마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

요약

여기서는 마이크로머신 마이크로유체 플랫폼을 사용하여 3차원 단순화 및 미분화 피부 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 병렬 흐름 접근법은 주사기 펌프에 의해 제어되는 상피 세포의 파종을 위해 진피 구획의 시상 증착을 허용합니다.

초록

이 작품은 복잡한 다층 조직을 생성 할 수있는 잠재력을 가진 새롭고 비용 효율적이며 신뢰할 수있는 미세 유체 플랫폼을 제공합니다. 개념의 증거로, 진피 (기질)와 표피 (상피) 구획을 포함하는 단순화되고 미분화되지 않은 인간 피부를 모델링했습니다. 이를 위해, 2개의 챔버로 나뉘어진 다목적이고 견고한 비닐 계열 장치가 개발되어 고가의 특수 장비의 사용 또는 소형 소수성 분자 및 단백질의 흡수와 같은 생물 의학 응용을 위한 다디메틸실록산(PDMS)을 기반으로 한 미세 유체 장치에 존재하는 몇 가지 단점을 극복했습니다. 더욱이, 병렬 흐름을 기반으로 하는 새로운 방법이 개발되어 진피 및 표피 구획모두의 시상증을 가능하게 하였다. 피부 구조는 인간 1 차 섬유아세포와 위에 시드된 불멸의 각질 세포의 단층이 포함된 피브린 매트릭스로 이루어져 있으며, 이는 이후 동적 배양 조건하에서 유지됩니다. 이 새로운 미세 유체 플랫폼은 인간의 피부 질환을 모델링하고 다른 복잡한 조직을 생성하는 방법을 추정 할 수있는 가능성을 엽니 다.

서문

최근에는 화장품 및 의약품의 독성 분석을 위한 체외 인체 피부 모델의 개발 및 생산을 향한 발전이 이루어지고^있다. 제약 및 스킨 케어 산업의 연구원은 동물을 사용하고있다, 마우스가 가장 일반적인되고, 자신의 제품을 테스트하기 위해^2,3,4,5. 그러나, 동물에 대한 제품을 테스트하는 것은 인간에서 항상 반응을 예측하는 것은 아니며, 이는 종종 인간에서 약물 실패 또는 부작용으로 이어지며 결과적으로 경제적 손실^5,6. 영국은 1998년에 화장품 검사를 위해 동물을 사용하는 것을 금지한 최초의 국가였습니다. 이후 2013년 EU는 동물 화장품 의 검사 및 승인을 금지했다(EU 화장품 규정 제1223호/2009)^7.

이 금지는 미국^8의'휴먼 화장품 법'과 같은 다른 국가에서도 고려되고 있습니다. 윤리적 관심사 외에도 동물과 인간의 피부 사이의 해부학적 차이는 동물 실험을 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들고 종종 비효율적입니다. 또한, 2025년^9년까지전 세계 체외 독성 검사 시장 규모는 2698억 달러에 이를 것으로 예상됩니다. 이러한 이유로, 동물을 사용하지 않고 화장품과 약물의 안전성과 독성 효과에 대한 테스트를 가능하게 하는 생체 공학 인간 피부 모델과 같은 체외 연구를 위한 새로운 방법과 대안을 개발할 필요가 있습니다.

시험관, 인간 피부 모델에서 두 가지 종류의 시판이 가능합니다. 첫 번째 유형은 서로 다른 재료에 시드되는 각질 세포의 여러 층을 포함하는 계층화된 표피 등가물로 구성됩니다. 이들 중 일부는 경제협력개발기구(OECD)의 승인을 받았으며, EpiDerm 또는 SkinEthic^10,11,12와같은 피부 부식 및 자극 테스트를 위한 대안방법 검증을 위한 유럽 센터(ECVAM)에 의해 검증되었다. 두 번째 유형은 T-Skin 및 EpiDerm-FT와 같은 섬유아세포가 함유된 3차원(3D) 비계에 시드된 인간 각질 세포를 분화하는 층이 있는 전체 피부 등가물입니다. 그러나, 이 모형은 정확하게 인간적인 생리적인 조건을 나타낼 수 없는 정적인 조건하에서 배양됩니다.

최근 관심은 동적 관류^{13,14,15,16,17,18,19를}가진 세포 배양 삽입 (CCI) 형식으로 체외 3D 피부 모델을 생성하는 데 초점을 맞추고^있다. 그러나 이러한 시스템은 현장에서의 고전적인 정의에 따라 미세 유체 피부 온 칩으로 엄격하다고 간주 할 수 없습니다. 장기에 칩에 대한 Ingber의 정의는 장기가 미세 유체 채널 내부에 배치되어야한다고 명시, 이는 단지 몇 장치가^20을충족하는 조건입니다^20,21. 스킨 온 칩은 지금까지 다공성 멤브레인^22,23로분리된 단세포 층 및/또는 진피 세포 층으로서 대부분 간단한 상피를 모델링하였다. 미세 유체 시스템^16,24에서피부를 모델링하는 몇 가지 발전이 있었지만, 현재 잉버의 정의에 맞는 장기 온 - 어 칩 시스템을 보여주는 문헌이 없다, 장소에서 다층 피부를 생성 할 수 및 상피 및 기질 구성 요소를 모두 포함.

이 작품에서는 스킨 온-어칩 애플리케이션을 위한 새롭고 비용 효율적이고 견고한 비닐 기반 의 미세 유체 플랫폼이 제공됩니다. 이 플랫폼은 PDMS^25의일부 한계를 극복하면서 제조 공정에서 보다 단순하고 장치 레이아웃의 유연성과 다기능성을 높이는 마이크로 가공에 의해 생산되었습니다. 주사기 펌프로 제어되는 병렬 흐름을 통해 단순화된 피부 구조를 도입하는 방법도 설계되었습니다. 병렬 흐름은 매우 다른 점도 (이 경우 버퍼 및 피브린 프리 젤)를 가진 두 유체가 서로 혼합하지 않고 채널을 통해 침투 할 수 있게합니다. 개념의 증거로서, 진피를 모방한 피브린 매트릭스에 내장된 섬유아세포를 함유한 진피 분체 구조가 장치에 도입되었으며, 그 위에 각질 세포의 단층이 장화되어 미분화 표피를 모방하였다. 진피 구획 높이는 유량을 수정하여 변조될 수 있다. 이 작품의 주요 참신함은, 이전에 설명된^{모델(22,26,27,28,29)에}비해 미세유체제를 통해 마이크로챔버 내부의 3D 구조의 개발이다. 이 문서는 단순화 된 미분화 피부를 제공하지만, 장기적인 목표는 생성하고 약물 및 화장품 테스트 목적으로 의 생존력과 기능을 보여주기 위해 완전히 차별화 된 피부 구조를 특성화하는 것입니다.

프로토콜

1. 칩 설계 및 마이크로 머시닝 매개 변수

1. FreeCAD 오픈 소스 설계 소프트웨어로 미세 유체 칩 레이어를 설계합니다. 채널의 치수에 대한 표 1을 참조하십시오. 올바른 레이어 중첩을 위해 사용자 정의 제작 된 정렬기를 사용하는 설계에 직경 4개의 구멍을 포함합니다.

	길이(μm)	너비(μm)
하부 챔버	28,400	800
상부 챔버	31,000	800

표 1: 장치의 상부 및 하부 채널의 치수입니다.

2. 95 μm 두께의 접착제, 투명한 비닐 시트를 30cm x 30cm 사각형으로 잘라 플로터에 제대로 맞춥니다.
3. 브라더스 CanvasWorkspace 소프트웨어를 사용하여 30cm x 30cm 작업 공간을 만들고 칩의 다양한 레이어에 대한 디자인 된 패턴으로 채웁니다(그림 1A). .svg 파일에 저장합니다.
4. 가장자리 플로터(그림 1B-D)와30cm x 30cm 비닐 시트를 잘라.
   1. 비닐 시트를 낮은 압정 접착제 매트에 붙이고 필요한 경우 모든 기포를 제거하십시오.
   2. 플로터에 .svg 파일을 업로드하고 절단 매개 변수를 설정합니다: 절단 블레이드: 레벨 3; 절삭 압력: 레벨 0; 절삭 속도 : 레벨 1. 접착제 매트에 비닐을 플로터에 넣고 절단 과정을 시작합니다.
5. 12 μm 두께의 양면 테이프 비닐에 상단 채널 패턴을 이전 단계에 따라 잘라냅니다.

그림 1: 칩 설계 및 마이크로 머시닝 프로세스. (A)칩을 위해 설계된 상단 및 하단 패턴으로 채워진 작업 공간을 보여주는 소프트웨어 레이아웃. (B)절단 공정 중 에지 플로터; 절단 블레이드, 전체 비닐 시트 및 접착제 매트가 표시됩니다. (C)컷 시트에서 분리되는 패턴 비닐. (D)상단 채널 디자인패턴 접착제 비닐 레이어의 샘플. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. PDMS 층 제작

1. PDMS 및 경화제를 10:1(v/v)의 비율로 혼합하고 혼합물을 15분 동안 진공 아래에 놓고 기포를 제거합니다. 혼합물 55mL을 55cm² 제곱 배양 접시에 붓고 2mm 두께층을 얻습니다. 바늘로 거품을 제거합니다.
2. 80°C에서 1시간 동안 오븐에서 혼합물(2.1단계)을 치료한다. PDMS의 성형을 풀고 칩 치수로 사각형으로 잘라냅니다. 18 G 주사기 바늘로 튜브를 위한 구멍을 만드십시오.

3. 칩 조립

참고: 더 잘 이해하면 그림 2를참조하십시오.

1. 채널, 입구 및 콘센트를 적절하게 조정하기 위해 정렬기를 사용하여 전체 장치를 조립합니다. 하부 채널을 조립하기 위해 4개의 비닐 레이어(해당 하부 마이크로패턴 포함)를 쌓아, 하단 레이어의 커버 테이프를 유지하여 정렬기를 고집하지 않도록 합니다.
2. 폴리카보네이트(PC) 다공성 멤브레인을 하부 채널 위에 놓아 상부에서 분리한다. 하부 채널의 입구를 커버하지 않도록 주의하십시오.
3. 상부 챔버 디자인으로 10개의 비닐 레이어를 추가합니다. 상단 채널 패턴이 있는 양면 테이프 비닐 레이어를 붙입니다. 리정렬기에서 칩을 제거하고 유리 슬라이드에 붙입니다.
4. 2mm 두께의 PDMS 시트를 양면 테이프 비닐 레이어 위에 놓고 튜브에 적합한 고정을 제공하고 누출을 방지합니다. 칩이 완전히 방수되었는지 확인하기 위해 밤새 칩 위에 무게를 둡니다. 70% v/v 에탄올을 5분 동안 세척한 다음 증류된 H₂O로 세척하여 칩을 멸균합니다.

그림 2: 미세 유체 칩 조립. (A)장치의 조립의 일반적인 방식. 하부 및 상부 챔버는 각각 4 개 및 11 개의 중첩 된 비닐 시트로 구성됩니다. (B)미세 유체 칩의 상단 및 측면 보기. 상단 및 하단 채널은 각각 분홍색과 파란색으로 표시됩니다. (C)맞춤형 리정렬기를 사용하여 칩 어셈블리의 이미지. (D)완전한 조립 후 칩 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 펌프 연결

참고: 펌프 연결의 그래픽 표현은 그림 3에표시됩니다.

1. 상부 챔버 입구 1 (UCi1)에 펌프 1을 연결합니다.
2. 펌프 2를 상부 챔버 입구 2(UCi2)에 연결합니다.
3. 펌프 3을 하부 챔버 입구(LCi)에 연결합니다.
4. 상부 챔버 콘센트 (UCo) 및 하부 챔버 콘센트 (LCo)를 폐기물 튜브에 연결합니다.
5. 폴리테트라플루오로틸렌(PTFE) 튜브와 18G 스테인리스 스틸 커넥터를 사용하여 각 입구에 주사기를 연결합니다.

그림 3: 펌프 연결 및 입구/콘센트 위치. (A)각각의 입구에 세 개의 서로 다른 펌프의 연결을 보여주는 다이어그램. 콘센트는 폐기물 용기에 연결됩니다. (B)라벨이 부착된 입구와 콘센트가 있는 칩 이미지. 약어: LCi = 하부 챔버 입구; LCo = 하부 챔버 콘센트; UCi1 = 상부 챔버 입구 1; UCi2 = 상부 챔버 입구 2; UCo = 상부 챔버 콘센트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 세포 배양

참고: HaCaT 세포주에는 상업적 기원이 있습니다. 인간 1차 섬유아세포는 건강한 기증자로부터 나왔으며 "레지스토 나시오날 드 바이오방코스 파라 Investigación Biomédica 델 인스티투토 데 살루드 카를로스 III"에 등록된 인간 기원의 생물학적 샘플의 수집에서 얻어졌다.

1. 세포 배양 후드에서 작업, 이전에 자외선아래 살균 및 에탄올로 닦아.
2. 37°C에서 H2B-GFP-HaCaT 세포(인간 불멸피부 각질세포, hKC) 및 GFP-인간 1차 섬유아세포(hFBs)를 37°C에서, 배양 배지 2mL, 원심분리기는 250°C에서 250°C에서7분 동안 × 첨가한다.
   참고: H2B-GFP-HaCaT 세포는 하이브리드 히스톤 H2B-녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하도록 변형된 인간 불멸의 각질 세포로, 핵을 녹색 형광으로 제공한다. GFP-hFB는 세포질 녹색 형광을 발현하기 위해 벡터 pLZRS-IRES-EGFP로 변형된 인간 1차 섬유아세포이다. 이들 세포는 이전에 발표된^{프로토콜(30) 30,31에} 따라 수정되었습니다.
3. 1x DMEM의 hKC와 hFB를 10% 태아 소 혈청과 항생제/항마이코틱 용액의 1%로 보충한 배양. 사용하기 전에 37°C에서 배양 배지를 미리 데우기 전에 미리 데워보실 수 있습니다.
4. 1x 인산염 완충식식염(PBS)으로 세포를 분리하고, 트립신/에틸렌디아민 테트라아세산(EDTA)의 2mL을 추가하고 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
5. 비활성화 된 트립신은 배양 배지의 4 mL을 추가합니다. 세포를 다시 중단하고 15mL 튜브로 옮기십시오. 10 μL을 제거하여 노이바우어 챔버의 세포를 계산하고 적절한 농도를 결정합니다.
6. 원심분리기는 250× g에서20°C에서 7분 동안 15mL 튜브를 원심분리한다. 상체를 제거하고 원하는 농도로 펠릿을 재보페: 50,000세포/mL및 hKC에서 5·×¹⁰⁶ 세포/mL에서 hFC를 재보선다.

6. 피브리노겐 프리젤 제제

1. 유리병에 CaCl_2의 1mL (NaCl에서 1 % w / v)를 추가하여 혈전을 활성화합니다.
2. 다음 성분을 추가하여 3.5 mg/mL의 피브린 의 최종 농도에서 피브린 하이드로겔 1mL을 얻으려면 다음 성분을 추가하십시오: 활성화 된 트롬빈 59 μL (10 NIH 단위 / mL), 59 μL의 탄examic 산(재료 표,100 mg /mL), 배양 배지의 764 μL 50,000 hF를 함유하고 있습니다. 118 μL 의 피브리노겐 (NaCl에서 20 mg / mL (0.9 % w / v)).
   참고: 피브리노겐은 마지막 순간에 추가해야 합니다.

7. 병렬 흐름 프로토콜

1. 전체 공정 동안 50 μL/min에서 LCi를 통해 펌프 3로 1배 PBS를 펌프합니다.
2. 100 μL/min에서 UCi2를 통해 2를 통해 펌프2를 펌프하는 희생 유체(1x PBS)를 펌프합니다.
3. 프리 젤로 주사기를 적재하고 펌프 1에 빠르게 배치하고 200 μL/min(그림4A)에서실행합니다.
4. 프리젤이 UCo를 빠져나가면 펌프 1과 2를 중지합니다.
5. 겔화를 허용하기 위해 37 °C에서 튜브를 제거하지 않고 칩을 10 분 이상 방치하십시오.
6. 펌프 3에서 UCi2까지 하룻밤 동안 50 μL/h에서 배양 배지를 펌핑합니다.
7. 캡으로 UCi1을 차단합니다.

8. hKCs 모노 레이어 시드

1. hFB가 진피 구획의 생성 후 24 시간 확산되는 현미경하에서 확인하십시오.
2. 5×~UCi2까지 펌프 2를 가진 hKC를 40 μL/min에서 1분(그림4B)에서5×,106셀/mL로 소개합니다.
3. 칩을 37°C에서 세포 부착을 위해 습도 포화 인큐베이터에 하룻밤 을 둡니다.
4. 펌프 3로 신선한 배양 배지를 LCi를 통해서만 50 μL/min(그림4C)으로펌프합니다.

도 4: 진피 구획생성을 위한 미세유체 프로토콜. (A)횡단단면은 진피 구획을 생성하는 병렬 유동 공정을 나타낸다. (B)진피 구획 생성 후 24시간 종자 다층 파종. (C)미세 유체 장치 내부의 세포 배양 유지. (D)칩 내부의 피부의 단면 레크리에이션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

9. 셀 생존 가능성 분석

참고: 라이브/데드 키트는 생후 또는 죽은 상태에 따라 녹색 또는 빨간색 형광으로 세포를 얼룩지게 합니다. 적절한 생존 가능성 분화를 위해 비형성 hKC 및 hFB를 이 단계에서 사용해야 합니다. 절차의 모든 단계는 펌프 2와 UCi2를 통해 수행됩니다.

1. 50 μL/분에서 5분 동안 1x PBS로 상단 채널을 세척하여 배양 배지를 제거합니다.
2. 공기를 펌프하여 50 μL/분에서 1x PBS를 제거합니다.
3. 제조업체의 지시에 따라 칼신 AM/에티듐 호모디머-1 키트(Live/Dead) 솔루션을 준비하십시오.
4. 50 μL/분에서 2분 동안 라이브/데드 용액을 펌프합니다.
5. 어둠 속에서 37 °C에서 30 분 배양하십시오.
6. 1x PBS를 50 μL/분에서 2분 동안 펌핑하여 상단 채널을 세척하여 남은 시약을 제거합니다.
7. 공초점 현미경의 밑에 견본을 관찰합니다. 495/590 nm의 난동파장과 519/617 nm의 방출 파장을 라이브 및 죽은 세포에 각각 사용하십시오.

결과

설계 된 칩은 하부 챔버에서 성장 촉진 분자의 통과를 허용하여 세포의 성장을 허용하여 세포의 성장을 허용하는 5 μm 모공 크기의 PC 멤브레인에 의해 분리 된 두 개의 유체 챔버로 구성되어 있습니다. 상부 챔버는 조직 구조를 보유하고, 이 경우, hFB를 포함하는 피브린 하이드로 겔에 hKC의 단층.

채널의 높이는 각 채널에 추가된 접착제 시트 수에 따라 결정됩니다. 하부 챔버?...

토론

이 방법을 개발하는 동기는 피부 질환을 모델링하고 높은 처리량 플랫폼에서 새롭고 혁신적인 치료법의 효과를 연구하려는 욕구였습니다. 현재까지 이 실험실은 수동적으로 또는 3D 바이오 프린팅 기술의 도움으로 이러한 진모 표피 등가물을 생성합니다- 섬유아세포가 있는 피브린 젤은 세포 배양 삽입 플레이트에 삽입하고 그 위에 각질 세포를 파종합니다. 각질 세포가 합류하면 3D 배양은 각질 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amchafibrin	Rottafarm		Tranexamic acid
Antibiotic/antimycotic	Thermo Scientific HyClone
Calcium chloride	Sigma Aldrich
Culture plates	Fisher
DMEM	Invitrogen Life Technologies
Double-sided tape vynil	ATP Adhesive Systems		GM 107CC, 12 µm thick
Edge plotter	Brother		Scanncut CM900
FBS	Thermo Scientific HyClone
Fibrinogen	Sigma Aldrich		Extracted from human plasma
Glass slide	Thermo Scientific
GFP-Human dermal fibroblasts	-		Primary. Gift from Dr. Marta García
H2B-GFP-HaCaT cell line	ATCC		Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García
Live/dead kit	Invitrogen
PBS	Sigma Aldrich
Polycarbonate membrane	Merk TM		5 µm pore size
Polydimethylsiloxane	Dow Corning		Sylgard 184
Sodium chloride	Sigma Aldrich
Syringes	Terumo		5 mL
Thrombin	Sigma Aldrich		10 NIH/vial
Transparent adhesive vinyl	Mactac		JT 8500 CG-RT, 95 µm thick
Trypsin/EDTA	Sigma Aldrich
Tubing	IDEX		Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID