1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

요약

원래 2016년^1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

초록

눈 장애는 전 세계 사람들의 수백만에 영향을 미치지만, 인간 조직의 제한된 가용성은 그들의 연구 연구를 방해합니다. 마우스 모델은 인간 해부학 및 생리학과의 유사성 때문에 안구 질환의 병리생리학을 이해하는 강력한 도구입니다. 변색 및 기능의 변화를 포함하여 망막 색소 상피 (RPE)의 변경은 많은 안구 질환에 의해 공유되는 일반적인 특징입니다. 그러나, 1 차 마우스 RPE 세포의 성공적인 격리 및 배양은 매우 도전적이다. 이 논문은 이전에 페르난데스-고디노 외에 의해 이전에 출판 된 프로토콜의 업데이트 된 시청각 버전입니다. 이 방법은 매우 재현 가능하며 트랜스웰에서 몇 주 동안 유지할 수 있는 매우 편광및 색소화된 RPE 단층의 견고한 배양을 초래합니다. 이 모형은 눈 질병의 근본적인 분자 및 세포 기계장치의 연구 결과에 대한 새로운 도로를 엽니다. 더욱이, 상속된 망막 장애 및 황반 변성 등 충족되지 않은 의학적 필요를 가진 중요한 안과 질환을 치료하는 데 사용할 수 있는 치료 적 접근법을 테스트하는 플랫폼을 제공합니다.

서문

원래 2016년^1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층을 형성하는 마우스 망막 색소 상피(RPE) 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. RPE는 신경 망막과 브루치의 막 사이의 눈에 있는 단층입니다. 이 단층은 단단한 접합에 의해 결합된 높게 편광및 색소상피 세포로 이루어져, 벌집^2를닮은 육각형 모양을 전시합니다. 이러한 명백한 조직학적 단순성에도 불구하고, RPE는 망막과 통상의 시각 주기^2,3,4에중요한 다양한 기능을 수행한다. RPE 단층의 주요 기능은 광수용체의 빛 흡수, 영양 및 재생, 대사 최종 제품의 제거, 혈액 망막 장벽 2,^3의피하 공간 내이온 항상성 제어 및 유지^보수를포함한다. RPE는 또한 눈^{5,6, 7,8,9,10,11에서}면역 계통의 국소 변조에 중요한 역할을 한다. RPE의 변성 및/또는 기능 장애는 망막색소증, 레버 선천성 아마로증, 백색증, 당뇨병 성 망막증 및 황반 변성^{12,13,14,15와}같은 많은 안구 질환에 의해 공유되는 일반적인 특징이다. 불행히도, 인간 조직의 가용성은 제한적입니다. 인간과 그들의 높게 보존된 유전 상동성을 감안할 때, 마우스 모형은 안구 무질서 를 공부하기 위한 적합하고 유용한 공구를 나타냅니다^16,17,18,19. 더욱이, 배양된 1차 RPE 세포의 사용은 이러한 시력 위협^장애에대한 새로운 치료법의 개발을 가속화할 수 있는 유전자 조작 및 약물 검사와 같은 이점을 제공한다^9,11.

마우스 RPE 격리 및 문화권에 사용할 수 있는 기존 방법은 재현적으로 부족하며 충분한 신뢰성으로 생체 내에서 RPE 기능을 재현하지 않습니다. 세포는 배양^13,20에서며칠 이내에 색소 침착, 육각형 모양 및 환피성 전기 저항(TER)을 잃는 경향이 있다. 마우스로부터 이러한 1차 RPE 세포 배양을 확립하는 것은 어려운 과정이기 때문에, 이 최적화된 프로토콜은 쥐와인간의 눈으로부터 RPE 세포를 분리하기 위한 다른 프로토콜에 기초하여^{만들어졌으며,22,23은} 마우스 눈을 해부하고, RPE를 수집하고, 시험관내에서 마우스 RPE 세포를 배양한다.

프로토콜

안과 및 시력 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 성명서의 지침이 뒤따랐습니다.

참고 : 이 방법은 C57BL / 6J, B10을 포함하여 다른 유전 배경의 마우스로 성공을 입증되었습니다. D2-Hc^o H2^d H2-T18 c/oSnJ 및 알비노 마우스는 다양한 연령대에서. 바람직하게는 RPE 세포를 얻기 위해 8 에서 12 주 된 마우스를 사용합니다. 오래된 마우스에서 RPE 세포는 배양에서 더 적게 증식하고 젊은 마우스는 생존 가능한 문화를 가지고 다른 동물에서 눈을 풀링필요 적은 작은 세포를 가지고.

1. 시약 및 멤브레인 삽입 준비

1. 다음 시약을 준비합니다.
   1. HBSS-H−(마그네슘 버퍼 + 10mM HEPES 없이 칼슘없이 HBSS)를 준비하십시오: HBSS-(Ca/Mg 제외) 버퍼의 99mL에 1M HEPES 1mL를 추가하십시오. 최대 4 °C에서 1 개월까지 보관하십시오.
   2. HBSS-H+ 준비 (칼슘과 HBSS, 마그네슘 버퍼 + 10 mM HEPES): HBSS + (Ca / Mg) 버퍼의 99 mL에 1 M HEPES의 1 mL을 추가합니다. 최대 4 °C에서 1 개월까지 보관하십시오.
   3. 히알루로니다제 용액(1 mg/mL)을 준비: 10 mg의 히알루로니다아제10mLHBS-H−를 넣고 10mL 주사기를 사용하여 0.4 μm 멸균 주사기 필터로 필터링합니다. 사용하기 전에 신선하게 준비하고 실온 (RT; 20-25 °C)에서 둡니다.
   4. FBS 솔루션 준비: 20% FBS를 HBSS-H+와 혼합합니다. HBSS-H+의 8mL에 2mL의 FBS를 추가합니다. 사용하기 전에 신선하게 준비하십시오.
   5. RPE 매체 준비: N1 중간 보충 1/100 (v/v), 글루타민 1/100 (v/v), 페니실린-연쇄충진 1/100 (v/v) 및 비필수 아미노산 용액 1/100 (v//v/v), 하이드로코르티손(20 μg/L), 타우린(250 mg/L) 및 트리오도-티로닌(0.013 μg/L) 알파 MEM + 5% FBS 또는 FBS^1,23,24. 원하는 경우 FBS는 열 비활성화될 수 있습니다. 차이점이 관찰되지 않았습니다. RPE 격리를 위해 신선하게 준비하십시오. 세포 배양 유지를 위해 최대 1개월까지 4°C에 보관하십시오.
   6. 트립신-EDTA 준비: 신선한 트립신-EDTA (0.25%)의 작은 일회용 알리쿼트 (~8 mL)를 준비합니다. -20 oC에서 동결하십시오. 각 사용하기 전에 RT에서 해동하십시오. 동결 해동 주기를 피하십시오.
2. 멤브레인 삽입(예: 트랜스웰 인서트)을 준비합니다.
   1. RPE 배지로 6.5mm 멤브레인을 37°C에서 최소 30분 동안, 5%CO 2-증식된 인큐베이터에서 상형화한다. 두 개의 마우스 눈에서 RPE 세포를 시드하는 하나의 멤브레인 삽입을 사용합니다.
   2. 인큐베이션 후 하부 구획의 배지를 PBS의 700 μL로 교체하십시오.
   3. 상단 구획에서 배지를 제거하고 10 μg/mL 마우스 라미닌(PBS)의 100 μL로 멤브레인 인서트를 RT에서 적어도 2시간 동안 코팅합니다(짧은 인큐베이션은 삽입에 세포의 부착불량으로 이어질 수 있음).
   4. TER 측정을 위해 빈으로 사용할 여분의 멤브레인 삽입을 코팅합니다.

2. 마우스 눈의 해부 및 포핵

1. _{CO 2} 질식에 의해 마우스를 안락사시키고 분당 챔버 부피의 30-70%의 충진 속도로 CO_2를 천천히 방출한다.
2. 마우스 눈의 양쪽에 마이크로 포셉의 각진 톱니 모양의 팁을 놓고 부드럽게 눌러 안구(enucleation)를 전파합니다.
3. 안구 주위에 놓인 집게를 닫습니다. 그런 다음 앞뒤로 움직이면서 부드럽게 당겨 안구 근육의 시신경으로 눈 전체를 분리하여 결합 조직이 clera에 부착되지 않도록합니다.
4. 에탄올70%에 에뉴클레오처리된 안구를 헹구고, 6웰 플레이트의 우물에 넣고 3mL의 HBSS-H−를 얼음 위에 놓습니다.
5. 마우스의 두 번째 눈을 제거하기 위해 2.2 ~ 2.4 단계를 반복합니다. 30분 이내에 다음 단계를 진행합니다.
   참고: 경험치가 취득될 때까지 한 번에 두 개의 눈만 방출/해부하는 것이 좋습니다.

3. RPE 컬렉션

참고: 라미나르 플로우 후드에서 멸균 조건에서 다음 단계를 수행합니다. RPE 세포 사멸을 초래할 수 있는 얼음에 대한 확장된 잠복기를 피하기 위해 한 번에 두 개 이상의 눈을 채취하지 마십시오.

1. 해부 스테레오현미경, 듀몬트 #5 집게, 각진 가위를 사용하여, 클era에 상처를 주지 않고 안구에 부착된 모든 결합 조직, 혈액 및 근육을 조심스럽게 청소하십시오. 필요에 따라 HBSS-H−버퍼의 3mL을 정기적으로 변경하여 눈을 신선하고 깨끗하게 유지하고 RPE 배양물의 오염을 피하십시오.
2. 시신경을 손잡이로 사용하여 안구를 잡고 선명한 카본 강철 #11 블레이드로 각막 중앙에 구멍을 뚫습니다.
3. Dumont #5 가위를 사용하여 앞서 언급한 구멍을 통해 각막에 3개의 절개를 만들어 렌즈를 제거할 충분한 공간이 있는지 확인합니다.
4. 시신경을 잡고 렌즈가 완전히 나올 때까지 각진 가위의 베이스로 오라 세라타에 약간의 압력을 가합니다. 잠복하는 동안 신경 망막과 RPE의 분리를 방지하기 위해 홍채 상피를 제자리에 둡니다. HBSS-H 버퍼에 눈을 놓습니다.
5. 두 번째 눈을 해부하기 위해 3.1-3.4 단계를 반복합니다.
6. 5%의 CO 2-aerated 인큐베이터(1.5 mL/웰)에서 45분 동안 37°C에서 12웰 플레이트에서 히알루로니다제 용액에 렌즈없이 눈을 배양하여 RPE로부터 신경망막을 분리한다.
7. 각 눈을 새로운 우물에 놓고 30분 동안 얼음위에 배양하여 1.5mL의 차가운 HBSS-H+ 버퍼를 잘 사용하여 히알루로니다제 활동을 중단하십시오. 45분 이상 인큐베이션을 연장하지 마십시오.
8. 신선한 HBSS-H+ 버퍼로 35mm 배양 접시에 각눈을 세척하고 넣고 8cm 반나스 가위를 사용하여 오라 세라타에 도달할 때까지 원래 절개를 통해 각막을 자른다. 그런 다음 오라 세라타 아래를 잘라 홍채 상피와 각막을 제거합니다.
9. 구부러진 핀셋으로 안컵 가장자리/오라 세라타를 잡고 각진 마이크로포스를 사용하여 신경 망막을 잡아당겨 RPE 층이 절단되지 않도록 합니다. 그런 다음 시신경에 대한 내부 부착물을 잘라냅니다. 일부 RPE 세포가 신경 망막에 부착된 상태로 남아 있으면 잠복 시간을 연장하지만 총 45분이 초과되지 않습니다.
10. 시신경을 자르고 각 안컵을 1.5mL의 신선한 트립신-EDTA를 함유한 다른 12웰 플레이트로 잘 옮길 수 있습니다. 안컵이 열리고 트립신에 완전히 잠긴 상태로 유지되도록 하십시오. 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 45분 동안 안컵을 배양합니다.
11. 트립신 인큐베이션 중에 분리 된 RPE 시트와 함께 각 안컵을 수집하고 잘 당 1.5 mL의 FBS 솔루션을 포함하는 12 웰 플레이트로 옮기십시오. RPE 시트가 트립신 솔루션에 남아 있는 경우 마이크로 파이프를 사용하여 FBS 솔루션으로 우물로 전송합니다.

4. 기본 마우스 RPE 셀의 격리

1. 시신경에 의해 각 안컵을 잡고 RPE 시트의 완전한 분리가 달성 될 때까지 HBSS-H +에서 20 % FBS의 1.5 mL을 포함하는 12 웰 플레이트로 아래로 흔들어.
2. 마이크로 파이프로 RPE 시트와 RPE 클러스터를 수집하고 15mL 튜브에 배치합니다. 문화를 오염시킬 수 있는 조각이나 코로이드의 흰색 조각을 피하십시오. 하나의 튜브에 같은 마우스에서 두 눈을 풀.
3. RT에서 2 분 동안 340 x g의 혼합물을 원심 분리하고 상체를 폐기하십시오.
4. 트립신-EDTA 1mL에서 RPE 펠릿을 부드럽게 재연 (0.25%) 및 37°C에서 수조에서 1분 동안 혼합물을 배양하여 RPE 시트를 단일 세포로 분해한다. 인큐베이션 후 마이크로파이프로 10배 위아래로 부드럽게 파이프를 피우며 파이펫팅 하는 동안 거품 형성을 피하십시오.
5. RT에서 2 분 동안 340 x g에서 트립신과 원심 분리기를 희석하고 비활성화하기 위해 갓 준비 된 RPE 매체 9 mL을 추가하십시오.
6. 마이크로 파이프를 사용하여 5% FBS로 RPE 배지의 150 μL에서 셀 펠릿을 흡인하고 조심스럽게 재중단하여 세포가 균일하게 재일시 중단되고 파이펫팅 하는 동안 거품 형성을 피합니다.
7. 1.2단계에서 라미닌 코팅 멤브레인 인서트를 취하고, 바닥 챔버에서 PBS를 제거하고 RPE 배지의 700 μL을 추가하십시오.
8. 멤브레인 인서트의 상부 챔버에서 라미닌을 제거하고 RPE 셀 서스펜션을 챔버 중앙에 균일하게 분배하여 파이펫팅 하는 동안 거품 형성을 피하십시오.
9. 멤브레인인을 5% CO₂ 인큐베이터에 37°C로 배치하고 24시간 이상 방해받지 않고 둡니다.
10. 24h 후, 대부분의 RPE 세포가 삽입에 부착되고 합류가 적어도 50%(도 1A)인지확인하기 위해 현미경 의 밑에 멤브레인 삽입을 확인하십시오. 처음 72 시간 동안 미디어를 변경하지 않는 것이 중요합니다.

5. 편광 RPE 단층의 배양

1. 세포 부착을 허용하기 위해 RPE 배지를 새로 고치기 전에 적어도 72 시간 동안 배양에서 절연 된 RPE 세포를 유지합니다. 파종시 50% 이상의 세포 합류는 적합한 편광 RPE 단층의 형성을 위한 기본입니다.
2. 세포가 부착된 후 신선하고 미리 따뜻워진 RPE 배지(1.1.5단계)를 사용하여 배양 배지를 일주일에 두 번 변경합니다. 혈청은 첫 번째 72 h 이후 배양 배지에서 제거 될 수 있습니다.
   참고: 배양에서 1주일 후, 세포는 컨플루천, 육각형, 이중 핵, 색소 침착 및 편광(그림1B)이어야하며, 예상되는 세포 수는 6.5mm 트랜스웰 삽입당 약 50,000개의 세포가 되어야 합니다. 배양 2주 후 건강한 세포로 구성된 RPE 단층층이 관찰된다. RPE 배양은 정액 마이크로빌리, 기저 인폴딩 및 단단한 접합(그림1C)을표시합니다.

6. TER 측정

참고: RPE 단층의 우수한 무결성과 편광을 보장하기 위해 배양시 최소 4일 후에 RPE 셀의 TER 측정을 수행합니다.

1. 70% 에탄올로 볼토움미터의 전극을 청소하고 조심스럽게 건조시다.
2. 인큐베이터에서 트랜스웰을 가져 와서 온도 변동으로 인한 변경을 피하기 위해 3 분 이내에 TER 측정을 수행하십시오. TER를 측정하려면 상부 챔버에 화산계의 짧은 전극과 멤브레인 삽입의 하단 챔버에 긴 전극을 담급하십시오. 세포 분리를 방지하기 위해 RPE 단층과의 접촉을 피하십시오.
3. TER를 계산하려면 샘플에서 빈 값(세포 없이 라미닌으로 코팅된 멤브레인 인서트)의 값을 공제합니다. 그런 다음 멤브레인서의 표면적(6.5mm 멤브레인 삽입의 경우 0.33cm^2)에 의해 얻어진 값(ohms)을 곱한다. 제품은 문화권에서 72 h 후 적어도 200 Ω x cm 2이어야한다. TER 값은 2주 후에 400 Ω x cm² 이상으로 측정해야 합니다. TER 값이 낮은 RPE 배양을 폐기합니다.

결과

이 프로토콜은 유전자 변형 마우스^1로부터RPE 세포를 분리하고 배양하는 데 사용되었습니다. 마우스 균주 또는 성별 사이에 는 차이가 관찰되지 않았습니다. 결과는 노인⁹중 시력 상실의 가장 일반적인 원인인 노화 관련 황반 변성과 같은 기전기의 몇 가지 중요한 측면을 이해하는 데 도움이 되었습니다. 이 프로토콜에 따라 분리된 RPE 세포는 파종 후 24시간 멤?...

토론

마우스 RPE 세포 격리 및 배양에 대한 몇 가지 방법이^{1,13,20,22,26,27}이전에 개발되었지만, 페르난데스-고디노의 방법은 주^1,9주동안 배양에서 RPE 세포의 효율적인 성장을 허용하는 멤브레인서트를 처음 사용...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable	BD Biosciences	309604
15 ml centrifuge tube	VWR International	21008-103
50 ml centrifuge tube	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Angled micro forceps	WPI	501727
Bench-top centrifuge	any
CO2 incubator	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope	Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length	WPI	14101
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm	BD Biosciences	353001
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Laminar flow hood	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long	WPI	503216
Non-essential amino acids 100X	Gibco	11140050
N1 Supplement 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Tissue culture treated 12-well plates	Fisher-Scientific	08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell supports 6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size	Fisher-Scientific	6780-2504