세포 추적을 이용한 구강 기기 재생 중 및 이후 스텐터 의 운동성 패턴 분석

요약

우리는 밝은 필드 현미경 검사 및 세포 추적을 사용하여 수백 미크론에서 밀리미터 크기의 세포 집단의 운동성과 행동을 특성화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 Stentor coeruleus 가 잃어버린 구강 장치를 재생할 때 네 가지 행동 적으로 별개의 단계를 통해 전환한다는 것을 보여줍니다.

초록

스텐터 코에룰루스 는 단세포 재생 연구를 위한 잘 알려진 모델 유기체이다. 개별 세포에 대한 전사체 분석은 재생 과정 전반에 걸쳐 단계적으로 차별적으로 조절되는 수백 개의 유전자 (많은 구강 장치 (OA)와 관련이없는 것으로 나타났습니다. 새로운 OA의 성장을 향한 세포 자원의 이러한 전신 재구성 및 동원이 차등 유전자 발현의 단계에 시간에 상응하는 이동 및 행동의 관찰 가능한 변화를 초래할 것이라는 가설이 제기되었다. 그러나 S. coeruleus 의 형태 학적 복잡성으로 인해 통계와 시간 척도를 포착하기위한 분석의 개발이 필요했습니다. 사용자 지정 스크립트를 사용하여 짧은 비디오에서 셀을 추적하고 통계가 많은 인구 (N ~ 100)에 걸쳐 컴파일되었습니다. OA를 잃으면 S. coeruleus 는 처음에는 지시 된 움직임에 대한 능력을 상실합니다. 그런 다음 ~ 4 h에서 시작하여 ~ 8 시간까지 속도가 크게 떨어집니다. 이 분석은 운동성 표현형의 스크리닝에 유용한 도구를 제공하며 다른 유기체의 조사에 적합 할 수 있습니다.

서문

스텐터 코에룰루스(Stentor)는 크기가 크고, 여러 미세수술 기술을 견딜 수 있는 능력, 실험실 세팅 ^1,2,3에서 배양의 용이성으로 인해 단세포 재생을 연구하는 데 사용되어 온 잘 알려진 모델 유기체이다. 초기 재생 연구는 스텐터 (Stentor)에서 가장 크고 형태 학적으로 구별되는 특징 인 OA에 초점을 맞추 었으며, 이는 화학 충격 ^4,5,6에 완전히 흘려^집니다. 잃어버린 OA의 De novo 대체는 새로운 막질 밴드의 출현으로 시작됩니다 - 여덟 가지 형태 학적 단계³에 걸쳐 기능적 OA를 형성하기 전에 점차적으로 세포의 앞쪽으로 이동하는 섬모 배열. 이들 단계는 온도에 관계없이 순차적으로 관찰되었으며, 거의 모든 연구⁵에 대한 보편적인 기준점을 제공한다.

스텐터 재생의 기계론적 분석에는 화학 또는 분자 스크린의 일부로 여러 샘플에 적용할 수 있을 만큼 견고하고 간단한 재생 타이밍을 측정하기 위한 도구가 필요합니다. 세포 기반 분석을 수행하기 위한 표준 방법은 영상화이며, 이 경우, 재생 동안 새로운 OA의 형성을 이미징한다. 그러나, 이러한 영상-기반 분석은 재생성 구조가 마커로 사용될 수 있는 별개의 분자 성분을 함유할 때 가장 효과적이어서, 이들이 형광 이미지에서 쉽게 검출될 수 있도록 한다. 스텐터 OA의 경우에, 공지된 성분들(섬모, 기저체)은 또한 세포 표면의 나머지 부분에 존재한다; 따라서, OA의 복원을 인식하는 것은 단순히 구성요소의 존재 또는 부재를 찾는 것만으로는 달성될 수 없다.

오히려, OA를 검출하기 위해서는 어떤 형태의 형상 인식이 필요할 것이며, 스텐 터 세포가 종종 빠른 수축 과정을 통해 형태를 변화시킨다는 사실을 감안할 때 이것은 잠재적으로 매우 도전적입니다. 이 논문은 신체 및 OA 섬모의 운동성 활성에 의존하는 재생을위한 대체 분석을 제시합니다. OA가 재생됨에 따라, 새로 형성된 섬모는 위치와 활성의 재현 가능한 변화를 겪으며, 이는 차례로 세포의 수영 운동성에 영향을 미칩니다. 운동성을 분석함으로써, 재생된 구조물의 기능을 정량화함으로써 재생을 정량화하는 "기능적 재생"에 대한 분석을 수행할 수 있다. 재생 중 스텐터 섬모 함수의 이전 분석은 재생⁷의 여러 단계에서 흐름 패턴의 변화를 관찰하기 위해 외부 매체에 추가 된 트레이서 비드와 결합 된 입자 이미지 속도 측정을 사용했습니다. 그러나이 접근법은 개별 세포 및 관련 유동 필드를 한 번에 하나씩 힘들게 이미징해야합니다.

세포 자체의 움직임을 섬모 생성 흐름의 프록시로 사용함으로써, 고처리량 스크리닝 플랫폼과 호환되는 저해상도 이미징 시스템을 사용하여 더 많은 수의 세포를 병렬로 분석할 수 있을 것이다. 이 분석은 원칙적으로 수백 미크론에서 밀리미터 크기의 다른 수영 생물에서 발달 및 기능적 재생을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 프로토콜의 섹션 1은 멀티웰 샘플 슬라이드의 구축을 설명하며, 이는 최대 하루 종일 세포 집단의 높은 처리량 이미징을 허용합니다. 다른 세포 유형과 함께 사용하기 위해 조정하는 방법에 대한 세부사항이 제공된다. 프로토콜의 섹션 2는 디지털 단일 렌즈 반사 카메라를 사용하여 해부 현미경에서 수행 할 수있는이 분석을위한 비디오 데이터의 수집을 다룹니다. 프로토콜의 섹션 3에서는 MATLAB 코드(추가 정보)를 사용한 셀 추적 및 셀 속도 계산에 대한 연습을 제공합니다. 프로토콜의 섹션 4에서는 결과를 쉽게 해석할 수 있도록 그림 1C-F 및 그림 2C와 같이 수치 결과를 플롯으로 변환하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

주: 대략 백 개의 S. 코에룰루스 세포의 집단을 이전에 공개된 JoVE 프로토콜⁸에 따라 배양하였다.

1. 시료 준비

1. 250 μm 두께의 실리콘 스페이서 시트 (재료 표)의 조각을 현미경 슬라이드보다 높이와 너비 모두에서 약간 작게 자릅니다. 5/16" 구멍 펀치를 사용하여 원형 웰을 만듭니다. 좋은 밀봉을 보장하기 위해 이웃 우물 사이에 충분한 공간을 남겨 두는 것에 유의하십시오.
   참고: 이웃 우물 사이에 3mm의 공간이 충분한 것으로 확인되었습니다. 연습을 통해 열 개의 웰을 단일 샘플 슬라이드에 배치 할 수 있습니다.
2. 세포를 2분 동안 10% 수크로오스 또는 2% 우레아에서 인큐베이션함으로써 OA의 재생을 개시한다(도 1A). 그런 다음 신선한 배지⁸로 세 번 씻으십시오. 각 웰에 약 열 개의 스텐터를 부드럽게 피펫하십시오. 샘플 부피를 웰 볼륨과 가능한 한 가깝게 일치시키는 것을 조심하십시오.
   참고: 여기에 사용된 웰 치수에 대해, 12.5 μL의 샘플을 각 웰 내로 피펫팅하였다.
3. 한쪽 가장자리에서 시작하여 웰 위에 커버 글라스 조각 ( 재료 표 참조)을 부드럽게 낮추어 웰을 닫습니다. 10μL 피펫 팁과 같이 좁고 약간 유연한 물체를 사용하여 실리콘 시트와 접촉하는 커버 글라스를 눌러 밀봉을 잘 하십시오.

2. 가시 광선 현미경 검사 시간 경과

1. 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 배율을 사용 가능한 가장 낮은 크기로 설정하여 하나의 웰이 프레임 전체에 맞도록 합니다.
   참고: 이 프로토콜의 현미경에는 1.6x 카메라 어댑터와 목표의 1x 배율이 사용되었습니다.
2. 타임랩스를 시작합니다. 각 시점에서 각 웰의 초당 30프레임에서 10초 비디오를 획득합니다. 전동 X-Y 스테이지가 있는 현미경 설정을 사용하는 경우 전체 타임랩스를 자동화합니다. 그렇지 않으면 사용자가 각 시점에 있는지 확인하여 샘플을 수동으로 변환하여 각 웰을 기록하십시오.
   참고: 가열 및 증발을 피하기 위해 이미징하지 않을 때 샘플을 비추지 마십시오. 샘플 부피는 작으며 증발은 기포로 이어집니다.
3. 동영상을 TIFF, MOV 또는 AVI로 저장합니다.
   참고: 가장 일반적인 비독점 비디오 파일 형식입니다. 특정 현미경 소프트웨어에 따라 비디오는 기본적으로 독점 파일 형식으로 저장 될 수 있지만 앞서 언급 한 파일 형식 중 하나로 내보낼 수 있습니다.
4. 물리적 스케일을 위해 픽셀-밀리미터 변환 계수를 사용하고, 캘리브레이션을 수행하거나 사용된 카메라에서 알려진 픽셀 크기를 사용합니다. 보정하려면 비디오와 동일한 배율 설정에서 보정 슬라이드의 선명한 이미지 또는 선명한 눈금자를 얻습니다. 이미지 보기 프로그램을 사용하여 알려진 물리적 거리의 마크 사이의 픽셀 수를 계산합니다.
   참고: 예를 들어, 눈금자의 이미지에 1mm 표시와 2mm 표시가 100픽셀로 구분되는 경우 변환 계수는 100픽셀당 1mm입니다. 또는 카메라 픽셀 크기에서 이 요소를 파생시키려면 카메라 픽셀 크기에 배율을 곱하면 됩니다. 예를 들어, 사용된 카메라의 픽셀이 3.45μm이고 사용된 배율이 1.6배인 경우 변환은 1픽셀당 3.45μm * 1.6 = 5.52μm입니다.

3. 세포 추적

1. TrackCells.m과 CleanTraces.m이라는 두 스크립트를 컴퓨터의 기억하기 쉬운 위치에 다운로드합니다. 데이터 비디오가 아직 이 컴퓨터에 없으면 이 컴퓨터로 전송하십시오.
   참고: 데이터 비디오와 스크립트는 동일한 폴더에 있을 필요가 없습니다.
2. 데이터 비디오를 각 시간대마다 하나씩 폴더로 구성합니다. 먼저 스크립트 TrackCells.m 을 사용하여 데이터 비디오에서 자동화된 셀 추적을 수행합니다. TrackCells.m을 열고 스크립트를 실행합니다.
3. 팝업 창이 나타나면 경로에 추가 를 선택합니다.이 옵션은 일반적으로 스크립트가 지정된 폴더에서 처음 실행될 때만 발생합니다. 메시지가 표시되면 추적을 시작할 하나 이상의 데이터 비디오를 선택하고 데이터 비디오로 이동합니다(섹션 2). Shift 클릭, 컨트롤 클릭 또는 마우스 왼쪽 버튼을 누른 채 파일 위로 이동하여 강조 표시하여 여러 비디오 파일을 선택합니다.
4. 프롬프트 창 하단의 파일 이름 : 상자에있는 파일 목록에 만족하면 열기를 클릭하십시오. 먼저 한 비디오에서 테스트 실행을 수행하여 모든 매개 변수가 올바르게 설정되었는지 확인합니다(아래 설명 참조).
   참고: 이 스크립트는 이제 선택한 각 비디오 파일에 대한 폴더를 만듭니다. 그런 다음 비디오의 각 프레임을 .jpg 파일과 비디오에있는 모든 흔적을 포함하는 position_estimates.mat라는 파일로이 폴더에 씁니다. 비디오 크기, 비디오 수 및 컴퓨터 속도에 따라 이 스크립트를 실행하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.

4. 추적 확인

1. 계속하기 전에 오류 메시지가 없는지 확인하여 섹션 3에 설명된 단계를 올바르게 수행했는지 확인합니다. CleanTraces.m 스크립트를 사용하여 변칙적이거나 잘못된 추적을 수동으로 거부합니다. 파일을 두 번 클릭하여 MATLAB 편집기 창에서 CleanTraces.m을 엽니다.
2. 프롬프트에서 TrackCells.m으로 출력 된 데이터 폴더 선택. 비디오 파일과 동일한 이름을 가지며 섹션 3에 설명 된대로 생성 된 폴더 중 하나로 이동합니다. 폴더를 하나만 선택합니다.
   참고: 이 스크립트는 이제 팝업 창에 추적을 하나씩 표시합니다. 추적이 시작되는 비디오 프레임에 녹색으로 겹쳐져 있고 추적이 끝나는 비디오 프레임의 프레임에 자홍색으로 겹쳐져 있습니다. 따라서 유효한 추적은 녹색 셀과 마젠타 셀을 연결해야 합니다.
3. 메시지가 표시되면 추적을 유지하려면 1을 입력하고 추적을 거부하려면 0을 입력합니다. Enter 키를 눌러 다음 추적으로 이동합니다.
   참고: 더 이상 추적이 없거나 처음 육십 개가 표시될 때까지 새 추적이 계속 표시됩니다. 이 프로세스가 완료되면 스크립트는 출력을 저장하기 위해 CLEAN TRACES 라는 폴더를 자동으로 만들고 나머지 모든 추적을 비디오의 첫 번째 프레임 위에 표시합니다(그림 1B). 이 이미지는 나중에 참조할 수 있도록 자동으로 LabeledTraces.png 로 저장됩니다. 사용자가 보관하도록 선택한 모든 추적은 clean_traces.mat 파일에 저장됩니다.
4. 계속하기 전에 한 시점의 모든 비디오에 대해이 단계를 완료하십시오.
   참고: 이 원고의 데이터에 대해, 각 시점에서 각 웰에 대해 하나의 비디오를 획득하여 시간대당 총 열 개의 비디오를 획득했습니다.

5. 데이터 시각화

참고: 서로 다른 시간대에 걸쳐 전체 세포 집단의 운동성을 시각적으로 비교하기 위해 섹션 4의 모든 트레이스를 원점에서 시작하여 각 시점에 대해 하나의 방사형 변위 대 시간 플롯을 생성하도록 변환되었습니다(그림 1C-F, 모든 시점에 대한 보충 그림 S1 참조).

1. SpaghettiPlots.m이라는 제목의 스크립트를 다운로드하여 시작하십시오. 스크립트를 열고 실행합니다. 그래프로 웰 데이터(clean_traces.mat)가 포함된 시간 폴더 선택 프롬프트와 함께 창 파일 브라우저 창이 나타나면 시점 중 하나의 폴더로 이동합니다. 이 폴더에는 분석된 각 비디오에 대한 폴더가 포함되어 있어야 합니다.
2. 보정: 밀리미터당 픽셀 수는 얼마입니까?라는 메시지가 표시되면 2.4단계에서 찾은 보정 값을 입력하고 Enter 키를 누릅니다.
   참고: 이제 스크립트는 이 시점에서 분석된 모든 비디오의 추적을 단일 플롯으로 결합합니다(그림 1C-F). 플롯에서 희미한 점선으로 표시된 원은 1, 2, 3 및 4mm의 방사상 변위를 나타냅니다.
3. 스크립트의 행 55를 변경하여 필요에 따라 플롯의 축을 조정합니다.이 줄은 기본적으로 최대 4mm의 반지름을 포함하여 rr = 4로 설정됩니다. 플롯을 저장합니다.

결과

이 분석의 목표는 큰 (N ~ 100) 재생 스텐터 집단 내에서 세포로부터의 이동 패턴의 점진적 변화와 이동 속도의 단계적 증가를 정량화하는 것입니다. 결과 해석을 돕기 위해 이 프로토콜에 포함된 사용자 지정 코드는 비디오 데이터 집합의 모든 셀 이동 추적의 오버레이(그림 1C-F 및 그림 S1)와 재생성 시작 이후 시간별 수영 속도 플롯의 두 가지 유형의 플...

토론

많은 입자 및 세포 추적 알고리즘이 현재 존재하며 일부는 완전히 무료입니다. 비용과 사용자 친화성은 종종 타협이 필요한 절충안입니다. 또한, 기존의 많은 세포 추적 프로그램은 수영하는 동안 회전하고 갑작스런 방향 변화를 겪을 수있는 스텐터의 빠른 수영 운동보다는 조직 배양 세포의 느린 크롤링 움직임을 추적하도록 설계되었습니다. 이러한 많은 옵션을 테스트 한 후 여기에 제시...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm-thick silicone sheet	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific	NC1034527	As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera			We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		needed for TrackCells.m and CleanTraces.m