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요약

이 프로토콜은 형광 기자 및 세포 분류를 사용하여 대식세포 및 T 세포주에서 노크-인 실험을 단순화합니다. 2개의 플라스미드는 면역 세포에 있는 Rosa26 메뚜기에서 영구적으로 통합되는 EBFP2를 표현하는 EBFP2를 표현하는 상동성 재조합 기증자 플라스미드와 CRISPR/Cas9- 및 DsRed2 표현 플라스미드와 균등하게 재조합 기증자 플라스미드인 이러한 단순화된 노크-인 실험에 사용됩니다.

초록

면역 계통의 기능적인 유전체학 연구 결과는 표적 유전자의 삭제 및 관심있는 단백질에 요소의 추가를 둘 다 관련시키는 유전 조작을 요구합니다. 세포주 모형에 있는 유전자 기능의 확인은 세포 본질적인 기계장치의 유전자 발견 그리고 탐구를 위해 중요합니다. 그러나 CRISPR/Cas9 매개 노크인을 사용하여 T 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포의 유전자 조작은 특히 정지 상태에서 이러한 세포의 낮은 경질 효율 때문에 어렵습니다. 면역 세포에서 유전자를 수정하기 위해 약물 내성 선택 및 바이러스 벡터는 전형적으로 CRIPSR/Cas9 시스템을 발현하는 세포를 보강하는 데 사용되며, 이는 필연적으로 세포의 바람직하지 않은 개입을 초래합니다. 이전 연구에서는 전기기화 후 일시적으로 표현된 CRISPR/Cas9에 결합된 이중 형광 기자를 설계했습니다. 이 기술적인 해결책은 면역 세포에 있는 급속한 유전자 삭제로 이끌어 냅니다; 그러나, 약물 내성 선택 또는 바이러스 벡터를 사용하지 않고 T 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포에서 유전자 노크인은 더욱 도전적이다. 본 기사에서는, 당사는 세포 선별을 사용하여 기증자 플라스미드와 함께 Rosa26 궤적을 대상으로 CRISPR/Cas9 구조를 과도하게 표현하는 세포의 선택을 지원함으로써, 유전자 노크-인은 약물 저항 농축 없이 T 세포 및 대식세포 모두에서 달성될 수 있다는 것을 보여준다. 예를 들어, 우리는 인간 ACE2를 발현하는 방법을 보여줍니다, SARS-Cov-2의 수용체, 이는 현재 Covid-19 전염병에 대한 책임이, RAW264.7 대식세포에서 노크 -인 실험을 수행하여. 이러한 유전자 노크 세포는 기계학 연구에 널리 사용될 수 있다.

서문

면역 세포는 병원체에 대한 방어를 위해 중요합니다. 선천성 면역은 감염제의 통관 및 조직 항상성1,2의유지보수에필요합니다. 세포주 모형은 포유류 면역 계통의 분자 기초를 이해하기 위한 필수적인 공구입니다; 그(것)들은 인간 T 세포 활성화를 모델링하는 것과 같은 체외 기능적인 소사에서 이용되고, 면역 반응3,4를활성화하거나 감쇠에 있는 유전 요인의 기능을 결정하는 에서. 포유류 면역 계통은 엄청나게 이질적이며, 동등하게 중요한, 분자의 거대한 숫자는 주어진 세포유형의분화, 이동 및 기능을 제어한다는 것을 주의하는 것이 중요합니다5,6.

클러스터링 정기적으로 간격짧은 Palindromic 반복 (CRISPR)/Cas9 게놈 편집 도구는 정확한 방식으로 유전자의 기능성 기여를 용이하게 특정 세포 유형의 유전자 조작을 허용7,8. 여러 개의 출판 된 프로토콜은 HEK293 세포에서 리보뉴클레오 단백질 (RNPs)으로 알려진 Cas9 가이드 RNA 복합체의 형태로 CRISPR / Cas9의 전달을 설명했습니다, Jurkat 세포주, 1차 T 세포9,10,대식세포11,12, 13,줄기 세포14,및 기타15,16. 이들 프로토콜에서, 유전자 태깅은 일반적으로 내인성단백질(17,18)에형광 태그를 융합시킴으로써 달성된다. 그러나 특히 면역 세포에서 노크 인 실험19,20을용이하게하기 위해 단일 세포 분류와 호환되는 이중 형광 기자를 사용하는 시도는 거의 이루어지지 않았습니다.

면역 세포에 있는 새로운 유전 인자의 기능을 이해하기 위한 심층 기계분석은 일반적으로 유전자의 세포 형 특정 삭제, 유전 구조 실험 및 그것의 상호 작용자의 이상적으로 확인을 요구합니다. 면역 세포에서 유전자의 유전 삭제를 최적화하는 방법이9,15,21에발표되었음에도 불구하고 면역 반응을 이해하기 위해 다재다능한 기능을 가진 노크 인 알레를 도입하는 방법은 훨씬 적습니다. 따라서, 이 프로토콜에서 우리는 인간과 뮤린 면역 세포주 모두에서 안전한 항구 궤엽로26에서 관심있는 단백질 (POI)을 표현하는 효율적이고 매우 재현 가능한 프로토콜을 자세히 설명하는 것을 목표로합니다. CRISPR/Cas9(DsRed2)를 발현하는 플라스미드와 세포 분류에 의해 격리될 수 있는 재조합 DNA 템플릿(EBFP2)을 발한 플라스미드로 감염된 세포를 보강하기 위해 2색 리포터 시스템을 설계했습니다. 이 프로토콜에 따라, 우리는 제대로 연구된 단백질의 기능적 분석을 위해 인간 T 세포주 Jurkat 및 뮤린 대식세포 RAW264.7의 다중 노크-인 라인을 획득했습니다.

예를 들어, 우리는 인간 ACE2 (SARS-Cov-2의 수용체)22를안정적으로 표현하는 노크인 RAW264.7 대식세포를 얻는 방법을 이 프로토콜에서 보여준다. 선천성 면역 세포는 Covid-1923,24 및 인간 ACE2의 병인에 관여하기 때문에 복제 전에 세포로 바이러스 성 진입에 필요한 주요 수용체로 간주되기 때문에, 인간 ACE2의 노크와 대식세포는 대식세포 내부의 바이러스 증식 연구의 기계형 연구를위한 유용한 도구로 사용될 수 있습니다. 병행하여, 우리는 또한 친화성 트윈 스트렙 태그 (OST)와 그것의 아미노산 종결에서 융합된 RASGRP1 단백질을 표현하기 위하여 인간 ROSA26 메뚜기에서 유전자의 노크인의 예를 제시합니다. T 세포는 면역 요법에서 주요 표적 세포이며, 연구의 증가는 암에 그들의 반응성의 조작에 초점을맞추고있다 25,26. Rasgrp1은 T 세포 수용체의 주요 신호 분자 하류로 알려져 있으며 그 인터액터는 잘 해명되지 않는27,OST-RASGRP1 노크 -인 모델은 종양 및 감염에 T 세포의 반응을 조절하는 상호 작용을 식별하기위한 기초를 제공합니다. 종합하면, 이 공구는 Covid-19 연구 및 Rasgrp1와 상호 작용하는 새로운 분자의 발견에 이용될 수 있습니다.

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프로토콜

1. 로사26 로커스를 대상으로 sgRNAs의 설계 및 플라스미드 건설

  1. 원하는 삽입 부위 주변의 설계 가이드 RNA
    1. 마우스 Rosa26(이하 mRosa26로 지정) 노크-인 실험에 대한 삽입 부위가 mRosa26의첫 번째 인트론에 위치하고 있는지 확인; 이 사이트는 이전 연구에서 사용 되었습니다28,29. 인간 세포에서의 노크-인 실험의 경우, 삽입 부위가 mRosa2630의인간 호모로로 확인된 인간 ROSA26 궤적(이하 hROSA26)에있는지 확인한다.
    2. 마우스 게놈 정보학(http://www.informatics.jax.org/)과 엔셈블 게놈 브라우저(http://www.ensembl.org/index.html)로부터 획득한 마우스 및 인간 종의 게놈 서열을 각각 사용한다. mRosa26 또는 hROSA26 궤적의 게놈 서열의 50개의 베이스 쌍(bp)을 복사하여 원하는 삽입 부위를 측면으로 한다.
    3. 온라인 웹 도구 CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31을사용하여 디자인 가이드 RNA . 입력 시퀀스의 100bp를 1.1.2에서 붙여넣습니다. 특이도 점수가 높은 두 개의 가이드 RNA, 고효율 점수 및 낮은 오프 타겟 활성을 선택합니다. 또한, 더 높은 Doench 점수RNA 가이드를 선택하고"비효율적"32로표시된 것을 피하십시오.
      참고: 대체 CRISPR 설계 도구는 벤치링 CRISPR 설계 도구(https://benchling.com/crispr)와 같은 가치 있고 공개적으로 사용할 수 있습니다. CRISPR/Cas9 매개 녹인 돌연변이 셀의 주파수를 증가시키기 위해, 가능하면 원하는 삽입 부위에 가까운 두 개의 가이드 RNA를선택한다 33.
    4. mRosa26 메뚜기의 경우 mR26-sg1(5'-CTCCAGTTTCTAGAAGAT -3') 및 mR26-sg2(5'-CGCCCATCTTCTAGAAAGAC-3')(그림 1A)로지정된 2개의 인접 가이드 RNA를 사용하십시오. hROSA26 메큐의 경우, hR26-sg1(5'-GGCGATGACGAGATCACGCG -3') 및 hR26-sg2(5'-AATCGAGAAGCGACTCACA-3')(그림 1B)를사용합니다.
      참고: mR26-sg1 및 mR26-sg2및 hR26-sg2의 게놈 편집 활동은 RAW264.7 세포 및 Jurkat 세포에서 각각 평가하였다(보충 파일, 도면 S1참조).
  2. Rosa26 로커스를 대상으로 sgRNA를 포함하는 CRISPR 발현 벡터의 복제
    1. 하나의 가이드 RNA에 대한 앞으로 올리고를 합성하고 역 (보충 파일참조).
      참고: U6 프로모터에 의해 구동되는 발현에 도움이 되는 가이드 서열의 시작에 'G' 뉴클레오티드를 추가하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 전술한 mR26-sg1을 복제하기 위해, 전방 올리고는 CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT이고 역 올리고는 AAACATCTTCTAGAAGAGGGAGC이다. 전방 올리고에 추가 G와 역 올리고의 보완은 굵게 표시됩니다.
    2. 가이드 RNA에 대응하는 클론 합성 올리고스는 장연구소(https://www.addgene.org/crispr/zhang/)에 의해 개발된 gRNA 클론에 대한 일반적인 프로토콜을 사용하여 전작21(도 1C)에서생성된 올인원 CRISPR 발현 벡터 pX458-DsRed2로 변환; 그러나, 젤 정화 단계를 건너뛰고 PCR 정화 키트를 사용하여 소화된 벡터를 정화한다(재료표참조).
      참고: 이전 프로토콜에서, BbsI 소화 벡터의 겔 정화가 수행되었다; 그러나 이 단계는 시간이 많이 걸립니다. 본 프로토콜에서 소화된 제품은 PCR 정제 키트를 사용하여 정제되고 일반적으로 유사한 효율을 가진 양성 식민지를 생성하는 다운스트림 결찰 반응에 직접 사용된다.
    3. 제조 업체의 지시에 따라에체리치아 대장균 DH5α 유능한 세포의 50 μL로 결찰 생성물(step 1.2.2)의 10 μL을 변환합니다. 암피실린(100 μg/mL)이 있는 LB 한천 플레이트에서 3개의 콜로니를 무작위로 골라 내고, 하룻밤 동안 배양하기 위해 암피실린을 장착한 LB 배지 3mL로 접종한다.
    4. sanger 시퀀싱을 위해 야간 세균 배양 1mL을 사용하고 구조가 정확하다는 것이 확인될 때까지 나머지를 4°C에서 유지하십시오: pDsR-mR26-sg1 및 pDsR-mR26-sg2용 mRosa26 메뚜기 노크-인, hROSA26 궤적용 pDsR-hR26-sg1 및 pDsR-hR26-sg2.
    5. 고농도 의 플라스미드 DNA(약 2μg/μL)를 대금판으로 준비하여 질산등급 플라스미드의 정화를 위한 맥시프레플 키트(재료표참조)를 준비한다.

2. 동종 재조합 템플릿으로 타겟팅 벡터의 설계 및 구성

  1. 상동성 지향 수리 템플릿 설계
    1. CAG 하이브리드 프로모터, POI의 cDNA복제를 허용하는 AscI 제한 사이트, IRES-EBFP2 리포터, 소 성장 호르몬 폴리아데니션(bGH-polyA) 신호(그림1B)를 포함하는 이전 연구29에서최적화된 발현 카세트를 사용하여 POI를 구성적으로 표현하기 위한 표적 벡터를 설계한다.
    2. mRosa26 또는 hROSA26 궤적의 게놈 서열과 동성애를 공유하는 호모로지 암(HAs)을 설계합니다. 원하는 삽입 부위로부터 식 카세트의 왼쪽까지 상류 게놈 서열에 대응하는 5' HA의 ~1kb를 포함한다. 유사하게, 삽입 부위로부터 하류 게놈 서열에 대응하는 3' HA의 ~1kb를 발현 카세트의 오른쪽으로 포함한다.
      참고: 표현식 카세트는 CRISPR/Cas9 절단사이트(34)에가능한 한 가깝게 삽입된다. CRISPR/Cas9에 의한 표적 알레일의 재절단을 피하기 위해, 포팅벡터(34,35)에프로토스페서-인접 모티프(PAM) 서열(5'-NGG-3')에 뉴클레오티드 변화를 통합한다.
    3. 타겟팅 벡터의 선형화를 허용하려면 5' HA의 상류에 있는 고유한 EcoRI 사이트와 3HA 하류의 고유한 BamHI 사이트를 삽입합니다.
    4. 상용 벤더가 표적 벡터를 합성하고 pKR26-iBFP 및 pKhR26-iBFP로 지정하여 mRosa26 및 hROSA26 노크인을 각각 지정합니다.
  2. 타겟팅 벡터를 상동성 지향 복구 템플릿으로 구성
    1. POI를 발현하기 위해, Ensembl 게놈 브라우저로부터 cDNA 서열(coding sequence)을 얻고 가장 긴 단백질 서열을 소유한 전사체를 선택한다. 예를 들어, 인간 ACE2 유전자의 cDNA는 ACE2-202 ENST00000427411.2 및 인간 RASGRP1 유전자의 cDNA는 RASGRP1 ENSG000000172575이다.
    2. 상용 벤더의 도움으로 POI의 cDNA를 합성합니다. 또한 PCR 증폭을 통해 cDNA를 복제할 수도 있다(여기에 설명되지 않음). CDNA의 ATG 개시 코돈과 cDNA의 정지 코돈(5'-GGCGCGCC-3') 직전에 AscI 제한 사이트(기울임꼴 및 굵은) 및 코자크 컨센서스 번역 개시 사이트(밑줄)를 포함하는 서열 GGCGCGCCACC(5'-3')를 배치합니다.
    3. AscI로 합성 된 서열을 소화하고 제조 업체의 지침에 따라 제한 소화 후 DNA 조각을 정화하도록 설계된 PCR 정화 키트를 사용하여 정화하십시오 (재료 표참조).
    4. 정제된 cDNA 인서트를 제조업체의 지시에 따라 T4 DNA 리게아제를 사용하여 AscI-선형화된 백본 벡터 pKR26-iBFP 또는 pKhR26-iBFP에 리게이트한다.
    5. 최종 표적 벡터, pKR26-POI-iBFP 또는 pKhR26-POI-iBFP를 시퀀싱하여 확인합니다. maxiprep을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 검증된 구문을 정화합니다.
    6. 에코리 또는 BamHI를 사용하여 타겟팅 벡터를 소화하고 제조업체의 지침에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 소화 제품을 정화합니다. 선형 화된 표적 벡터(~0.8 μg/μL)를 -20°C에서 전기포기까지 저장합니다.

3. 대식세포및T세포선의 전기화

  1. 전기 화에 대 한 세포 배양 준비
    1. 준비 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) 1640 10% 태아 소 혈청으로 보충 (FBS) Jurkat T 세포에 대 한 완전 한 성장 매체로. RAW264.7 대식세포를 배양하기 위해 10%의 FBS로 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM)를 준비합니다. 세포 선별 전에 배양 후 배양에 사용되는 미디어를 제외하고 100 개의 U / mL 페니실린 및 100 μg / mL 연쇄 절제술 (Pen / Strep)으로 모든 완전한 성장 매체를 보완하십시오.
    2. 공급 업체의 지침에 따라 RAW264.7 및 Jurkat T 셀의 세분화를 수행 (재료의 표참조). RAW264.7 세포를 세분화할 때 트립신-EDTA 용액(0.25%)을 사용하여 세포를 분리합니다. RAW264.7 및 Jurkat 세포에 대한 냉동 보존 배지로 10 % (v / v) DMSO로 보충 된 FBS를 사용합니다.
    3. RAW264.7 대식대식대용 5분 동안 250 × g에서 세포를 수집하고 Jurkat T 세포의 경우 8분 동안 90 × g를 수집합니다. 그런 다음 1× DPBS의 5-10 mL로 세척하십시오 (Ca2 + 또는 Mg2 + 이온제외). DPBS를 제거합니다.
    4. 1× DPBS의 2mL를 사용하여 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포의 10 μL을 사용하고 0.2 % 트라이팬 블루의 동일한 부피와 혼합하여 세포 수와 생존가능성을 추정합니다.
      참고: 세포 배양이 >90% 생존력을 가지고 있는지 확인하십시오.
    5. 단일 노크-인 실험을 위해 5번의 반복으로 10μL 핵형성 팁으로 전기포공을 수행합니다. 2.0 × 106 세포에 필요한 부피를 계산하고 원심 분리에 의해 세포를 펠릿. 3.1.3 단계에서 설명된 바와 같이 1× DPBS로 셀 펠릿을 다시 세척한다.
      참고: 10μL 핵형성 팁을 사용할 때는 전기기당 4.0 ×105세포가 필요합니다. 이에 따라, 1개의 노크인 실험을 위해 적어도 2.0 × 106세포를 준비한다.
    6. 펜/스트렙 없이 웰당 0.5mL의 완전한 성장 매체(3.1.1단계에서 제조)로 24웰 플레이트를 준비하고 37°C 인큐베이터에 프리웜을 준비한다.
  2. CRISPR/Cas9 성분 및 표적 벡터의 전기화
    1. 전기 기공 시스템을 켭니다. 이전 연구21에최적화된 전기포기 파라미터 사용 : RAW264.7 대식세포용 1,400 V/20 ms/2 펄스, Jurkat T 세포를 위한 1350 V/20 ms/2 펄스.
    2. 파이펫팅으로 인한 시료 손실을 고려하여, 각 CRISPR/Cas9 벡터의 2.5 μg, 선형화된 표적 벡터의 2.4 μg, 및 리서스펜션 버퍼 R의 2.5 μg를 포함하는 멸균 1.5 mL 마이크로센트심심분리기 튜브에서 55 μL 전기기화 혼합물을 준비한다.
      참고: 시간을 절약하기 위해 전기포기 혼합물은 원심 분리(3.1.5단계)에서 제조될 수 있다.
    3. 단계 3.2.2에서 55 μL 전기 기화 혼합물에서 2.0 × 106 셀 (단계 3.1.5에서 제조)을 다시 중단합니다.
    4. 파이펫을 사용하여 10 μL 핵혈제 팁을 사용하여 3.2.3 단계에서 세포/전기 포기 혼합물을 흡인한다.
      참고: 파이펫팅 하는 동안, 전기 기고 장애를 일으킬 수 있는 기포를 도입 하지 마십시오.
    5. 전자기화 키트에서 3mL의 버퍼 E로 채워진 튜브에 샘플을 추가합니다.
    6. 3.2.1 단계에서 설명된 바와 같이 두 세포 유형에 대한 전기 포파라미터를 적용한다.
    7. 3.1.6 단계에서 예온 된 배지로 24 웰 플레이트의 한 우물로 샘플을 옮기.
    8. 다른 4개의 반복에 대해 3.2.4-3.2.7단계를 반복하고 대상 벡터만 및 CRISPR 발현 벡터만 컨트롤한다.
      참고: 다른 세포 유형/플라스미드 DNA로 전환할 때 핵형성 팁과 튜브를 변경합니다.
    9. 48-72h의 전염된 세포를 배양하여 전기측정 분석 또는 형광 활성화 셀 정렬(FACS) 이전에 CRISPR/Cas9 성분의 전기기화 및 발현 후 회복을 허용한다. 24시간 후 형광후에서 적색 채널을 탑재한 형광 현미경을 사용하여 DsRed2의 발현을 검사한다.
      참고: DsRed2 형광 세포를 모니터링하는 이점은 전기기화의 효율을 추정할 수 있고 추가 세포 정렬에 대한 적합성을 예측할 수 있다는 것입니다.

4. 세포 분류는 푸티드 노크 인 세포를 분리

  1. FACS 선별하기 전에, 완전한 성장 배지로 한 번 전감염된 세포를 세척하십시오. 펠릿 세포는 3.1.3 단계에서 설명된 바와 같이 원심분리및 500 μL의 신선한 배지에서 펠릿을 재연한다.
  2. 85 μm 노즐과 낮은 유량으로 셀 선별기(생물 안전 캐비닛에 위치)를 설정합니다. 20-30셀을 96웰 마이크로플레이트의 덮개에 정렬하여 단일 셀 정렬 효율과 정밀도를 분류하고 테스트하기 위한 "단일 셀" 모드를 선택합니다. 각 우물의 중앙에 국한된 한 방울은 계측기의 적절한 설정을 나타냅니다.
  3. 세포 현탁액을 4.1 단계에서 멸균 FACS 튜브로 옮기고 SYTOX 레드 데드 셀 스테인을 최종 농도1 nM에 추가합니다.
  4. 셀 선별기의 샘플을 분석합니다. SYTOX 레드와 EBFP2는 405 nm 레이저에 의해 흥분하고 V450 / BV421 및 APC 채널에 의해 각각 감지됩니다. DsRed2는 488 nm 레이저에 의해 흥분하고 PE 채널에 의해 검출된다. 비트랜스감염 된 세포 및 EBFP2- 및 DsRed2 단일 양성 세포를 스펙트럼 보정을 위한 컨트롤로 사용하십시오.
  5. 10개의 단일 셀을 사전 따뜻하게 된 완전한 성장 배지의 웰 당 150 μL을 포함하는 96 웰 마이크로 플레이트의 각 우물에 정렬합니다. 주카트 T 세포와 같은 서스펜션 세포주 및 평평한 바닥 마이크로플레이트와 같은 서스펜션 세포주를 배양하기 위해 둥근 바닥 마이크로플레이트를 사용하여 부착된 RAW264.7 대식세포를 위해 사용하십시오.
    참고: 우물당 10개의 세포를 분류하는 것은 세포 생존을 개선하고 종자해야 하는 96웰 마이크로플레이트의 수와 유동 세포측정 및 지음에 의해 가려져야 하는 시료수를 최소화하기 위한 최적화된 전략입니다. 잘 당 하나의 셀만 정렬하는 경우, 더 많은 마이크로 플레이트의 파싱은 올바르게 편집 된 세포를 얻기의 기회를 증가해야합니다.

5. 양성 노크 인 세포의 선별 및 검증

  1. 유동 세포측정에 의한 후보 노크인 세포 에 대한 선별
    1. 10-15일 동안 4.5단계에서 세포를 배양하고 3일마다 완전한 성장 배지를 추가하여 증발을 통해 잃어버린 액체를 대체합니다. Jurkat T 세포의 경우, 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서 성장한 세포를 평평한 바닥 플레이트로 이송하여 세포 증식을 최적화합니다.
    2. 확장된 정렬된 셀을 48웰 플레이트로 이송하여 추가 확장을 합니다.
    3. 세포가 합류에 가까우면 배양의 절반을 사용하여 유동 세포측정(그림3)에의해 EBFP2 발현을 검사한다. 일반적으로, 컨물성장 후 48웰 플레이트내의 배양의 절반은 0.5-1.0 ×105세포와 동일하며, 이는 유동 세포측정에 의한 하나의 샘플의 분석에 적합하다.
    4. 추가 증식을 위해 나머지 세포를 24웰 플레이트로 이송합니다.
    5. 추가 지평 실험을 위한 EBFP2 양성 세포의 높은 비율을 소유하는 후보 세포 인구를 유지합니다.
      참고: 10개의 세포가 96웰 마이크로플레이트의 각 우물로 분류되기 때문에, 노크인 세포가 녹인 유전자를 발현하지 않는 세포로 성장할 수 있다. 따라서 EBFP2 양성 세포를 음의 세포로부터 분리하기 위해 추가 적인 세포 분류 라운드를 수행하는 것이 정상이다.
  2. PCR 및 시퀀싱에 의한 후보 노크 인 세포 에 대한 선별
    1. 2 × 105 후보 셀을 수집합니다. DNA 준비 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출하십시오(재료 표참조).
    2. 정확한 상동성 지향 수리(HDR)가 mRosa26 메큐에서 발생했는지 확인하기 위해, 후보 노크인 세포의 게놈내의 임의 부위가 아닌 M Rosa26 메큐에서 발생했으며, HA의 각 측면에 걸친 프라이머로 PCR을 수행한다(도4). 표적 벡터(외부 올리고) 외부게놈 영역에 위치한 프라이머 1개 및 표적 벡터(내부 올리고) 내부에 있는 다른 프라이머를 선택한다.
      참고: hROSA26 궤적에서 HDR을 확인하는 데 유사한 디자인이 사용됩니다. PCR 프라이머는 POI 서열의 삽입을 검출하기 위해 쉽게 설계할 수 있습니다. 또한, 야생형 및 노크인 유전자형은 3프라이머 PCR을 사용하여 동시에 검출될 수 있다(보충 파일, 도S2참조).
    3. 빠른 복제 키트를 사용하여 양수 PCR 제품을 복제합니다(재료 표참조). 반응 혼합물을 DH5α 유능한 세포로 변환합니다.
    4. 무작위로 변환 당 8-10 개별 세균 성 식민지를 선택하고 Sanger 시퀀싱에 의해 단계 5.2.3에서 PCR 제품을 시퀀스.
  3. 면역블롯 분석 및 선호도 정제에 의한 양성 노크 세포의 검증
    참고: 후보 세포는 단백질-단백질 상호 작용연구를 위한 POI 의 삽입 또는 친화성 정제(AP)의 유효성검사를 위한 면역블롯 분석을 실시한다.
    1. 항체 제조업체의 지침에 따라 면역블롯 분석을 수행합니다. 1 차적인 항체 및 이차 항체의 사용에 관하여 정보에 대한 재료의 표를 참조하십시오.
    2. 제조업체의 지침에 따라 스트렙-택틴 세파로즈 구슬을 사용하여 OST 태그POI를 AP에 표현하는 노크 인 세포의 용액을 피사체(재료 표참조).
    3. 이미저를 사용하여 화학 발광을 감지합니다.

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결과

murine RAW264.7 대식세포를 사용하여 mRosa26 궤적에서 노크-인 실험을 수행하기 위해 전술한 프로토콜에 따라, SARS-Cov-2바이러스(도 2A)의수용체인 인간 ACE2를 발현하기 위한 표적 벡터를 설계하였다. 유사한 설계를 사용하여, 우리는 OST 태그 RASGRP1 융합 단백질(도 2C)의노크인인간 Jurkat T 세포를 생성했다. 3개의 플라스미드의 전환 후, 그 중 2개는 CRISPR/...

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토론

우리의 실험에서, 우리는 예를 예로 인간 Jurkat T 세포 및 murine RAW264.7 대식세포를 사용하여 노크세포 검열 및 검증에 구조 설계에서 면역 세포에서 노크에 편집을 수행하는 방법을 보여주었습니다. T 세포및 대식세포주 모두 형질36,37에내성이 있다; 그러나 CRISPR/Cas9 전달의 저효율 문제는 세포 분류와 결합된 형광 기자의 도움으로 극복할 수 있다. 이 프?...

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공개

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감사의 말

신샹의과대학의 유동 세포측정 핵심 시설에 감사드립니다. 이러한 기술의 개발은 NSFC가 LZ, 81471595 및 YL에 32070898 81601360 보조금에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 허난교육위원회 제21IRTSTHN030재단의 지원도 받고 있다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Amersham Imager 600Ge Healthcareimaging of chemiluminescence
Ampicillin, sodium saltMP Biomedicals194526
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074at 1/5000 dilution
Anti-RasGRP1 antibody, clone 10.1MerckMABS1461.0 μg/mL of working concentration
AscINew England BioLabsR0558S
β-Actin (D6A8) Rabbit mAbCell Signaling Technology8457at 1/1000 dilution
BamHI-HFNew England BioLabsR3136S
BbsI-HFNew England BioLabsR3539S
Cellometer Mini Automated Cell CounterNexcelom Bioscience
E.coli DH5α Competent CellsTakara9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxide)MP Biomedicals196055
DNeasy Blood & Tissue KitsQiagen69506cell culture reagent
DPBS (10X), no calcium, no magnesiumThermoFisher Scientific14200075
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucoseHyCloneSH30022.01
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
FACSAria™ FusionBD Biosciencesequipped with biosafety cabinet
FACS Canto flow cytometerBD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrene round bottom test tubeBD Biosciences352003
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher Scientific10099141
FlowJo version 10.7BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP Rabbit mAbCell Signaling Technology5174at 1/1000 dilution
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRPThermoFisher Scientific31430at 1/5000 dilution
Immobilon ECL Ultra Western HRP SubstrateMilliporeWBKLS0500
Immobilon-PSQ PVDF MembraneMilliporeISEQ00010
JurkatATCCTIB-152https://www.atcc.org/
Kanamycin sulfateMP Biomedicals194531
LB agar powderThermoFisher Scientific22700041
Multi-channel Pipette (30-300 μL)Eppendorf, or similar
Neon Transfection SystemThermoFisher ScientificMPK5000
Neon Transfection System, 10 μL kitThermoFisher ScientificMPK1096
Nunc 15 mL Conical Sterile Centrifuge TubesThermoFisher Scientific339651
OneTaq® Hot Start Quick-Load® 2X Master MixNew England BioLabs(M0489)for high GC% template
PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDaThermoFisher Scientific26616
Pipette tip 0.1-20µlEppendorf, or similar0030 075.005
Pipette tip 2-200µlEppendorf, or similar0030 075.021
Pipette tip 50-1000µlEppendorf, or similar0030 075.064
Plasmid Maxi KitQiagen12163
pX458-DsRed2Addgene112219
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104purify plasmid from restriction digestion
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BioLabsM0494S
RAW264.7ATCCTIB-71https://www.atcc.org/
Recombinant Anti-ACE2 antibody [EPR4435(2)]Abcamab108252at 1/1000 dilution
RPMI 1640 MediumHyCloneSH30027.01
Strep-Tactin Sepharose beadsIBA Lifesciences2-1201-010
Penicillin-StreptomycinThermoFisher Scientific15140122
SYTOX™ Red Dead Cell Stain, for 633 or 635 nm excitationThermoFisher ScientificS34859
T4 DNA ligaseNew England BioLabsM0202S
T4 Polynucleotide KinaseNew England BioLabsM0201S
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA solution (0.25%), with phenol redThermoFisher Scientific25200056
ZOE Fluorescent Cell ImagerBio-Rad
1.5 mL microtubes, PCR-cleanEppendorf, or similar0030 125.215
24-well Clear TC-treated Multiple Well PlatesCorning3524
96-well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated MicroplatesCorning3599
96-well Clear Round Bottom TC-treated MicroplateCorning3799

참고문헌

  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538(2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99(2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168(2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69(2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327(2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539(2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207(2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4(2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102(2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -, Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196(2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

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