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요약

준비된 DOX-CL 스캐폴드는 DW에서 손상된 조직의 회복을 위해 필수적인 것으로 간주되는 기계적 강도, 다공성, 수분 흡수, 분해속도, 지속적 방출, 항균, 생체 적합성 및 항염증 성질에서 이상적인 DW 드레싱의 전제 조건을 충족시켰습니다.

초록

당뇨병 의 한 가지 주요 합병증은 당뇨병 상처 (DW)입니다. 당뇨병에 있는 염증의 연장된 단계는 연기된 상처 치유로 이끌어 내는 상해의 추가 단계를 방해합니다. 우리는 독시 사이클린을 선택 (DOX), 선택의 잠재적인 약물로, 그것의 보고 된 항 염증 속성과 함께 그것의 항 균 속성으로 인해. 현재 연구는 DOX로드 콜라겐 치토산 비 교차 연결 (NCL) 및 교차 링크 (CL) 비계 (CL) 비계를 공식화하고 당뇨병 조건에서 치유 능력을 평가하는 것을 목표로합니다. 스캐폴드의 특성화 결과 DOX-CL 스캐폴드는 이상적인 다공성, 낮은 부종 및 분해율, DOX-NCL 스캐폴드에 비해 DOX의 지속적인 방출을 보유하고 있음을 보여줍니다. 시험관 내 연구는 DOX-CL 스캐폴드가 CL 스캐폴드 처리 및 대조군에 비해 생체 적합성 및 향상된 세포 성장이었다는 것을 보여줍니다. 항균 연구는 DOX-CL 스캐폴드가 DW에서 발견되는 가장 흔한 박테리아에 대한 CL 스캐폴드보다 더 효과적이었다는 것을 보여주었습니다. 연쇄토조토신 및 고지방 식이 유도 DW 모델을 사용하여, DOX-CL 스캐폴드 처리군에서 의 상처 수축의 상당히 빠른 속도(p≤0.05) 빠른 속도는 CL 스캐폴드 처리 및 대조군에 비해 관찰되었다. DOX-CL 스캐폴드의 사용은 DW에 대한 지역 치료에 대한 유망한 접근 법으로 입증 될 수 있습니다.

서문

당뇨병 mellitus (DM)는 인슐린을 전달하거나 간단한 설탕의 비정상적인 소화에 그 결과에 반응하는 바디의 실패가 혈당 1의상승을 초래하는 조건입니다. DM의 가장 연속적이고 분쇄 얽힘은 당뇨병 상처 (DW)입니다. DM 환자의 약 25%는 일생 1에서 DW를 구축할 기회가 있습니다. DW의 방해된 치유는 DM의 삼총병증에 인가됩니다: 면역병증, 혈관병증 및 신경병증. DW가 치료되지 않을 때마다 회지 발달이 발생할 수 있으므로 관련 기관 2의제거를 촉구합니다.

환자를 가르치는 등 치료(매일 상처를 검사하고, 상처를 정화하고, 상처에 압력을 가하는 활동, 주기적인 포도당 모니터링 등), 혈당 조절, 상처 탈모, 압력 하역, 의료 절차, 고압 산소 요법 및 고급 치료법은 실제로 3,4에있습니다. 이들 약물의 대부분은 다인자적 병리학적 조건 및 이러한 의약품과 관련된 예기치 않은 비용에 비추어 DW 치료에 필수적인 모든 전제 조건을 해결하지 못한다 5. DW 병인이 다인성임에도 불구하고 부적절한 조직 관리를 가진 지속적인 염증은 DW 5,6에서치유가 지연되는 실제 원인으로 명시된다.

DW에서 염증 및 프로 염증 성 중재자의 증강 수준은 지연 된 상처 치유에대한 책임이 감소 성장 인자 결과2,6. DWs의 부적절한 세포외 매트릭스(ECM) 형성은 형성된 ECM의 급속한 분해에 대한 책임을 받는 매트릭스 메탈로프로틴(MmPs) 레벨의 증가로 인가된다. MmPs에서, Mp-9는 장기간염증및 급속한 ECM 분해7을담당하는 주요 중개자로 보고된다. MMP-9의 높은 수준을 감소시키는 항염증제약물과의 국소치료는 칼골성 항상성, 프레임워크 배열을 재확립하고 DW 8,9의더 나은 치유를 촉구하는 것으로 명시되어 있다.

MMP-9 억제제인 독시사이클린(DOX)은 DW 10,11,12의지속적인 염증을 담당하는 주요 염증 중재자인 MMP-9의 높은 수준을 억제하기 위해 선택되었다. 또한, DOX는 항산화제(반응성 산소 종과 결합할 수 있는 자유 하이드록시 및 페녹스 라디칼을 생성) 13 및 항석포성(카스파제 발현 및 미토콘드리아 안정화 억제) 14가지 활성을 가지고 DW의 치료에 필수적이다. DOX, 콜라겐(COL), 치토산(CS)을 포함하는 프레임워크의 배열이 선택되었다. COL의 선택은 기계적 강도 와 조직 재생을 담당하는 필요한 프레임 워크를 제공하는 데 도움이되는 방법에 따라 달라집니다 15. 한편, CS는 여러 상처 치유 단계와 관련된 글리코아미노글리칸에 구조적으로 동종이다. 또한 CS가 상당한 항균 성질을 가지고 있는 것으로 보고된다 15. 따라서 DOX의 COL/CS 스캐폴드는 장기간 염증을 억제하기 위해 공식화되고, DM 조건에서 성공적인 상처 치유를 위한 매트릭스 형성을 지원한다.

프로토콜

수행 된 모든 동물 절차는 약국의 JSS 대학의 기관 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다, Ooty, 인도.

1. 동결 건조 방법에 의한 DOX 장전다공스 비계 의 준비

  1. 1.2 g의 COL을 100mL의 물(예: 밀리포어)에 넣고 붓기를 위해 따로 둡니다.
  2. 2000rpm에서 밤새 부어오른 COL 분산을 저어 COL의 완전한 용해를 보장합니다.
  3. 1%아세트산의 100mL에서 약 0.8g의 CS를 용해시켜 CS 용액을 준비한다.
  4. 균일한 분산을 보장하기 위해 2000 rpm에서 하룻밤 CS 솔루션을 저어줍니다.
  5. DOX(1% w/v)를 혼합한 다음 CS 용액을 COL 용액에 넣고 30분 동안 저어줍니다.
  6. 모슬린 천을 사용하여 얻은 물리적 혼합물을 걸과하여 미립자 물질을 제거합니다.
  7. -85°C에서 얻은 여과물을 약 24시간 동안 4°C ± 깊은 동결한다.
  8. -85°C에서 72h의 4°C± 깊은 동결 혼합물을 lyophilize.
  9. 추가 분석을 위해 수득된 스캐폴드를 건조기에저장하여 16,17을추가로 분석한다.

2. 비계의 교차 연결

  1. 50mL의 물에 MES(0.488g)를 녹입니다.
  2. MES 버퍼의 20mL에 DOX로드 스캐폴드 50 mg을 30분 동안 담급니다.
  3. 별도의 비커에 0.1264 G의 EDC 및 0.014 G의 NHS와 MES 버퍼19.5 mL을 혼합합니다.
  4. 4h에 대한 버퍼 혼합물에 스캐폴드를 담그고 16을교차연결한다.
  5. 추가 평가를 위해 DOX로드 크로스링크드(CL) 및 교차 연결이 아닌 스캐폴드(NCL)를 저장합니다.

3. 스캐폴드의 특성화

  1. 스캐닝 전자 현미경 검사(SEM)를 이용한 형태학적 검사
    1. SEM(1cm × 1cm × 0.5cm)을 사용하여 형태학적 분석을 위한 스캐폴드를 특성화합니다.
    2. 스캐폴드의 단면과 외부 표면에 골드(~150 Å)의 섬세한 레이어를 더럽힌다.
    3. 5kV와 10kV의 흥분 전압에서 사진 이미지를 캡처합니다.
    4. 샘플을 알루미늄 스텁에 놓고 약 9V의 골드로 둘러싸십시오.
    5. 10kV에서 향상된 해상도로 SEM을 사용하여 스캐폴드를 측정합니다.
  2. 다공성 결정
    1. 액체 변위 방법(에탄올) (18)를사용하여 비계의 다공성을 측정한다.
    2. 아래 공식을 사용하여 비계의 다공성을 계산합니다.
      figure-protocol-1546
      Ww = 비계의 젖은 무게
      Wd = 스캐폴드의 건조 중량
      Wv = 비계의 부피
  3. 수흡수 능력 결정
    1. 스캐폴드의 건조 중량을 측정합니다.
    2. 인산염 완충식염(PBS) pH 7.4에서 24시간 동안 37°C에서 계량 된 비계를 배양한다.
    3. 필터 용지를 사용하여 스캐폴드위에 과도한 PBS를 제거합니다.
    4. 아래 포뮬러(17)를사용하여 수분 흡수 용량을 측정한다.
      figure-protocol-1940
      WS = 수질 흡수비율
      W1= 비계의 젖은 무게
      W0= 스캐폴드의 건조 중량
  4. 스캐폴드 분해
    1. 리소지메를 함유한 pH 7.4의 PBS에서 7일간 37°C에서 스캐폴드(1cm x 1cm)를 배양한다.
    2. 스캐폴드를 세척하여 표면에 부착된 이온을 제거합니다.
    3. 세척 된 비계 17을건조 동결하십시오.
    4. 수식을 사용하여 분해 속도를 계산합니다.
      figure-protocol-2324
      Ww = 스캐폴드의 초기 중량
      WD = 동결 건조 후 비계의 무게
  5. 체외 방출 연구
    1. 투석 자루 방법을 사용하여 스캐폴드에서 DOX의 방출 동작을 결정합니다.
    2. 시뮬레이션 된 상처 유체 (pH 7.4)의 몇 밀리리터에 비계를 분산하고 투석 가방에 전송합니다.
    3. 멤브레인 백의 끝을 단단히 닫고 시뮬레이션 된 상처 유체 용액의 500 mL에 담급하십시오.
    4. 투석 봉이 들어 있는 상처 액액을 200-250 rpm에서 저어줍니다.
    5. 상체 솔루션을 수집하고 명확한 시간 간격으로 동일한 양의 신선한 버퍼 솔루션으로 대체합니다.
    6. 240 nm에서 UV 가시 분광계를 사용하여 상피 용액의 스캐폴드에서 DOX 방출의 백분율을 결정합니다.

4. 체외 항균 연구

  1. 마이크로국물 희석 방법을 이용하여 S. 아우레우스, S. 표피, 대장균, P. 아루기노사에 대한 CL 및 DOX-CL 스캐폴드의 최소 억제 농도(MIC)를 결정한다.
  2. 뮬러-힌튼 국물을 사용하여 세균 배양을 1:1000의 비율로 준비하여 0.5 맥팔랜드 탁도를 얻습니다.
  3. 고혈당을 위한 세균 배양에 D-포도당(800 mg/dL)을 첨가19,20.
  4. DMSO(음의 제어)에서 CL 및 DOX-CL을 용해시키고 용해합니다.
  5. 96웰 플레이트에서 고혈당식 서스펜션(100 μL) 및 테스트 샘플(100 μL 의 비계 용액)을 직렬적으로 희석합니다.
  6. 플레이트를 37°C에서 20-24h에 배양한다.
  7. 600 nm 21의파장에서 흡광도를 기록합니다.

5. 체외 생체 적합성 연구

  1. MTT를 사용하여 준비된 비계의 생체 적합성평가[(3-(4, 5 디메틸 티아졸-2 yl) -2, 5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드)] 분석.
  2. 표준 치수의 비계를 살균하고 24 개의 웰 플레이트에 넣습니다.
  3. 3T3-L1 셀을 24 웰 플레이트에 추가하고 72h에 배양합니다.

6. 생체 동물 연구에서

  1. DM 및 절제 상처의 유도
    1. 2 주 동안 고지방 식단으로 동물을 먹이고 형광완액에서 연쇄상 구균 (50 mg /kg 체중)을 단일 용량으로 관리하여 Wistar albino rats (180-200 g)에 인하여 타입-2 당뇨병을 유도합니다.
    2. 연구를 위해 250 mg/dL의 일정한 혈액 포도당을 가진 동물을 선택하십시오.
    3. 절제 상처의 유도를 위해 선택한 동물을 무작위로 한다.
    4. 디틸 에테르(5mL를 이전에 포화마취챔버에 첨가)를 사용하여 당뇨병 쥐를 마취시키고 발가락 핀치 방법 및 점막 색상을 사용하여 확인한다.
    5. 무균 트리머와 블레이드 (A40)를 사용하여 등쪽 영역 (도르살 흉부, 요추 영역)을 면도합니다.
    6. 면도 부위를 알코올 면봉으로 살균합니다.
    7. 면도 부위에 무균 수술 A40 블레이드를 사용하여 피부(2 x 2cm2cm 및 깊이 1mm)를 소비하여 열린 상처를 만듭니다.
    8. 동물을 3개 그룹(그룹 1-질병통제(대조군), 그룹 2-CL 스캐폴드(위약), 그룹 3-DOX CL 스캐폴드)로 나눕니다.
    9. 수술용 테이프를 사용하여 CL 및 DOX CL 스캐폴드를 부착하고 21일 동안 멸균 거즈로 대조군을 덮는다.
    10. 멸균 OHP 시트의 상처 부위를 추적하고 모든 그룹에 대해 그리드 방법을 사용하여 상처의 백분율 감소를 측정한다.
    11. 아래 공식을 사용하여 백분율 상처 감소를 계산합니다.
      figure-protocol-4552

7. 조직 병리학 연구

  1. 7일, 14일, 21일에 치유된 상처 부위를 분리하여 포르말린 용액(10%)에 보관합니다.
  2. 마이크로토메를 사용하여 조직을 제면하여 6 μm의 두께를 얻습니다.
  3. 헤마톡클린과 에신(17)을사용하여 유리 슬라이드와 스테인에 섹션을 마운트한다.
  4. 디지털 현미경을 사용하여 40배 배율 아래 이미지를 캡처합니다.

8. 하이드록시프린 추정

  1. 평가용으로 0일, 7, 14일, 21일에 치유된 상처 부위를 분리한다.
  2. 레디 G 등, 1996 년 22에의해 설명 된 절차를 사용하여 하이드록시 프린소함량을 추정한다.

9. 엘리사 테스트

  1. 제조업체의 지침에 따라 엘리사 키트를 사용하여 MMP-9 수준을 추정합니다.
  2. 조직 균질화제를 사용하여 21일째에 치유된 상처 부위로부터 조직 샘플을 분리하고 다진다.
  3. 원심분리기 획득된 동형화와 상체를 수집한다.
  4. 분석 버퍼를 사용하여 100 배로 상체를 희석합니다.
  5. 여러 플레이트 판독기를 사용하여 플레이트를 스캔합니다.

10. 통계 분석

  1. 얻은 결과를 평균 ± SD로 나타냅니다.
  2. 그래프 패드 프리즘 v5.01을 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
  3. 분산(ANOVA) 및 던넷의 포스트 호크 테스트를 통해 통계적 유의성을 달성합니다.
  4. p≤0.05의 값을 중요로 고려하십시오.

결과

DOX로드 NCL 및 CL 스캐폴드의 특성화
육안으로NCL과 CL 스캐폴드는 크림색으로 밝혀졌다. 게다가, 두 비계는 물리적으로 검사 할 때 스폰지처럼 나타납니다, 뻣뻣하고 탄성. NCL 및 CL 스캐폴드의 SEM 이미지가 도 1에표시됩니다. 그림에서, 분자 간 연계를 형성하여 교차 연결 후 모공 크기가 감소했다는 것이 분명했다. 또한 NCL과 CL 스캐폴드 다공성은 각각 92.3±4.21?...

토론

이 연구의 주요 목적은 쥐에서 DW 치유에 DOX로드 COL-CS 비계의 효과를 결정하는 것이었습니다. CL과 NCL은 형태학, 붓기 지수, 체외 방출 운동 및 생체 적합성 측면에서 제조 및 평가되었다.

DOX로드 NCL 및 CL 스캐폴드의 특성화
준비된 발판은 상호 연결된 모공과 다공성인 것으로 나타났습니다. 이 상호 연결된 모공은 증식 및 이동을 위해 세포에 산소와 영양소의 적...

공개

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

저자들은 아시쉬 D 와드와니 박사에게 감사드립니다. (조교수 겸 머리, 제약 생명 공학의 학과, 약학의 JSS 대학, Ooty, 인도) 체외 세포 생존 성 연구를 지원하기위한.

저자는 과학 기술학과에 감사드립니다 - 대학과 고등 교육 기관의 과학 기술 인프라 개선을위한 기금 (DST-FIST), 뉴 델리, 우리의 부서를 지원하기위한.

저자는 또한 산주 씨에게 감사를 표합니다. S씨와 스리람 씨. 나루쿨라 M. 팜 학생들이 비디오 촬영에 응원을 하고 있다.

이 연구는 고등 교육 및 연구의 JSS 아카데미에 의해 지원되었다 (JSSAHER).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)Merck Millipore, Mumbai, IndiaE7750
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)Merck Millipore, Mumbai, India137074
3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)Thermo Fisher, Mumbai, IndiaM6494
Deep freezer verticleLabline Instruments, Kochi, India
Dialysis sackMerck Millipore, Mumbai, IndiaD6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da
DoxycyclineSigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, IndiaD9891
Elisa kitR&D SystemsRMP900
Escherichia coli (E. coli)National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, IndiaNCIM 2567
EthanolMerck Millipore, Mumbai, India100983
Lyophilizer-SZ042Sub-Zero lab instruments, Chennai, India
Mechanical Stirrer-RQ-122/DRemi laboratory instruments, Mumbai, India
Medium molecular weight ChitosanSisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India18824
Microtome-RM2135Leica, U.K
Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1)National Centre for Cell Sciences, Pune, India
Multiple plate reader -Inifinte M200 ProTecan Instruments, Switzerland
N-hydroxy succinimide (NHS)Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India130672
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, IndiaNCIM 2036
Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800Hitachi, India
Sodium hydroxide (NaOH) pelletsQualigen fine chemicals, Mumbai, IndiaQ27815
Staphylococcus aureus (S. aureus)National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, IndiaNCIM 5022
Staphylococcus epidermis (S. epidermis)National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, IndiaNCIM 5270
Streptozotocin (STZ)Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India14653
Type-1 rat CollagenSigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, IndiaC7661
Ultraviolet–visible spectroscopy-1700Shimadzu

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