수확 및 분해 : 생물막 방법 연구에서 간과 된 단계

요약

이 논문에서는 두 가지 표면 유형에서 세 가지 일반적인 생물막 수확 및 분해 기술, 수확 방법의 견고성 테스트 및 재현성을 높이기 위해 수확 및 분해 기술을 선택하고 최적화 할 때 고려해야 할 최소 정보를 시연하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.

초록

생물막 방법은 네 가지 별개의 단계로 구성됩니다: 관련 모델에서 생물막을 성장시키고, 성숙한 생물막을 처리하고, 표면으로부터 생물막을 수확하고, 덩어리를 분해하고, 샘플을 분석한다. 네 단계 중 수확과 분해는 가장 적게 연구되었지만 그럼에도 불구하고 테스트 편향의 가능성을 고려할 때 중요합니다. 이 기사는 세 가지 다른 표면에서 자란 생물막에 일반적으로 사용되는 수확 및 분해 기술을 보여줍니다. 광범위한 문헌 검토에서 수집 된 세 가지 생물막 수확 및 분해 기술에는 볼텍싱 및 초음파 처리, 긁기 및 균질화, 긁기, 볼텍싱 및 초음파 처리가 포함됩니다. 두 가지 표면 유형이 고려됩니다 : 경질 비 다공성 (폴리 카보네이트 및 붕규산염 유리)과 다공성 (실리콘). 또한 우리는 수확 기술을 보고 할 때 포함되어야하는 최소 정보에 대한 권장 사항과 편향을 검사하기위한 동반 방법을 제공합니다.

서문

생물막의 정의는 지난 수십 년 동안 진화해 왔으며 다양한 생물학적 및/또는 비생물학적 표면과의 미생물 연관성을 포함하며, 매트릭스 내에서 서로 다른 성장과 유전자 발현을 나타내는 비세포 성분^{1을 포함한다2}. 생물막은 건조와 같은 환경 스트레스로부터 보호를 제공하며 화학 소독제의 작용을 덜 효과적으로 만들어 미생물의 생존을 초래할 수 있습니다. 생물막 내의 생존자들은 잠재적으로 공중 보건 관심사인 병원성 미생물의 공급원을 제공할 수 있다³.

생물막 방법은 성장, 처리, 샘플링 (수확 및 분해) 및 분석의 네 단계로 구성됩니다. 사용자가 유기체 성장 조건, 온도, 배지 등을 결정하는 첫 번째 단계인 성장은 생물막 문헌4,5,6,7에서 가장 많이 고려되고 보고된다. 처리 단계는 성숙한 생물막^3,8,9에 대한 그들의 효능을 결정하기 위해 항미생물제 (예를 들어, 소독제)를 평가하거나 항미생물이 생물막 성장을 예방하거나 감소시키는 생성물의 능력을 결정하기 위해 표면에 혼입될 수 있다¹⁰. 세 번째 단계, 샘플링은, 그것이 성장하던 표면으로부터 생물막을 수확하고 제거된 덩어리를 분해하는 단계^3,8,11를 포함한다. 네 번째 단계인 분석은 실행 가능한 세포 계수, 현미경, 형광 측정, 분자 결과, 및/또는 매트릭스 성분 평가^8,9를 포함할 수 있다. 데이터 평가는 실험 결과에 대한 정보를 제공합니다. 네 가지 중 샘플링은 종종 가장 간과되는 단계인데, 이는 선택된 생물막 수확 및/또는 분해 기술이 100% 효과적이며, 종종 검증 없이 효과적이라고 가정하기 때문이다¹¹.

종종 균질한 것으로 간주되는 박테리아의 플랑크톤 현탁액은 분석 전에 간단한 볼텍싱이 필요합니다. 그러나 생물막은 미생물(원핵 및/또는 진핵생물), 외래다당류, 단백질, 지질, 세포외 DNA 및 숙주 세포로 구성된 복잡한 군집이다¹². 전통적인 플랑크톤 미생물 배양 방법을 넘어서는 단계는 표면에서 생물막을 적절하게 수확 한 다음 균질 한 단일 세포 현탁액으로 분해하기 위해 필요합니다. 광범위한 문헌 검토 (이 간행물에 포함되지 않은 정보)는 제거 및 응집 기술의 선택이 생물막에 존재하는 종, 생물막이 부착되는 표면 (비다공성 또는 다공성), 성장 표면에 대한 접근성 (쉽게 제거 가능한 쿠폰 또는 생물막이 성장하는 장치의 물리적 파괴)을 포함한 여러 요인에 의존한다는 것을 입증했습니다. 표면 기하학 (면적 및 모양), 성장 표면의 생물막 밀도 및 사용 가능한 실험실 장비.

생물막이 표면으로부터 수확될 때, 생성된 세포 현탁액은 이질적이다. 이러한 불균일한 현탁액이 정확하게 열거되려면, 개별 세포로 분해되어야 한다. 실행 가능한 플레이트 카운트는 콜로니 형성 단위가 하나의 박테리아에서 유래했다고 가정합니다. 생물막의 응집체가 성장 배지 상에 놓여진다면, 부정확한 추정으로 이어질 수 있는 개별 세포를 구별하는 것은 불가능하다. 예를 들어, 소독제 효능 시험 동안, 만약 치료가 대조군에 비해 표면으로부터 생물막을 매우 효과적으로 제거한다면, 로그 감소는 대조군에 비해 인위적으로 크게 나타날 수 있다. 한편, 생물막을 표면에 고정시키는 화학적 소독제는 대조군에 비해 더 낮은 로그 감소를 갖는 것으로 보일 것이다¹¹. 이러한 유형의 시나리오는 실험 데이터에 대한 편향된 해석으로 이어질 수 있습니다.

출판을 준비하면서, 문헌의 검토는 생물막을 수확하고 분해하는 일반적인 접근법이 긁힘, 면봉, 초음파 처리, 볼텍싱 또는 이들의 조합을 포함한다는 것을 결정했다. 긁는 것은 멸균 스틱, 주걱 또는 기타 도구가있는 표면에서 생물막을 물리적으로 제거하는 것으로 정의됩니다. 면봉은 면이 기울어진 스틱 또는 다른 고정 흡수성 물질로 표면으로부터 생물막을 제거하는 것을 말한다. 초음파 처리는 물을 통해 분포 된 초음파를 통해 표면에서 생물막이 파괴되는 것을 말합니다. 볼텍싱은 튜브 내부의 샘플의 액체 와류를 달성하기 위해 믹서를 사용하는 것을 말합니다. 균질화는 회전 블레이드를 사용하여 수확된 생물막 덩어리를 단일 세포 현탁액으로 전단합니다. 이 논문에서는 경질 / 비 다공성 및 다공성의 두 가지 표면 유형에 대한 세 가지 수확 및 분해 방법을 제시합니다.

연구자가 출판물의 방법 섹션에 포함시켜야하는 권장 최소 정보 목록이 제공됩니다. 우리는이 정보를 포함하면 다른 연구자가 자신의 연구를 재현 할 수 있기를 바랍니다. 완벽한 수확 및 분해 방법이 없으므로 기술을 확인하는 방법에 대한 권장 사항도 제공됩니다.

일반적인 성장 표면에서 생물막을 수확하고 분해하는 세 가지 일반적인 방법이 이 기사에서 입증된다. 이 정보를 통해 연구원은 생물막 테스트 방법의 전반적인 정밀도와 편향성을 더 잘 이해할 수 있습니다. 기술된 방법은 다음과 같다: (1) CDC 생물막 반응기에서 높은 유체 전단 하에서 폴리카보네이트 쿠폰(경질 비다공성 표면) 상에서 성장한 슈도모나스 aeruginosa 생물막은 생물막 수확 및 붕산을 달성하기 위해 볼텍싱과 초음파 처리의 다섯 단계 조합에 따라 수확 및 분해된다 (2) A P. aeruginosa 저유체 전단 하에서 점적 유동 반응기에서 붕규산염 유리 쿠폰 (경질 비다공성 표면) 상에서 성장한 생물막은 스크래핑 및 균질화를 사용하여 수확 및 분해된다 (3) 실리콘 튜빙 (다공성 표면)에서 성장한 에스케리치아 콜리 생물막은 스크래핑을 사용하여 수확 및 분해되고, 이어서 초음파 처리 및 볼텍싱된다.

프로토콜

1. 소용돌이 및 초음파 처리

1. 성숙한 P. aeruginosa ATCC 15442 생물막을 ASTM 표준 E25622에 따라 성장시켰다.
2. 48 시간의 성장 기간이 끝나면 ASTM 표준 E28718에 따라 생물막 및 샘플 쿠폰을 처리 할 준비를하십시오.
3. 무균적으로 오토클레이브 스플래시 가드를 화염 멸균된 포셉을 사용하여 멸균된 50mL 코니컬 튜브에 삽입합니다. 치료를받을 모든 튜브에 대해 반복하십시오. 제어 쿠폰 용 튜브에는 스플래시 가드가 필요하지 않습니다.
4. CDC 생물막 반응기로부터 무작위로 선택된 막대를 무균적으로 제거한다. 쿠폰을 헹구어 막대를 멸균 완충수 30mL에 부드럽게 담그어 느슨하게 부착된 세포를 제거합니다.
5. 막대를 벤치 상단과 평행하게 잡고 비어있는 멸균 된 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓고 화염 살균 된 Allen 렌치를 사용하여 세트 나사를 풀어 바이오 필름 코팅 쿠폰을 튜브에 떨어 뜨립니다. 원하는 쿠폰 수에 대해 반복하십시오. 스플래시 가드를 제거하고 살균을 위해 별도의 용기에 넣으십시오.
6. 5 mL 혈청학적 피펫을 사용하여, 4 mL의 피펫을 천천히 피펫으로 처리하거나 튜브 내로 제어하여 액체가 튜브 벽의 내부로 흐르도록 한다.
7. 쿠폰 아래의 기포가 옮겨지도록 튜브 바닥을 부드럽게 누릅니다. 각 추가 사이에 30 - 60초를 허용합니다.
8. 지정된 접촉 시간의 끝에서, 피펫 36 mL의 중화제를 처리(또는 대조군)가 적용된 것과 동일한 순서로 튜브에 넣었다.
   참고: 복합 처리 및 중화제의 최종 부피는 생물막 로그 밀도를 정확하게 결정하는 데 중요합니다.
9. 30 ± 5 초 동안 가장 높은 설정에서 각 튜브를 소용돌이치십시오. 완전한 소용돌이가 달성되었는지 확인하십시오.
   참고: 파손이 발생할 수 있는 유리 바이알에 스테인레스 스틸과 같은 무거운 쿠폰을 볼텍싱할 때는 주의해야 합니다.
10. 욕조당 최적의 튜브 수를 결정하고 실제 샘플을 처리하기 전에 시험관 랙 내에 배치하십시오. 여러 샘플을 처리하는 경우 초음파 처리조의 수온이 21 ± ^2oC인지 확인하십시오.
11. 욕조의 수위가 튜브의 액체 수준과 같도록 탈기 된 초음파 처리기에 현탁 된 튜브 랙에 튜브를 놓습니다. 45kHz에서 초음파 처리, 100 % 전력 및 30 ± 5 초 동안 정상 기능. 소용돌이 및 초음파 처리 사이클을 반복 한 다음 최종 소용돌이 (총 5 사이클)로 끝납니다.
    참고: 수확되고 분해된 생물막을 갖는 이들 튜브는 the100 또는 0 희석물이다.
12. 샘플을 완충된 물에 연속적으로 희석한다. 적절한 도금 방법을 사용하여 R2A 한천에 플레이트하십시오. 36 ± 2 ^oC에서 24 h 동안 인큐베이션한다. 사용 된 도금 방법에 따라 콜로니를 계산하고 데이터를 기록하십시오.

2. 긁기 및 균질화

1. 성숙한 P. aeruginosa ATCC 15442 생물막을 ASTM 표준 E264713에 따라 성장시킨다.
2. 샘플링 보드, 비이커의 95 % 에탄올, 알코올 버너, 지혈제, 쿠폰 제거 도구, 멸균 희석수가 함유 된 비커 및 쿠폰을 헹구기위한 희석 튜브를 포함하도록 샘플링 스테이션을 설정하십시오.
3. 펌프를 끕니다. 채널 커버를 제거하고 멸균 쿠폰 제거 도구 및 지혈제를 사용하여 쿠폰을 제거하고 생물막을 방해하지 않도록주의하십시오.
4. 45 mL의 멸균 희석수 (50 mL 원심분리 튜브에 담김)에 유체 운동으로 부드럽게 침지하여 쿠폰을 헹구십시오. 쿠폰을 제거하기 위해 즉시 움직임을 반전시킵니다.
5. 쿠폰을 멸균 희석수 45 mL가 들어있는 비이커에 넣으십시오. 멸균 주걱 또는 스크레이퍼를 사용하여 생물막으로 덮인 쿠폰 표면을 약 15초 동안 아래쪽 방향으로 긁어냅니다. 주걱이나 스크레이퍼를 비이커에서 저어서 헹구십시오. 긁어 모으고 헹굼하는 과정을 3-4 번 반복하여 쿠폰 표면이 완전히 커버되도록하십시오.
6. 쿠폰을 멸균 비이커 위에 60° 각도로 잡고 쿠폰 표면에 멸균 희석수 1mL를 피펫팅하여 쿠폰을 헹구십시오. 총 5 번의 헹굼을 반복하십시오. 비이커의 최종 부피는 50 mL이다.
   참고: 복합 처리 및 중화제의 최종 부피는 생물막 로그 밀도를 정확하게 결정하는 데 중요합니다.
7. 쿠폰이 분리되면 각 채널 덮개를 교체합니다.
8. 생물 안전 캐비닛에서 작업하면서 스크랩 된 생물막 샘플을 균질화하십시오. 멸균 균질기 프로브를 균질 기에 부착하고 프로브 팁을 액체에 넣고 균질 기를 켜고 20,500 rpm까지 램프하십시오.
9. 샘플을 30초 동안 균질화한다. RPM을 끄고 균질기를 끕니다.
10. 상기와 같이 9 mL의 멸균 희석 블랭크를 20,500 rpm에서 30 s 동안 균질화하여 생물막 샘플 사이의 프로브를 살균한다. 70% 에탄올로 된 9 mL 튜브를 30초 동안 균질화하고, 프로브를 분리하고, 에탄올 튜브에 1분 동안 방치한다. 두 개의 추가 희석 블랭크를 균질화한다.
    참고: 일회용 호모게나이저 프로브가 각 샘플에 사용될 수 있습니다.
11. 샘플을 완충된 물에 연속적으로 희석한다. 적절한 도금 방법을 사용하여 R2A 한천 상에 플레이트한다. 플레이트를 36± ^2oC에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 사용된 도금 방법에 따라 콜로니를 계수하고 데이터를 기록한다.

3. 긁기, 소용돌이 및 초음파 처리

1. 성숙한 에스케리치아 콜리 ATCC 53498 바이오필름을 실리콘 카테터 튜빙에서 성장¹⁰.
2. 샘플링 재료를 준비하십시오 : 헹굼 튜브, 멸균 원심 분리 튜브, 빈 멸균 페트리 접시, 화염 멸균 된 스테인레스 스틸 지혈제 및 가위, 타이머 및 통치자.
3. 펌프를 일시 중지 한 상태에서 70 % 에탄올을 사용하여 튜브 외부를 청소하십시오. 끝에서 2cm를 측정하여 커넥터에 부착된 영역을 피하고 튜브에 표시하여 절단 위치를 결정합니다.
4. 화염 살균 가위로 튜브를 2cm 마크로 자르고 빈 멸균 페트리 접시에 세그먼트를 놓습니다. 튜브를 70% 에탄올로 닦아내고 원위 단부를 폐튜브에 다시 연결합니다.
5. 튜브 세그먼트를 헹구어 플랑크톤 세포를 제거하십시오. 화염 멸균 포셉으로 튜브 세그먼트를 멸균 희석수 20mL에 부드럽게 담근 다음 즉시 제거하십시오. 세그먼트를 중화제 10mL에 넣습니다.
6. 화염 살균 포셉으로 튜브 세그먼트를 잡고 튜브의 모든 내부 영역이 긁힐 때까지 멸균 된 목재 어플리케이터 스틱으로 긁어 내십시오. 때때로 중화제 10mL에 스틱을 헹구고 세그먼트를 다시 샘플 튜브에 넣습니다. 스크랩된 튜빙 세그먼트는 ¹⁰⁰ 또는 0 희석이다.
   참고: 복합 처리 및 중화제의 최종 부피는 생물막 로그 밀도를 정확하게 결정하는 데 중요합니다.
7. 30 ± 5 초 동안 가장 높은 설정에서 각 튜브를 소용돌이치십시오. 욕조의 수위가 튜브의 액체 수준과 같도록 초음파 발생기에 현탁 된 튜브 랙에 튜브를 놓습니다. 45kHz에서 초음파 처리, 100 % 전력 및 30 ± 5 초 동안 정상 기능. 소용돌이 및 초음파 처리 사이클을 반복 한 다음 최종 소용돌이로 끝납니다.
   참고: 수확되고 분해된 바이오필름을 갖는 이 튜브는 ¹⁰⁰ 희석액이다.
8. 샘플을 완충된 물에 연속적으로 희석한다. 적절한 도금 방법을 사용하여 트립틱 콩 한천 상에 플레이트.
9. 플레이트를 36± 2 ^°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 사용 된 도금 방법에 따라 콜로니를 계산하고 데이터를 기록하며 산술 평균을 계산하십시오.

결과

수확 방법의 검증/확인
우리 실험실에서 수행 된 여러 연구는 단일 튜브 방법 (ASTM E2871)⁸을 사용하여 생물막 반응기 (ASTM E2562)²에서 자란 생물막을 효과적으로 수확하기 위해 볼텍싱 및 초음파 처리 능력을 조사했습니다.

P. aeruginosa ATCC 15442 생물막을 보로실리케이트 유리 쿠폰 상에서 ASTM E25622에 따라 성장시켰다.

토론

수확 및 분해 방법에 대한 최소 정보
과학계에 걸쳐 재현 가능한 생물막 데이터를 작성하려면 저자가 생물막 방법의 성장, 치료, 샘플링 및 분석 단계에 대해 가능한 한 많은 세부 사항을 포함시켜야합니다. 생물막 방법의 표준화는 연구자가 특정 방법과 관련 수정을 참조 할 수있게 해주기 때문에 이러한 노력에 도움이되었습니다. 그러나 많은 논문에는 생물막 수확 및 분해를 설?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical vials	Thermo Scientific	339652
100 mL glass beakers	Fisher Scientific	FB102100
5 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-12D	For adding treatment to vials containing coupons.
50 mL serological pipettes	Fisher Scientific	13-678-14C	For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.
Applicator sticks	Puritan	807
Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Metal spatula	Fisher Scientific	14-373
PTFE policemen	Saint-Gobain	06369-04
S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool	IKA	4446700	For homogenization of biofilm samples.
Scissors	Fisher Scientific	08-951-20
Silicone Foley catheter, size 16 French	Medline Industries	DYND11502
Silicone tubing, size 16	Cole-Parmer	EW96400-16
Splash Guards	BioSurface Technologies, Inc.	CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser	IKA	3737001	For homogenization of biofilm samples.
Tubing connectors	Cole-Parmer	EW02023-86
Ultrasonic Cleaner	Elma	TI-H15
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder	Scientific Industries	SI-V506