 h에 대한 차가운 방에 부드럽게 세척 수지 슬러리와 상류체를 결합합니다. 기다리는 동안 표 1에 설명된 버퍼를 만들고 얼음 위에 보관하십시오.
  2. 플래그 선호도 정화 준비
    1. 원심 분리는 4 °C에서 5 분 동안 500 x g에서 1.7 단계에서 용액을 원심 분리합니다. 수지는 튜브 의 바닥에 포장됩니다. 수지의 방해 없이 상퍼를 제거합니다.
    2. 테이블 1및 원심분리기에서 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 상세한 대로 버퍼 A의 50mL에서 수지를 다시 중단합니다. 수지의 방해 없이 상퍼를 제거합니다.
    3. 테이블 1및 원심분리기에서 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 에 자세히 설명된 대로 버퍼 B의 50mL에서 수지를 다시 중단합니다. 이 단계를 다시 한 번 반복하고 버퍼 B의 20mL에서 수지를 다시 일시 중지합니다. 그런 다음, 수지와 버퍼를 손으로 약 10회 부드럽게 반전시킴으로써 철저히 섞는다.
  3. 단백질 용출 및 농도
    1. 표 1에 설명된 대로 30mL의 용출 버퍼를 만들고 얼음위에 식힙니다.
    2. 차가운 방에 용출 열을 설정합니다. 수지 슬러리를 부드럽게 기둥에 붓습니다. 1-2컬럼 볼륨의 버퍼 B로 컬럼을 바닥에 수지 팩으로 세척하여 수지가 건조하지 않도록 합니다.
    3. 수지를 통해 용출 버퍼의 1mL를 플로우하고 1.5mL 튜브에서 유동을 수집합니다. 12, 1 mL 분획이 수집되는 것을 반복합니다.
    4. 이 시점에서, 질적으로 가장 집중 된48분획을 결정하기 위해 분획에 원유 브래드포드 테스트를 수행 . 96웰 플레이트의 한 줄에 파이펫 60 μL 1x 브래드포드 시약. 분획이 수집될 때 각 분획의 20 μL을 잘 섞습니다. 파란색 색상이 어두워진 경우 더 농축된 분획이 더 많이 표시됩니다.
    5. 50mL 튜브에서, 나머지 용출 버퍼를 컬럼을 통해 부드럽게 배관하여 남은 단백질을 수집하여, 열 흐름의 수지에 결합된 남은 미오신을 방출한다. 이 흐름은 다음 단계에 집중됩니다. 그런 다음 수지재생을 재생하여 재사용하고 제조업체의 지침에 따라 저장되는지 확인합니다.
    6. 가장 농축된 3개의 분획을 풀링하고 50mL 튜브의 흐름을 더욱 집중하고 100,000개의 MWCO 농축 튜브를 사용하여 나머지 1mL 분획을 추가로 농축합니다. 풀링된 샘플을 집중 튜브 및 원심분리기에 750 x g에서 4°C에서 15분 동안 적재하고 모든 용출된 단백질이 약 0.5-1mL의 최종 부피에 집중될 때까지 반복한다.
      참고: 이 모공 크기는 분자량 차단의 수배질량이 있는 myosin 분자의 보존을 허용합니다. 라이트 체인은 최종 제품에 SDS-PAGE 젤 전기 포전을 수행하여 검증된 바와 같이, 농도의이 시간 과정 동안 모터 도메인에 단단히 묶여 남아있다.
  4. 투석 및 플래시 동결
    1. 표 1에설명된 대로 투석 버퍼 2L을 만듭니다. 투석 가방이나 챔버에 샘플을 적재하고 차가운 방에서 밤새 투석을 합니다. 투석 버퍼의 조성은 NM2b 및 M5a에 대해 다릅니다.
      참고: NM2b의 경우, 이 투석 단계의 목적은 낮은 이온 강도 버퍼에서 미신 필라멘트를 형성하는 것이다. 이러한 필라멘트의 퇴적물 다음 추가 정화 단계를 제공하고 시료의 농도를 허용합니다. 따라서 다음 날 투석실에 눈에 보이는 흰색 침전제가 있을 것입니다. 이러한 필라멘트는 원심분리에 의해 수집되고 5.1 단계에서 중합화됩니다. M5a-HMM의 경우, 하룻밤 투석 후, 단백질은 후속 저서에서 사용하기에 충분히 순수할 것이다. 필요한 경우 젤 여과 또는 이온 교환 크로마토그래피와 같은 추가 정화 단계를 수행할 수 있습니다. 투석 후 M5a 복구의 경우 5.2 단계로 이동하십시오.
  5. 투석 후 묘신 회복
    1. NM2b의 경우, 투석 백 또는 챔버 및 원심분리기에서 전체 샘플을 4°C에서 49,000 x g에서 15분 동안 조심스럽게 하역하여 묘신 필라멘트를 수집합니다. 상체를 버리고 저장 버퍼를 표 1에 설명한 대로 펠릿에 점진적으로 추가하여 용해될 때까지 합니다. 부드러운 위아래로 파이펫팅은 펠릿을 용해시키는 데 도움이됩니다. 일반적으로 이것은 튜브 당 500 μL 이상을 필요로하지 않습니다. 펠릿이 높은 이온 강도 저장 버퍼에 완전히 용존되도록 한 후, 추가 원심분리 단계(49,000 x g에서15분)는 필요한 경우 원치 않는 골재를 제거하기 위해 수행될 수 있으며, 이는 뮤신이 이제 중합되지 않고 상내에 남아 있기 때문이다.
    2. M5a-HMM의 경우, 원치 않는 골재가 존재하는 경우 49,000 x g에서 15 분 동안 4 °C에서 투석 챔버 및 원심분리기에서 전체 샘플을 신중하게 수집하십시오. 상수.
  6. 농도 결정 및 플래시 동결
    1. 제품의 농도를 결정하기 위해 파장 260, 280, 290 및 320 nm에서 분광계를 사용하여 흡광도를 측정합니다. 수학식 1을사용하여 mg/mL(cmg/mL)의농도를 계산하며, 여기서 A280은 280 nm에서 흡수를 나타내고 A320은 320 nm에서 흡수를 나타낸다. mg/mL의 결과 농도는 M이 전체 단백질의 분자량인 방정식 2를가진 미오신 분자의 μM으로 변환될 수 있다(중사슬, 광사슬, 형광및 모든 태그 포함).
      cmg/mL =(A280 - A320)/ ε (1)
      μM 분자 = 1000cmg/mL/M(2)
      참고: 희석이 필요한 경우 높은 이온 강도 버퍼에서 수행해야 합니다. 소멸 계수(ε)는 ExPASy와 같은 프로그램으로 단백질의 아미노산 서열을 수입함으로써 결정될 수 있다. M5a-HMM의 일반적인 수율은 약 0.5-1 mL의 1-5 mg/mL 단백질이며 전체 길이NM2b는 0.5-2 mg/mL의 0.5-1 mL이다. 이 논문에 사용된 M5a-HMM의 소멸 계수는 0.671이었다. 이 백서에 사용된 NM2b의 소멸 계수는 0.611이었다.
    2. 정제된 묘신을 두 가지 방법 중 하나에 보관합니다. 10-20 μL 사이의 Aliquot는 중합 연쇄 반응 튜브와 같은 얇은 벽으로 둘러싸인 튜브로 들어가서 튜브를 플래시 동결을 위해 액체 질소 용기에 떨어뜨립니다. 대안적으로, 미오신의 20-25 μL 사이의 직접 파이펫을 액체 질소로 직접 피펫하고 멸균 극저온 튜브에 단백질의 냉동 구슬을 저장한다. 두 경우 모두, 결과 튜브는 향후 사용을 위해 -80°C 또는 액체 질소에 저장될 수 있다.
      참고: 아래에 설명된 두 운동성 소법은 매우 적은 양의 단백질을 필요로 하기 때문에, 설명된 바와 같이 작은 알리코트의 저장은 경제적입니다.

2. 글라이딩 액틴 필라멘트 분석

  1. 커버슬립 준비
    1. 아밀 아세테이트에서 1% 니트로셀룰로오스 용액을 만드세요.
    2. 조직 배양 접시(150 x 25mm)를 얻고 접시 바닥에 원형 필터 용지(직경 125mm)를 추가합니다.
    3. 8번 1.5mm 제곱커버를 랙에 적재하고 200mL의 약 2~5mL로 세척한 후 증류수(dH 2O)를2-5mL로 세척한다. 물로 끝나는 이 세척 단계를 반복하십시오. 그런 다음 여과 된 에어 라인 또는 N2라인을 사용하여 커버립을 완전히 건조시하십시오.
    4. 슬립의 한 가장자리를 따라 1% 니트로셀룰로오스 용액의 커버슬립 1개를 천천히 피펫 10 μL로 가져가라. 그런 다음 매끄러운 동작으로 부드러운 면 200 μL 파이펫 팁의 측면을 사용하여 커버 슬립의 나머지 부분에 걸쳐 얼룩을 묻습니다. 니트로셀룰로오스 가옆으로 티슈 배양 접시에 이 커버슬립을 놓습니다. 나머지 커버립을 반복하고 남은 시약을 준비하는 동안 건조하게 하고 코팅 후 24시간 이내에 커버립을 사용하십시오.
  2. 챔버 준비
    1. 광학 렌즈 용지로 현미경 슬라이드를 닦아 큰 이물질을 청소합니다. 양면 테이프 2장, 길이 약 2cm를 자른다.
    2. 현미경 슬라이드의 긴 가장자리의 중간을 따라 한 조각을 놓습니다. 테이프의 가장자리가 슬라이드의 가장자리와 정렬되는지 확인합니다. 두 번째 테이프를 첫 번째 테이프 아래에 약 2mm 아래에 두 어두 드시고 정렬합니다. 이렇게 하면 약 10μL의 용액을 보유할 수 있는 유량 챔버가 생성됩니다(그림 1참조).
    3. 1부에서 니트로셀룰로오스 코팅 커버립 중 하나를 가져 가라. 니트로셀룰로오스로 코팅된 측면이 테이프와 직접 접촉하는 등 테이프에 커버슬립을 조심스럽게 붙입니다(그림 1참조). 파이펫 팁을 사용하여 슬라이드 테이프 인터페이스를 부드럽게 눌러 커버슬립이 슬라이드에 제대로 부착되었는지 확인합니다. 면도날로 슬라이드 가장자리에 걸려있는 여분의 테이프를 잘라냅니다.
  3. 액틴 준비
    1. 중합화 버퍼(50mM KCl, 2mM MgCl2,1mM DTT, 25mM MOPS(pH 7.0)에서 구형 액틴(G-actin)을 중합하여 20μM F-actin을 하룻밤 사이에 4°C에서 만듭니다.
    2. 연골 완충액에서 5 μM에 F-액틴을 희석시 (20mM MOPS, 5 mM MgCl2,0.1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7.4)). 로다민-팔로이드를 1.2배 이상 과량으로 표시하는 라벨. 얼음 위에 2시간 이상 방치(알루미늄 호일로 덮여 있음). 이것은 얼음에 저장, 최대 1-2 개월 동안 사용할 수 있습니다.
  4. 미오신 5a 글라이딩 액틴 필라멘트 분석 수행
    참고: 이 섹션에서는 미신 5a(HMM) 글라이딩 분석법의 세부 사항이 제공됩니다.
    1. 표 2에 설명된 미신 5a용 액스를 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.
    2. 미신 5a(50-100 nM)의 10μL로 유동 챔버를 통과하고 1분 동안 기다립니다.
    3. 1mM DTT("저염" 버퍼)를 가진 50mM MB에서 1 mg/mL BSA의 10 μL로 플로우합니다. 이 세척을 두 번 더 반복하고 세 번째 세척 후 1 분 동안 기다립니다. 티슈 페이퍼 또는 필터 용지의 모서리를 사용하여 용지 모서리를 유동 챔버 출구에 부드럽게 배치하여 채널을 통해 용액을 심지합니다.
    4. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    5. 토론 섹션에서 설명한 바와 같이 블랙 액틴 용액 10μL(5μM F-actin, 1 μM calmodulin, 1mM MB 50m MB 1m DTT)의 1mM ATP로 플로우하여 "데드 헤드"를 제거합니다.
      1. 파이펫은 챔버에 용액을 도입하기 전에 액틴 필라멘트를 전단하는 1 mL 주사기 및 27 G 바늘로 용액을 피펫합니다. 이 단계를 두 번 더 반복하고 세 번째 후 1 분 동안 기다립니다. 약 20개의 파이펫 팅 이벤트만으로도 충분합니다.
      2. "데드 헤드" 스핀을 수행하려면 500mMMMM의 염 농도에 1mM ATP 및 1 mM MgCl2의 존재시 미오신에 F-액틴의 양을 첨가한다. 그런 다음 4 °C에서 15 분 동안 480,000 x g의 초원심 분리기. 죽은 묘신은 펠릿에있을 것입니다.
    6. 50mM MB50μL로 1mM DTT와 1mM ATP로 플로우하여 무료 액틴 필라멘트의 챔버를 고갈시다.
    7. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하여 ATP의 챔버를 고갈시다.
    8. 50mMMB에서 1mM DTT를 함유한 20nM 로다민 액틴(Rh-Actin) 용액의 10μL로 플로우하고, 커버슬립의 표면에 부착된 묘신 5a에 액틴 필라멘트의 엄격함을 허용하기 위해 1분 정도 기다린다.
    9. 1mM DTT로 50mM MB 10μL로 씻어 표면에 얽매이지 않는 Rh-액틴 필라멘트를 씻어내세요. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    10. 최종 버퍼의 30 μL로 플로우합니다.
    11. 561 nm의 흥분 파장을 사용하여 형광 현미경에 이미지를 기록하여 Rh-Actin을 시각화합니다. 적절한 노출 시간은 총 0.5-1 분 동안 1.4 mW 레이저 전력에서 200 ms입니다.
      참고: 획득 속도가 움직이는 필라멘트의 속도로 적절하게 조정되었는지 확인합니다. 추적 프로그램과 함께 사용하기 위한 데이터를 수집하기 전에 중요한 고려 사항은 수집 프레임 속도입니다. 프레임 간의 하위 픽셀 움직임은 속도의 과대 평가될 것이며 정확한 값을 얻기 위해서는 수백 나노미터의 움직임이 필요합니다. 최적의 획득 속도는 프레임 사이의 최소 한 픽셀 거리에 대한 액틴 글라이딩을 특징으로 합니다. 여기에서 이미징에 사용되는 TIRF 현미경의 경우, 이 임계값은 130 nm로 변환됩니다. 따라서 1 μm/s를 이동할 것으로 예상되는 묘신은 5프레임/s(0.2s 간격)의 속도로 이미지화되어야 하며, 미신은 10nm/s를 주행할 것으로 예상되는 동안 0.05 프레임/s(20s 간격)를 주행할 것으로 예상됩니다. 따라서 필요한 경우 이 단계에서 데이터를 다운샘플링할 수 있습니다(자세한 내용은 토론 참조).
  5. 비근육 미오신 2b 글라이딩 액틴 필라멘트 분석 수행
    참고: 이 섹션에서는 전체 길이의 비근육 미오신 2b 글라이딩 분석법의 세부 사항이 제공됩니다. 비근육 미오신 2b 글라이딩 액틴 필라멘트 분석 프로토콜은 특정 단계에서 미오신 5a 프로토콜과 다릅니다. 이러한 각 단계에 대해 올바른 버퍼가 사용되었는지 확인합니다. 예를 들어, NM2b 분석법은 M5a가 높거나 낮은 염완충제의 커버슬립에 부착될 수 있는 반면, 높은 염분 버퍼로 커버슬립에 묘신의 부착이 필요하다. 또한 M5a 글라이딩 액틴 필라멘트 분석법은 미오신의 농도가 낮을수록 인수 중에 분리되는 액틴 필라멘트의 빈도를 완화합니다.
    1. 표 2에 설명된 대로 NM2b용 솔루션을 준비하고 얼음 위에 보관합니다.
    2. 비근육 미오신 2b(0.2 μM)의 10μL에서 500m 모틸리 버퍼(MB) ("고염" 버퍼) 및 1mM 디티오트레이톨(DTT)의 유동 챔버를 통해 1분 동안 기다린다.
      참고: 높은 염분 완충제는 myosin 필라멘트를 해리하고, 비근육 myosin 2b가 이온 농도 < 150 mMMMMM의 필라멘트로 중합할 수 있기 때문에 표면에 단일 미오신 분자의 부착을 허용한다.
    3. 표 2에설명된 바와 같이 500mMM MB에서 1 mg/mL 소 소 세럼 알부민(BSA)의 10μL로 플로우한다. 이 세척을 두 번 더 반복하고 세 번째 세척 후 1 분 동안 기다립니다. 티슈 페이퍼 또는 필터 용지의 모서리를 사용하여 채널을 통해 용액을 심지하십시오.
    4. 표 2에설명된 대로 500mM MB 10μL로 세척하고 1mM DTT로 세척한다. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    5. 토론 섹션에서 추가로 논의된 바와 같이 표 2에 설명된 바와 같이 검정액용액의 10μL로 플로우하면 "죽은 머리"를 제거합니다. 블랙 액틴 용액에는 라벨이 없는 F-actin 5 μM, 1-10 nM MLCK, 1mM ATP, 0.2 mM CaCl2,1 μM CaM, 1mM DTT가 50mM NaCl 운동 완충제로 포함되어 있어 챔버 표면에 비근육 미오신 2b를 인계한다.
      1. 파이펫은 챔버에 용액을 도입하기 전에 액틴 필라멘트를 전단하는 1 mL 주사기 및 27 G 바늘로 용액을 피펫합니다. 이 단계를 두 번 더 반복하고 세 번째 후 1 분 동안 기다립니다. 약 20개의 파이펫팅 이벤트만으로도 충분합니다.
    6. 50mM MB50μL로 1mM DTT와 1mM ATP로 플로우하여 무료 액틴 필라멘트의 챔버를 고갈시다.
    7. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하여 ATP의 챔버를 고갈시다.
    8. 50mM MB에서 1mM DTT를 함유한 20nM Rh-Actin 용액의 10μL로 플로우하고 커버슬립표면에 부착된 무근육 미오신 2b에 액틴 필라멘트의 엄격한 결합을 허용하도록 1분 정도 기다린다.
    9. 1mM DTT로 50mM MB 10μL로 씻어 표면에 얽매이지 않는 Rh-액틴 필라멘트를 씻어내세요. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    10. 최종 버퍼의 30 μL로 플로우합니다. 비근육 근막의 경우 2b글라이딩 액틴 필라멘트 분석의 경우, 파이널 버퍼에는 칼모둘린, CaCl2및 미신 광 사슬 키나아제도 포함되어 비디오 이미징 중에 비근육 미소신 2b의 완전한 인산화를 제공한다. 0.7% 메틸셀룰로오스는 액틴 필라멘트가 느슨하게 묶여 있거나 표면에 바인딩되지 않은 경우 최종 버퍼에 포함될 수 있습니다. 이 논의 섹션에서 더 자세히 설명합니다.
    11. 561 nm의 흥분 파장을 사용하여 형광 현미경에 이미지를 기록합니다. 적절한 노출 시간은 총 0.5 ~3 분 동안 1.4 mW 레이저 전력에서 200 ms입니다.
      참고: 획득 속도가 움직이는 필라멘트의 속도로 적절하게 조정되었는지 확인합니다. 추적 프로그램과 함께 사용하기 위한 데이터를 수집하기 전에 중요한 고려 사항은 수집 프레임 속도입니다. 프레임 간의 하위 픽셀 움직임은 속도의 과대 평가될 것이며 정확한 값을 얻기 위해서는 수백 나노미터의 움직임이 필요합니다. 최적의 획득 속도는 프레임 사이의 최소 한 픽셀 거리에 대한 액틴 글라이딩을 특징으로 합니다. 여기에서 이미징에 사용되는 TIRF 현미경의 경우, 이 임계값은 130 nm로 변환됩니다. 따라서 1 μm/s를 이동할 것으로 예상되는 묘신은 5프레임/s(0.2s 간격)의 속도로 이미지화되어야 하며, 미신은 10nm/s를 주행할 것으로 예상되는 동안 0.05 프레임/s(20s 간격)를 주행할 것으로 예상됩니다. 따라서 필요한 경우 이 단계에서 데이터를 다운 샘플링할 수 있습니다(자세한 내용은 토론 참조).

3. 단일 분자 TIRF 분석

  1. 커버슬립 준비
    1. 주식 분말을 10 mg 알리쿼트 (1.5 mL 튜브)의 메톡시 페그 실레인 (mPEG) 및 비오틴 - 페그 실레인 (bPEG)의 10 mg 알리쿼트로 나눕니다. 밀봉된 수분이 없는 용기에 -20°C에 보관하고 6개월 이내에 사용하십시오.
    2. 8번 1.5H(고정밀) 두께 22mm 정사각형 커버립을 랙에 적재하고 200mL의 2-5mL로 세척한 다음 증류수 2-5mL로 세척합니다. 물로 끝나는 이 세척 단계를 반복하십시오. 그런 다음 에어 라인 또는 N2를 사용하여 커버립을 완전히 건조시키고 아르곤으로 플라즈마 청소를 3 분 동안 건조시십시오.
    3. 다음 단계를 수행하면서 티슈 컬쳐 접시(100 x 20mm)에 필터 용지(90mm)에 깨끗한 커버립을 놓고 70°C 오븐에 인큐베이션을 입력합니다.
      참고 : 플라즈마 청소는 다른 화학 적 세척 방법으로 대체 할 수있다49.
    4. dH2O로 80% 에탄올 용액을 준비하고 HCl을 사용하여 pH를 2.0으로 조정합니다. 이 중 1mL을 mPEG 의 10 mg 알리쿼트및 1mL에 bPEG의 10 mg 알리쿼트에 추가합니다. 30 초 이상 걸리지 않아야하는 용해 소용돌이.
    5. bPEG 용액의 100 μL을 가지고 80 % 에탄올 (pH 2.0)의 900 μL을 추가합니다. 이 솔루션은 1 mg/mL bPEG. 그런 다음, 두 PEG의 용액을 다음과 같이 만들고, 철저하게 혼합한다.
      1. 10 mg / mL mPEG의 200 μL (최종 농도 : 2 mg / mL).
      2. 1 mg / mL bPEG의 10 μL (최종 농도 : 10 μg / mL).
      3. 80% 에탄올(pH 2.0) 용액의 790 μL.
    6. 커버립을 오븐에서 꺼내. PEG 용액의 100 μL을 각 커버슬립의 중앙에 조심스럽게 분배하여 상단 표면만 젖은지 확인합니다. 그런 다음 전표를 오븐에 다시 넣고 20~30분 동안 배양합니다.
    7. 커버립이 구멍이 뚫리기 시작하면 표면에 작은 원이 표시되어 오븐에서 제거합니다.
    8. 각 커버슬립을 100% 에탄올로 씻고, 에어라인으로 건조하고, 오븐에 다시 놓습니다. 2단계에서 챔버를 만드는 데 필요한 시간 동안만 인큐베이션하십시오.
  2. 챔버 준비
    1. 챔버 만들기에 사용하기 위해 현미경 슬라이드를 청소하십시오. 양면 테이프 2장, 길이 약 2cm를 자른다.
    2. 현미경 슬라이드의 긴 가장자리의 중간을 따라 한 조각을 놓습니다. 테이프의 가장자리가 슬라이드의 가장자리와 정렬되는지 확인합니다. 두 번째 테이프를 첫 번째 테이프 아래에 약 2mm 아래에 두 어두 드시고 정렬합니다.
    3. 오븐에서 기능화 된 커버립 중 하나를 가져 가라 (3.1에서 만든). 못으로 코팅 된 측면이 아래로 향하고 도 1에표시된 것처럼 테이프와 직접 접촉하는 것처럼 조심스럽게 표지 슬립을 테이프에 고정합니다. 파이펫 팁을 사용하여 슬라이드 테이프 인터페이스를 부드럽게 눌러 커버슬립이 슬라이드에 제대로 부착되었는지 확인합니다.
    4. 면도날로 슬라이드 에 걸려있는 여분의 테이프를 잘라냅니다. 이 챔버는 즉시 사용하거나 50mL 튜브에 쌍으로 배치하고 향후 사용을 위해 -80 °C 냉동고에 저장될 수 있습니다. 즉시 보관하거나 표면이 저하되는 것이 중요합니다.
  3. 미오신 5a TIRF 현미경 분석 기
    1. 표 3에 설명된 미신 5a 반전 운동성 분석법을 위한 해결책을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.
    2. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 챔버를 세척하십시오.
    3. 1mM DTT를 가진 50mM MB에서 1 mg/mL BSA의 10 μL에서 유동한다. 이 세척을 두 번 더 반복하고 세 번째 세척 후 1 분 동안 기다립니다. 티슈 페이퍼 또는 필터 용지의 모서리를 사용하여 채널을 통해 용액을 심지하십시오.
    4. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    5. 노이트아비딘 용액의 10μL에서 50mM MB로 1mM DTT를 유동하고 1분 정도 기다립니다.
    6. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    7. 50mMMB에서 1mM DTT를 함유한 바이오티니졸루트 로다민 액틴(bRh-Actin)의 10μL에서 유입되어 1분 정도 기다린다. 이 단계를 위해, 큰 지루한 파이펫 팁을 사용하고 긴 액틴 필라멘트가 표면에 부착 될 수 있도록 형광 액틴 필라멘트의 전단을 최소화하기 위해 위아래로 파이펫팅을 피하십시오 (20-30 μm 이상). 효과적인 대안은 표준 파이펫 팁의 콘을 절단하는 것입니다 (≈1-1.5 mm의 개구부).
    8. 1 mM DTT로 50mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    9. 10 nM 미신 5a를 첨가한 최종 버퍼의 30 μL에서 흐름한 다음 TIRF 이미징 양식에 대한 최적의 초점을 찾은 후 즉시 TIRF 현미경에 로드하고 기록합니다. 100-200 ms 사이의 노출 시간은 액틴 및 GFP 라벨 myosin에 대한 1.4 mW 레이저 전력에서 적절하다. 속도 분석을 위한 적절한 획득 시간은 3분입니다.
  4. 비근육 근시 2b TIRF 현미경 분석 기
    참고: 본 섹션에서는 중합및 인포액필라멘트를 이용한 비근육 미오신 2b TIRF 분석의 세부 사항이 제공됩니다. 관내 비근육 근신-2b를 인광 및 중합에 대한 상세한 프로토콜(섹션 4.1-4.3)이 포함된다.
    1. 정제된 NM2b를 인광하려면 2mM CaCl2,1 μM CaM, 1-10 nM MLCK 및 0.1 mM ATP와 같은 조건으로 10배 키나아제 믹스를 만듭니다. 이는 10mM DTT가 있는 500mM MB의 볼륨으로 가져올 수 있습니다. 1:10의 체적 비율로 미오신에 10x 키나아제 믹스를 추가하고 실온에서 20-30 분 동안 배양 할 수 있습니다. 전형적으로, 이 단계에 대한 미신 농도는 1 μM이다.
    2. 인을 필라멘트로 중합하려면 NM2b의 염농도를 150m M NaCl로 낮춥시다. 이렇게 하려면 dH2O에서 4x MB를 4배 희석하여 소금이 없는 1x 운동완충(1x MB)을 만듭니다. NM2b가 500mM의 염화 완충액으로 동결되었기 때문에 이 1x MB는 염분 농도를 낮추는 데 사용할 수 있다.
    3. 3μL의 재고 NM2b에 대해 1x MB의 7 μL을 추가하여 소금 농도를 150m NaCl로 낮추고 20-30분 동안 얼음에 배양하여 NM2b 필라멘트를 형성합니다.
      참고: NM2b가 인광이 되고 최종 염 농도가 150mM인 한 섹션 4.1-4.3의 순서는 중요하지 않습니다. 30 분-1 h의 순서에 배양은 완전한 인산화 및 중합을위한 충분한 시간을 허용한다.
    4. 표 3에 설명된 비근육 미오신 2b 반전 운동성 분석용 용액을 준비하고 얼음 위에 보관하십시오.
    5. 1mM DTT로 150mM MB의 10 μL로 챔버를 세척합니다.
    6. 1mM DTT로 1mg/mL BSA의 10μL로 플로우하면 이 세척을 2회 더 반복하고 세 번째 세척 후 1분 동안 기다립니다. 티슈 페이퍼 또는 필터 용지의 모서리를 사용하여 채널을 통해 용액을 심지하십시오.
    7. 1mM DTT로 150mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    8. 1mM DTT로 150mM MB의 노이트아비딘 용액의 10μL로 플로우하고 1분 정도 기다립니다.
    9. 1mM DTT로 150mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    10. bRh-액틴의 10 μL로 흐르고 1 분 기다립니다. 이 단계를 위해, 큰 지루한 파이펫 팁을 사용하고 형광 액틴 필라멘트의 전단을 최소화하기 위해 위아래로 파이펫팅을 방지하여 긴 액틴 필라멘트가 표면에 부착 될 수 있는지 확인하십시오 (20-30 μm 이상). 효과적인 대안은 표준 파이펫 팁의 콘을 절단하는 것입니다.
    11. 1mM DTT로 150mM MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    12. 비근육 근근 2b 용액(약 30nM)의 10μL로 흐르고 1분 정도 기다립니다.
    13. 1mM DTT로 150MB의 10 μL로 세척하십시오. 이 세척을 두 번 더 반복하십시오.
    14. 최종 버퍼의 30 μL로 플로우한 다음 TIRF 현미경에 즉시 로드하고 TIRF 이미징 양식에 대한 최적의 초점을 찾은 후 기록합니다. 100-200 ms 사이의 노출 시간은 액틴 및 GFP 라벨 myosin에 대한 1.4 mW 레이저 전력에서 적절하다. 속도 분석을 위한 적절한 획득 시간은 3분입니다.

4. 이미지 분석

  1. 글라이딩 액틴 필라멘트 분석용 이미지 분석
    참고: 자료 목록에 연결된 소프트웨어 및 매뉴얼을 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로그램에는 분석을 위해 TIFF 스택이 필요합니다. 글라이딩 액틴 필라멘트 분석 분석 과정은50과같습니다.
    1. 원시 동영상 스택을 지정된 폴더 구조에 업로드하고 동영상 폴더의 가장 많은 디렉터리를 프로그램에 입력합니다.
      참고: 프로그램은 이 디렉터리 및 하위 디렉터리 전체의 파일을 분석하여 가장 낮은 수준의 디렉터리를 복제로 처리합니다. 복제의 각 그룹에 대한 평균 통계가 생성됩니다. 이 경우, 각 묘신에 대해 하나의 영화가 사용되었다. 새로운 묘신을 특성화하거나 새로운 실험 상태를 조사할 때, 총 3개의 챔버에 대해 챔버당 3개의 현장(FOV)에서 영화를 분석하고 조사 중인 묘신의 세 가지 준비를 위해 이 워크플로우를 반복하는 것이 좋습니다.
    2. 스크립트 "stack2tifs"를 사용하여 사용자 입력 된 프레임 속도와 함께 각 TIFF 스택을 일련의 개별 TIFF 파일 및 해당 메타데이터.txt 각 프레임의 시작 시간을 포함하는 폴더로 변환합니다. TIFF 스택 형식이 아닌 데이터의 경우 먼저 재료 표에나열된 소프트웨어와 같은 소프트웨어를 사용하여 변환을 적용해야 합니다.
      참고: 이 스크립트는 소프트웨어 패키지의 일부입니다. 스크립트의 정보는 여기에서 찾을 수 있습니다: "https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. 획득 하는 동안 픽셀 크기(nm)인 -px 매개 변수를 사용합니다. 이 경우 픽셀 크기는 130nm입니다. 분산 플롯 출력에 대한 축을 배율 조정하기 위해 -xmax 및-ymax 매개 변수를 사용합니다. 이는 가장 긴 플롯된 필라멘트 길이와 최대 플롯 속도(nm/s)에 해당합니다.
      참고: 예상 값이며 데이터가 플롯에 포함되도록 예상보다 높은 값으로 설정할 수 있습니다. 다음 분석을 통해 원시 데이터는 다른 통계 또는 그래프 소프트웨어에서 사용하여 보고 분석을 할 수도 있습니다.
    4. 최소 속도 차단 매개변수인 -minv 매개변수를 사용하여 이동하지 않는 필라멘트를 정의하고 따라서 분석에서 제외할 수 있습니다. NM2b와 같은 느린 myosin의 경우 이 매개 변수는 실제 글라이딩 움직임을 절단하지 않도록 낮음(이 예에서는 5nm/s)이어야 합니다. M5a와 같은 빠른 myosin의 경우 이 매개 변수는 실제 글라이딩 속도 분포를 유지하면서 보다 엄격한 필터를 적용하기 위해 더 높을 수 있습니다(이 예에서 100nm/s).
    5. -pt 컷오프 매개변수를 사용하여 부드러운 움직임을 식별합니다. 각 샘플링 창에 대해 값은 100 x 속도 표준 편차/평균 속도에 해당하는 것으로 계산됩니다. 컷오프보다 값이 높은 트랙은 더 많은 가변 속도를 가지며 추가 분석에서 제외됩니다. 이 예제에서는 33의 컷오프 값이 사용되었습니다. 값이 높은 트랙은 더 많은 가변 속도를 가지며 추가 분석에서 제외됩니다.
    6. -maxd를 사용하여 프레임 간의 최대 허용 연결 거리를 설정합니다. 이것은 nm 단위로 필라멘트의 중심에 의해 이동 계산 된 프레임 - 투 프레임 거리입니다. 산발적인 움직임이나 필라멘트 간의 잘못된 연결을 제외하는 데 유용할 수 있습니다. 여기서 예제에서 매개 변수는 2,000 nm의 기본 값에 남아 있었습니다.
  2. TIRF 현미경 분석법에 대한 이미지 분석
    참고: 구체적으로 나열된 이미징 소프트웨어에 대한 단일 분자 TIRF 분석 분석 프로세스는 재료 테이블 다음과 같습니다.29.
    1. 기록된 현미경 비디오를 소프트웨어의 작업 공간으로 클릭하고 드래그하여51을엽니다. 그런 다음 인수 채널을 분할합니다. 이미지 > 색상 > 분할 채널을클릭합니다.
      참고: 획득 하는 동안 상당한 단계 드리프트의 경우, 이미징 평면에 악기 드리프트를 수정 하기 위해 이미지를 안정화 해야 합니다. 이 경우, Z축 드리프트에 대한 보상은 이 데이터를 얻는 데 사용되는 현미경으로 사용되지 않았으며 Z-focus를 잘 안정화시키는 것이다. 이미지 분석 프로그램의 이미지를 안정화하려면 재료 목록에 연결된 적절한 안정기 플러그인을 설치합니다. 이미지 안정기는 이미지의 오브젝트에 대한 고정 된 위치를 가정하고 이전 프레임의 롤링 평균을 참조로 사용합니다. 따라서 권장 절차는 고정된 위치에 있으므로 레이블이 지정된 actin의 이미지가 포함된 채널로 시작하는 것입니다.
    2. 플러그인을클릭한 다음 이미지 안정기 찾기; 번역을 선택하고 기본 설정을 유지합니다. 로그 변환 계수 옆에 있는 확인란을 선택합니다. 이 로그 단계를 적용하면 계산된 시프트 매개 변수를 다음 단계의 다른 채널에 적용할 수 있습니다. 프로세스가 완료되도록 허용합니다.
    3. 그런 다음, 라벨 이음새가 있는 채널을 열고 이미지 안정기 로그 어플리케이터> 플러그인을 클릭하여 안정화를 적용합니다. 단일 채널에서 더 높은 속도 이미징에 대한 요구 사항으로 인해 동일한 획득 중에 액틴의 이미지를 획득할 수 없는 경우, 드리프트는 바이오틴-PEG 표면에 특이적으로 결합된 바이오티니얼 세피셜 마커 또는 형광과 같은 정적 물체를 포함하는 영역을 선택하여 이미지 스택을 안정화한다. 이 영역은 원래 스택에서 잘라서 안정화한 다음 결과 이동 값을 원래 스택에 적용합니다.
      참고: 실제로, 운동성 실험에서 관찰된 드리프트는 수백 nm/s에서 움직이는 myosins의 움직임에 비해 무시할 수 있지만, 가장 느린 근신의 경우 이것은 중요한 고려 사항이 됩니다.
    4. 그런 다음, 트랙 메이트를 엽니 다, 플러그인을클릭; 그런 다음 드롭다운 메뉴에서 추적을 클릭하고 마지막으로 TrackMate에서 클릭합니다. 이 시점에서, 이미지 분석은 형광및 분석 조건의 매개 변수에 기초하여 최적화될 수 있다. 그러나 이상적인 시작 매개 변수는 다음과 같습니다.
      1. 교정 설정: 모든 기본 값을 유지합니다.
      2. 검출기: LoG 검출기.
      3. 추정 Blob 직경: 0.5-1.0 미크로른.
      4. 임계값: 25-200. (이 검색된 반점이 동영상과 일치하는지 여부를 확인하기 위해 숫자를 선택한 후 미리 보기를 클릭하고 적절하게 조정하여 결정할 수 있습니다.)
      5. 초기 임계값: 설정되지 않았습니다.
      6. 보기: 하이퍼스택 디스플레이.
      7. 반점에 필터를 설정합니다: 설정되지 않음.
      8. 추적기 : 간단한 LAP 추적기.
        참고: 프레임 속도와 근신 속도에 따라 달라지며 서로 다른 입자 간의 원치 않는 연결을 제외하면서 후속 위치를 연결할 수 있을 만큼 커야 합니다.
      9. 최대 거리 연결: 1.0 미크로른.
      10. 최대 간격: 1.0 미크로른.
      11. 간격 닫기 최대 프레임 간격: 1.
      12. 트랙의 필터 설정: 트랙 변위(>0.39~3픽셀 이상 이동하는 반점만 포함), 트랙의 스팟(>3~3개 이상의 트랙만 포함). 최소 속도와 같은 다른 필터는 장시간 정지된 반점을 제외하기 위해 도입될 수 있습니다. 필터링 결과는 트랙의 육안 검사를 통해 확인하여 액틴트랙과 관련된 트랙을 유지하면서 가짜 트랙(즉, 액틴 트랙을 따라 있지 않은 백그라운드의 myosin 움직임)을 제거해야 합니다.
    5. 디스플레이 옵션 화면이 올라오면 관련 출력에 대한 분석을 클릭합니다. 생성된 세 개의 테이블(트랙 통계, 트랙 통계의 링크 및 트랙 통계의 스팟)을 저장합니다. 트랙 통계 표는 새로운 단백질 또는 특정 실험 조건의 효과를 특성화하기 위하여 그 후에 분석될 수 있는 속도 및 변위 데이터를 포함할 것입니다, 예를 들면.

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결과

미오신의 정제는 도2에 도시된 바와 같이 나트륨 도데딜 황산염-폴리아크라이글라미드(SDS-PAGE) 겔-전기포아를 감소시킴으로써 평가될 수 있다. 이 수치는 최종, 투석 후 myosin을 나타내지만, SDS-PAGE는 상체에 손실된 모든 제품을 식별하기 위해 정화 절차의 다양한 단계에서 알리쿼트에서 수행될 수 있다. 묘신 5a HMM은 120-130 kDa 범위에서 밴드를 가지고 있으며, 전체 길이 무근육...

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토론

여기에 제시된 미오신 5a 및 비근육 미오신 2b의 정제 및 체외 특성화를 위한 워크플로우가 있습니다. 이 실험 세트는 정제된 myosin 구조의 메카노케미컬 특성을 빠르고 재현 가능한 방식으로 정량화하는 데 유용합니다. 여기에 표시된 두 개의 myosins는 많은 가능성에서 단지 두 가지 특정 예이지만, 조건과 기술은 대부분의 myosins및 다른 많은 모터 단백질에, 일부 재단과 함께 적용 될 수있다.

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공개

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 말

이 데이터 수집에 사용되는 시약의 준비와 함께 기술 지원을 준 Fang Zhang 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 NHLBI / NIH 교내 연구 프로그램 기금 HL001786J.R.S.에 의해 지원되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL SyringeBD309628
2 M CaCl2 SolutionVWR10128-558
2 M MgCl2 SolutionVWR10128-298
27 Gauge NeedleBecton Dickinson309623
5 M NaCl SolutionKD MedicalRGE-3270
Acetic AcidThermoFisher Scientific984303
Amyl AcetateLadd Research Industries10825
Anti-FLAG M2 Affinity GelMillipore SigmaA2220https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATPMillipore SigmaA7699
Biotinylated G-ActinCytoskeleton, Inc.AB07
Bovine Serum AlbuminMillipore Sigma5470
bPEG-silaneLaysan Bio, IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford Reagent ConcentrateBio-Rad5000006
CalmodulinPMID: 2985564
CatalaseMillipore SigmaC40
Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFMThermoFisher Scientific11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Circular Filter Paper - Gliding AssayMillipore SigmaWHA1001125
Circular Filter Paper - Inverted AssayMillipore SigmaWHA1001090
cOmplete, EDTA-Free Protease Inhibitor TabletsMillipore Sigma5056489001This should be stored at 4 °C. The tablets can be used directly or can be reconstituted as a 25x stock solution by dissolving 1 tablet in 2 mL of distilled water. The resulting solution can be stored at 4 °C for 1-2 weeks or at least 12 weeks at -20 °C. 
Concentrating Tubes (100,000 MWCO)EMD Millipore CorporationUFC910024The MWCO of the tube is not necessarily "one size fits all," as long as the MWCO is less than the total molecular weight of the protein being purified. The NM2b herein was concentrated with a 100,000 MWCO tube and the M5a was concentrated with a 30,000 MWCO tube.
Coomassie Brilliant Blue R-250 DyeThermoFisher Scientific20278
Coverslip RackMillipore SigmaZ688568-1EA
Coverslips: Gliding Acting Filament AssayVWR International48366-227
Coverslips: Inverted Motility AssayAzer ScientificES0107052
Dialysis Tubing (3500 Dalton MCWO)Fischer Scientific08-670-5AThe diameter of the dialysis tube can vary, but the MWCO should be the same. The NM2b used herein was dialyzed in an 18 mm dialysis tube. The tubes can be stored in 20% alcohol solution at 4 °C.
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD0632
Double-Sided TapeOffice Depot909955
DYKDDDDK PeptideGenScriptRP10586This can be dissolved in a buffer containing 0.1 M NaCl, 0.1 mM EGTA, 3 mM NaN3, and 10 mM MOPS (pH 7.2) to a final concentration of 50 mg/mL. This can be stored at -20 °C as 300 µL aliquots. 
EGTAMillipore SigmaE4378
Elution ColumnBio-Rad761-1550These can be reused. To clean, rinse the column with 2-3 column volumes of PBS and distilled water. Chill the column at 4° C before use.
EthanolFischer ScientificA4094
G-actinPMID: 4254541G-actin stock can be stored at 200 μM in liquid N2.
GlucoseMillipore SigmaG8270
Glucose OxidaseMillipore SigmaG2133
Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2.5, 1 LSanta Cruz Biotechnologysc-295018
HaloTagPromegaG100A
HClMillipore Sigma320331
KClFischer ScientificP217-500
Large-Orifice Pipet TipsFischer Scientific02-707-134
Leupeptin Protease InhibitorThermoFisher Scientific78435
Mark12 Unstained Standard LadderThermoFisher ScientificLC5677
MethanolMillipore SigmaMX0482
MethylcelluloseMillipore SigmaM0512
Microscope SlidesFischer Scientific12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100
mPEG-silaneLaysan Bio, IncMPEG-SIL-2000-1g
Myosin Light Chain KinasePMID: 23148220FLAG-tagged MLCK can be purified the same way that the FLAG-tagged myosin was purified herein. 
NaN3Millipore SigmaS8032
NeutrAvidinThermoFisher Scientific31050
NitrocelluloseLadd Research Industries10800
NuPAGE 4 to 12% Bis-Tris Mini Protein Gel, 15-wellThermoFisher ScientificNP0323PK2
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010023
PMSFMillipore Sigma78830PMSF can be made as a 0.1 M stock solution in isopropanol and stored in 4 °C. Isopropanol addition results in crystal precipitation, which can be dissolved by stirring at room temperature. Immediately before use, PMSF can be added dropwise to a rapidly stirring solution to a final concentration of 0.1 mM. 
Razor BladesOffice Depot397492
Rhodamine-PhalloidinThermoFisher ScientificR415Stock can be diluted in 100% methanol to a final concentration of 200 μM.
Sf9 MediaThermoFisher Scientific12658-027This should be stored at 4° C. Its shelf life is 18 months from the date of manufacture.
Tissue Culture Dish - Gliding AssayCorning353025Each tissue culture dish can hold approximately nine coverslips.
Tissue Culture Dish - Inverted AssayCorning353003Each tissue culture dish can hold approximately four coverslips.
Smooth-sided 200 µL Pipette TipsThomas Scientific1158U38
EQUIPMENT
CentrifugeThermoFisher Scientific75006590
MicroscopeNikonModel: Eclipse Ti with H-TIRF system with 100x TIRF Objective (N.A. 1.49)
Microscope CameraAndorModel: iXon DU888 EMCCD camera (1024 x 1024 sensor format)
Microscope Environmental Control BoxTokai HITCustom Thermobox
Microscope Laser UnitNikonLU-n4 four laser unit with solid state lasers for 405nm, 488nm, 561nm,and 640nm
Mid Bench CentrifugeThermoFisher ScientificModel: CR3i
Misonix SonicatorMisonixXL2020
Optima Max-Xp Tabletop UltracentrifugeBeckman Coulter393315
Plasma-CleanerDiener electronic GmbH + Co. KGSystem Type: Zepto
Sonicator Probe (3.2 mm)Qsonica4418
Standard IncubatorBinderModel: 56
Waverly Tube MixerWaverlyTR6E
SOFTWARE
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST (Version 1.01)http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFAST is available for Mac OSX and Linux based systems.
Image Stabilizer Pluginhttps://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMatehttps://imagej.net/TrackMate
Imaging SoftwareNIS Elements (AR package)
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
File:TrackMate-manual.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

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