유동 하에서 혈관 약물 표적화 연구를 위한 체외 3D 세포 배양 동맥 모델

요약

여기서, 우리는 생리적 흐름하에서 제조된 실제 크기의 3차원 인간 동맥 모델에서 내피 세포에 약물 운반대의 표적 증착을 연구하고 매핑하는 새로운 프로토콜을 제시한다. 제시된 방법은 혈관 시스템 내의 약운반체를 표적으로 하는 새로운 플랫폼역할을 할 수 있다.

초록

올바른 치수와 해부학으로 설계된 인간 동맥의 3차원 (3D) 모델을 사용하면 심혈관 시스템에서 다양한 중요한 과정을 적절하게 모델링 할 수 있습니다. 최근, 여러 생물학적 연구가 인간 동맥의 이러한 3D 모델을 사용하여 수행되었지만 혈관 표적을 연구하기 위해 적용되지 않았습니다. 이 논문은 3D 프린팅 기술을 사용하여 실제 크기의 재구성된 인간 동맥 모델을 제조하고, 인간 내피 세포(EC)와 정렬하고, 생리적 흐름하에서 입자 타겟팅을 연구하는 새로운 방법을 제시합니다. 이러한 모델은 저비용 성분을 사용하여 인체에서 혈관의 생리적 크기와 상태를 복제하는 장점이 있습니다. 이 기술은 연구 하 고 심장 혈관 시스템에서 약물 타겟팅을 이해 하기 위한 새로운 플랫폼 역할을 할 수 있습니다 및 새로운 주 사용 나노 의약품의 디자인을 향상 시킬 수 있습니다. 더욱이, 제시된 접근은 환자 특정 흐름 및 생리적 조건하에서 심혈관 질병을 위한 다른 에이전트의 표적 납품의 연구 결과에 중요한 공구를 제공할 수 있습니다.

서문

최근 인간 동맥^1,2,3,4,5의3D 모델을 활용하여 여러 가지 접근 법이 적용되었습니다. 이러한 모델은 생체 내인체에 있는 다른 동맥의 생리해부학 및 환경을 복제합니다. 그러나, 그(것)들은 주로 세포 생물학 연구 결과에서 이용되었습니다. 내피성으로 입자의 혈관 표적화에 대한 현재 연구는 실리코 전산 시뮬레이션^6,7,8, 체외 미세 유체 모델^9,10,11및 생체 내 동물^{모델(12)에}포함된다. 그들이 제공 한 통찰력에도 불구하고, 이러한 실험 모델은 정확하게 혈액 흐름과 혈역학이 지배적 인 요인을 구성하는 인간의 동맥에서 발생하는 타겟팅 프로세스를 시뮬레이션하는 데 실패했습니다. 예를 들어, 복잡한 재순환 흐름 패턴 및 벽 전단 응력 그라데이션으로 알려진 경동맥 분열에서 죽상 경화성 영역을 표적으로 하는 입자의 연구는^{내피(13),14,15,16에}도달하기 전에 입자가 취한 여행에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 이러한 연구는 생리적 환경, 즉크기, 치수, 해부학 및 유동 프로필을 복제하는 조건하에서 수행해야 합니다.

최근에, 이 연구 그룹은 3D 재구성된 인간 동맥 모델을 제조하여^{혈관(17)에}입자의 증착 및 표적을 연구하였다. 모델은 인간 혈관의 기하학적 3D 복제본을 기반으로 했으며, 그 후 내부 벽을 줄지어 있는 인간 적인 IC로 배양되었습니다. 또한 생리적 흐름을 생성하는 관류 시스템을 실시하면 모델은 생리적 상태를 정확하게 복제했습니다. 관류 시스템은 폐쇄 및 개방 회로 구성 모두에서 연동 펌프를 사용하여 일정한 유량으로 유체를 퍼퓨즈하도록설계되었습니다(그림 1). 이 시스템은 경동맥 모델 내부에 시드된 셀에 파티클 증착 및 타겟팅을 매핑하는 폐쇄 회로로 사용할 수 있습니다. 또한, 실험의 끝에서 비부착 입자를 세척하고 시스템을 청소하고 유지하기 위해 개방 회로로 사용될 수 있다. 이 백서는 인간 경동맥 분기의 3D 모델 제조, 관류 시스템의 설계 및 모델 내부의 표적 입자의 증착 매핑을 위한 프로토콜을 제시합니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜은 경동맥의 3D 모델의 제조를 설명하고 기하학적 매개 변수를 수정하기만 하면 관심 있는 다른 동맥을 생성하기 위해 적용할 수 있습니다.

1. 인간 경동맥 모델의 3D 분기의 설계 및 제조

1. 환자 또는 이전에 연구된 인간 경동맥 분기의 형상에서 이미지를 선택하고 인쇄해야 하는 금형의 컴퓨터 지원 설계 모델을 만듭니다.
   참고: 경동맥 분비화에는 하나의 입구와 2개의 콘센트가 있습니다. 동맥 주위의 3D 금형 프레임을 설계하고 프레임과 동맥 금형(도2A-C)사이에 임시 인쇄 지지체를 설계하는 것이 중요합니다.
2. 3D 프린터를 사용하여 형상을 인쇄합니다. 임시 인쇄 지지대를 자르고 사포를 사용하여 금형을 연마하고 매끄럽게 합니다. 이소프로필 알코올로 샌드 모델을 헹구고 플라스틱 먼지를 제거하고 2-3 시간 동안 화학 후드에서 완전히 건조할 수 있습니다.
   참고 : 여기에 인쇄 된 금형은 명확한 수지 v4(그림 2D,E)로만들어졌습니다.
3. 플라스틱을 쉽게 녹여화학 후드 내부에 투명 한 옻칠으로 금형을 스프레이하고 1 시간 동안 공기 건조를 허용합니다. 이 3x를 반복합니다.
   참고 : 여기에 2X 울트라 커버 클리어 스프레이가 사용되었지만 나무 옻칠이 아닌 한 다른 종류는 적합해야합니다. 플라스틱이 실리콘과 반응하여 제대로 응고되는 것을 방지할 수 있기 때문에 노출플라스틱이 남아 있지 않은지 확인합니다. 분무 된 표면의 품질은 최종 실리콘 모델의 표면품질을 결정합니다.
4. 금형 프레임과 동일한 치수의 매끄러운 플라스틱의 투명 직사각형 슬라이드 / 스트립을 잘라, 그것은 바닥에 밀봉하고 상단에 열려 있도록, 모든 면과 프레임의 한쪽에서 프레임에 옻칠을 사용하여 접착제. 화학 후드 내부에 페인트 브러시를 사용하여 래커를 바르고 슬라이드가 적어도 24 시간(그림 2F)에완전히 건조되도록하십시오.
5. 실리콘 고무 혼합물을 준비하려면 플라스틱 판에 경화제(질량 비율 1:10)가 있는 액체 실리콘을 추가하고 완전히 혼합되도록 철저히 저어줍니다. 경동맥 모델의 경우 실리콘 54g과 경화제 6g을 추가합니다.
6. 혼합물을 4°C에서 15분간 식힌 다음 모든 기포가 제거될 때까지 진공 건조기에서 분해합니다. 건조기 (열린 면이 위로 향하여)에 금형을 놓고 실리콘 혼합물을 금형에 천천히 붓고 혼합물이 명확해질 때까지 기포를 다시 제거합니다.
7. 금형이 실온에서 하룻밤 동안 실리콘으로 서게하십시오 (가능하면 진공없이 건조기에 둡니다). 혼합물이 완전히 건조되지 않은 경우, 또 다른 몇 시간 동안 60 °C에서 배양.
8. 혼합물이 완전히 건조되면 투명 슬라이드를 제거하고 플라스틱이 완전히 용해 될 때까지 화학 후드에 48 h의 절대 아세톤에 모델을 담그십시오. 나무 막대기로 플라스틱 남은 것을 제거하십시오. 모델 내부에 갇힌 아세톤을 증발시키기 위해 세포 파종 전에 적어도 4일 동안 60°C에서 배양한다.

2. 모델의 세포 배양 및 시드

1. 경동맥 모델에 대한 세 개의 커넥터를 준비합니다: 입구에 대한 커넥터와 콘센트에 대한 두 개의 커넥터(재료 표참조). 생물학적 후드에서 자외선 조사로 모델과 커넥터를 20분 동안 살균합니다.
2. 모델의 4mL100 μg/mL 섬유네틴(1x 인산염 완충식식염, (PBS))으로 37°C또는 4°C에서 하룻밤동안 코팅한다. 5 mL 또는 10 mL 플라스틱 주사기를 사용하여 입구를 통해 모델에 섬유 넥틴 용액을 주입하십시오. 콘센트를 통해 섬유네틴을 제거하고 EC 배지로 모델을 세척합니다.
3. 2.5 × 10⁶ 세포/mL 인간 배빌레정맥 내피 세포(HUVEC, 통로 < 6)를 중단하고, 5 또는 10mL 플라스틱 주사기(도3A)를사용하여 세포 현탁액의 4mL로 모델을 채웁니다. 균일한 파종을 보장하기 위해 48h의 1rpm의 속도로 인큐베이터(37°C) 내부에 회전기 위에 모델을 놓습니다. 모델이 회전기(그림3B)에잘 부착되어 있는지 확인합니다. 생물학적 후드 내부의 24시간 후 배지를 변경하고 인큐베이터 내부의 회전기로 돌아와 24h를 더 한다.
   참고: 24시간 후에, 세포는 씨를 제거하고 현미경을 사용하여 심을 수 있습니다.
4. 회전기에서 모델을 제거하고 10mL 플라스틱 주사기를 사용하여 1x PBS로 세척합니다. 세포를 고치려면 4mL의 파라포름알데히드(PFA)를 화학 후드 내부에 15분 동안 모델로 배양한 다음 PBS로 3배 헹구세요. PBS4mL을 추가하고실험(그림 3C)까지4°C에 저장합니다. 표준 염색프로토콜(예: 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI), 도 3D를사용하여 모델 내부의 세포를 염색합니다.

3. 관류 시스템의 설계

1. 관류 시스템에는 두 개의 입구와 두 개의 콘센트 튜브가 있습니다. 두 개의 입구를 단일 4mm ID 튜브로 병합하고 다시 두 개의 6mm ID 튜브로 병합하여 연동 펌프에 연결합니다. 연골 펌프에서 나오는 6mm ID 튜브 2개를 단일 4mm 튜브로 병합하고 진동 댐퍼에 연결하여 펌프의 진동을 제거합니다. 250mL 의 좁은 입병을 3개의 오리피스 뚜껑을 댐퍼로 사용하십시오.
2. 펌프에서 입구에 하나의 오리피스를 연결하고, 비상 시 압력 배출에 사용되는 코르크로 두 번째 를 닫고, 제 3 오리피스 (콘센트)를 병의 바닥으로 확장합니다.
3. 댐퍼를 콘센트 튜브를 사용하여 배양된 경동맥 모델의 입구에 연결합니다. 모델의 두 콘센트를 하나의 튜브에 병합하면 시스템의 콘센트가 됩니다(모든 튜브는 4mm ID).
4. 콘센트 튜브를 두 개의 콘센트 튜브(폐쇄 회로용및 개방 회로의 폐기물 용기에 대한 다른 튜브)로 분할합니다. 각 튜브에 플라스틱 클램프를 부착합니다.
   참고: 열린/폐쇄 클램프의 조합은 시스템이 닫힌 회로 구성에 있는지 또는 개방회로 구성인지 여부를 결정합니다. 도 1에도시된 바와 같이, b와 c가 열려 있는 동안 a와 d클램프가 닫히면 시스템은 폐쇄 회로입니다. 역으로 인해 시스템이 회로 구성을 엽니다.
5. 3개의 용기를 준비하십시오: 300mL 유체(폐쇄 회로용)와 1L의 다른 두 개의 컨테이너를 각각 보관할 수 있습니다: 하나는 세척용이고 다른 하나는 폐기물(개방형 회로용).

4. 폐쇄 회로 구성 : 관류 실험 및 이미징

1. 300mL의 PBS를 폐쇄 회로 컨테이너에 추가하여 튜브 및 모델을 포함한 전체 시스템을 채우기에 충분합니다. 용기 내부에 입구 튜브 1개와 콘센트 튜브 1개(열린 클램프 b 및 c)를 놓습니다.
2. 1 L 세척 용기를 증류수(실험 종료 시 세척)로 채우고 나머지 1L 폐기물 용기를 비워 둡니다. 다른 입구와 콘센트 튜브(클램프 a 및 d 닫기)를 각각 세척 및 폐기물 용기에 놓습니다.
3. 고정 된 세포 배양 경동맥 모델을 4 °C 저장에서 꺼내 PBS를 비웁채십시오. 3.3-3.4 단계에 설명된 바와 같이 경동맥의 입구와 콘센트를 연결합니다. 모델을 오랫동안 건조시키지 마십시오. 모델이 연결되면 펌프를 활성화하여 유체를 퍼퓨즈합니다.
4. 현미경 아래에 경동맥 모델을 놓습니다. 입구 앞과 경동맥 모델의 출구 후에 튜브를 엽니다. 연동 펌프를 10rpm에 설정하고 켭니다. 4-5분마다 5rpm의 증분 속도를 높입니다. 누출이 없는지 확인합니다.
5. 인간 경동맥(~400mL/min)의 생리파형의 최대 유량과 동일한 100rpm에서 형광카박스폴리스티렌(PS) 입자(2μm, 농도 1.6 μg/mL)를 폐쇄 회로 에서 PBS의 300mL에 추가한다. 관심 영역을 1.5h(필요에 따라 여전히 단일 이미지 또는 비디오)에 대해 10s마다 이미지화합니다.

5. 오픈 서킷 구성 : 세척 단계

1. 1L 용기(클램프 a 및 d)에서 세척 및 폐관의 클램프를 열고 300mL 용기(클램프 b 및 c)에서 입구와 콘센트 튜브의 클램프를 즉시 닫아 시스템을 폐쇄형에서 개방 회로 구성으로 변경합니다.
2. 대부분의 물이 세척 용기에서 100 rpm의 폐기물 용기로 흘러 들어오게하십시오. 완전히 전달되기 전에 연막 펌프에서 멈추고 입구 앞과 경동맥 모델의 출구 후에 튜브 클램프를 닫습니다.
3. 적절한 필터를 사용하여 관심 영역에서 모델의 이미지를 캡처하여 세포에 입자의 증착 및 접착력을 표시합니다. 경동맥 모델의 연결을 끊습니다. 모델의 입구를 통해 10mL 주사기로 PBS 4mL을 신중하게 천천히 추가합니다.
4. 경동맥 모델 대신 세척에만 사용되는 실리콘 고무 3D 경동맥 모델인 "더미 모델"을 연결하고 시스템을 헹구는 다. 1L의 물을 더 넣고 모든 물이 세척 용기에서 폐기물로 옮겨질 때까지 시스템을 다시 세척합니다. 연동 펌프를 끕니다.

6. 데이터 수집 및 분석

1. 사용자 지정된 소프트웨어 코드를 사용하여 실험 중에 촬영한 이미지와 관심 영역에서 파티클 증착의 디지털 동영상을 획득합니다(재료 표참조).
2. 모델을 따라 입자의 증착 매핑을 위해, 타일다임 다중 이미지는 관심의 검사 영역을 커버한다(도4A,B).
   참고: 관심 있는 사이트의 부착된 입자 수를 정량화하기 위해 사용자 정의 소프트웨어 코드를 작성할 수 있습니다(샘플 파일은 보충 정보로제공되었습니다)¹⁷.

결과

이 논문은 실제 크기의 3D 인간 동맥 모델 내부의 입자증착을 매핑하는 새로운 프로토콜을 제시하며, 이는 약물 전달 연구를 위한 새로운 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 3D 프린팅 기술을 사용하여 인간 경동맥 양면 동맥의 모델을 제조하였다(도2). 모델은 실리콘 고무로 만들어졌으며 인간 적인 EC(그림 3)로시드되었습니다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 ?...

토론

입자의 혈관 표적을 연구하는 현재접근은 인체에 존재하는 생리적 조건을 복제하는 데 부족합니다. 여기에 제시된 인간 동맥의 3D 재구성 모델을 조작하여 맞춤형 관류 시스템을 사용하여 적용되는 생리적 흐름하에서 동맥을 감싸는 IC에 입자 타겟팅을 연구하는 프로토콜이 여기에 제시된다. 3D 프린팅용 재료를 선택할 때는 투명 플라스틱 모델로의 안료 전달을 피하기 위해 투명 플라스틱을 사용...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D printer	FormLabs	PKG-F2-REFURB
Acetone, absolute (AR grade)
Connectors	Nordson Medical	FTLL013-1	Female Luer
		FTLL230-1	Female Luer
		FTLL360-1	Female Luer
		LP4-1	Male Luer Integral Lock
Damper	Thermo-Fisher Scientific	DS2127-0250	Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle
Damper Cover	Thermo-Fisher Scientific	2162-0531	Nalgene Filling/Venting Closures
Elastosil Elastosil RT 601 A	Wacker	60003805
Elastosil RT 601 B	Wacker	60003817	The crosslinker
Endothelial Cell Media	ScienCell	1001
Fibrontectin	Sigma Aldrich	F0895-5mg
HUVEC	Lonza	CC-2519
Isopropyl alcohol, AR grade 99.5%			Remove plastic dust from the sanded model
Lacquer	Rust-Oleum		2X-Ultra cover Gloss Clear
Matlab	Mathworks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Microscope	Nikon	SMZ25
Microscope Camera	Nikon	DS-Qi2
Peristaltic pump	Watson Marlow	530U IP31	With 2 pumpheads: 313D
Plastic tube clamp	Quickun	1-2240-stopvalve-2pcs
Polystyrene Particles	Thermo-Fisher Scientific	F8827	Diameter = 2 µm
Printer resin	FormLabs	RS-F2-GPCL-04
Rotator	ELMI Ltd.		Intelli-Mixer RM-2
Solidworks	SolidWorks Corp., Dassault Systèmes		https://www.solidworks.com/
Tubing	Watson Marlow	933.0064.016	Tubing for the pump: 6.4 mm ID
All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID