R-Loops 및 RNA:DNA 하이브리드를 S9.6 기반 면역침전법을 사용한 매핑

요약

R-loops는 DNA 염기서열과 위상학적 호의성에 따라 모든 게놈에서 발생하는 전사 유도 non-B DNA 구조의 일반적인 부류를 구성합니다. 최근 몇 년 동안 R-loops는 다양한 적응 및 부적응 역할과 관련이 있으며 인간 장애의 맥락에서 게놈 불안정성과 관련이 있습니다. 결과적으로, 게놈에서 이러한 구조를 정확하게 매핑하는 것은 많은 연구자들에게 높은 관심사입니다. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation에 이은 고처리량 염기서열분석)가 여기에 설명되어 있습니다. R-루프의 정확한 반정량적 매핑을 허용하는 강력하고 재현 가능한 기술입니다. 이 방법의 최근 반복은 R-루프의 가닥 특이적 및 고해상도 매핑을 허용하는 초음파 처리(sDRIP-seq)를 사용하여 단편화가 수행되는 방식도 설명되어 있습니다. 따라서 sDRIP-seq는 해상도 및 좌초 측면에서 DRIP-seq 방법의 일반적인 제한 사항 중 일부를 해결하여 R-루프 매핑에 선택되는 방법입니다.

초록

R-loops는 DNA 염기서열과 위상학적 호의성에 따라 모든 게놈에서 발생하는 전사 유도 non-B DNA 구조의 일반적인 부류를 구성합니다. 최근 몇 년 동안 R-loops는 다양한 적응 및 부적응 역할과 관련이 있으며 인간 장애의 맥락에서 게놈 불안정성과 관련이 있습니다. 결과적으로, 게놈에서 이러한 구조를 정확하게 매핑하는 것은 많은 연구자들에게 높은 관심사입니다. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation에 이은 고처리량 염기서열분석)가 여기에 설명되어 있습니다. R-루프의 정확한 반정량적 매핑을 허용하는 강력하고 재현 가능한 기술입니다. 이 방법의 최근 반복은 R-루프의 가닥 특이적 및 고해상도 매핑을 허용하는 초음파 처리(sDRIP-seq)를 사용하여 단편화가 수행되는 방식도 설명되어 있습니다. 따라서 sDRIP-seq는 해상도 및 좌초 측면에서 DRIP-seq 방법의 일반적인 제한 사항 중 일부를 해결하여 R-루프 매핑에 선택되는 방법입니다.

서문

R-루프는 초기 RNA 전사체가 주형 DNA 가닥에 혼성화될 때 전사하는 동안 주로 형성되는 3가닥 핵산 구조입니다. 그 결과 RNA:DNA 하이브리드가 형성되고 단일 가닥 루프 상태에서 비템플릿 DNA 가닥이 변위됩니다. 생화학적 재구성 ^1,2,3,4 및 수학적 모델링⁵은 다른 생물물리학적 측정^6,7과 함께 R-루프가 특정 유리한 특성을 나타내는 영역에서 발생할 가능성이 더 높다는 것을 확인했습니다. 예를 들어, 구아닌(G)과 시토신(C)의 분포에서 가닥 비대칭을 나타내어 RNA가 G-rich인 영역, 즉 positive GC skew라고 하는 특성은 DNA duplex⁸에 비해 DNA:RNA hybrid의 열역학적 안정성이 더 높기 때문에 전사할 때 R-loops를 형성하는 데 선호됩니다. 많은 진핵생물 유전자 ^4,9,10,11의 초기 부분과 같이 양성 GC 스큐를 진화시킨 영역은 in vitro 및 in vivo ^3,4,12와 같이 R-loops를 형성하는 경향이 있습니다. 음의 DNA 초나선 응력은 또한 구조 형성에 크게 유리합니다^13,14 R-루프는 이러한 위상 응력을 효율적으로 흡수하고 주변 DNA 섬유를 유리한 이완 상태로 되돌리기 때문입니다 ^5,15.

역사적으로 R-loop 구조는 전사 중 RNA와 DNA의 드물고 자발적인 얽힘으로 인해 발생하는 것으로 간주되었습니다. 그러나 고처리량 DNA 염기서열분석(DRIP-seq)과 결합된 DNA:RNA 면역침전(DRIP)의 개발로 R-루프의 첫 번째 게놈 전체 매핑이 가능해졌으며 이러한 구조가 인간 세포에서 예상보다 훨씬 더 널리 퍼져 있음을 밝혔습니다 ^4,16. R-loops는 포유류 게놈에서 수만 개의 보존되고 전사된 유전자 핫스팟에서 발생하며, 유전자의 첫 번째 인트론과 수많은 유전자의 말단 영역과 겹치는 GC-skewed CpG 섬에 대한 선호가 있습니다¹⁷. 전반적으로 R-loops는 인간 세포 게놈의 3%-5%를 집합적으로 차지하며, 이는 효모, 식물, 파리 및 생쥐를 포함한 다른 유기체의 측정과 일치합니다 18,19,20,21,22.

인간 세포에서 R-loop 형성 핫스팟을 분석한 결과, 이러한 영역이 특정 염색질 서명과 연관되어 있음이 밝혀졌습니다²³. R-루프는 일반적으로 뉴클레오솜 점유율이 낮고 RNA 중합효소 밀도가 높은 영역에서 발견됩니다. 프로모터에서 R-loops는 두 개의 공동 전사 증착 히스톤 변형, H3K4me1 및 H3K36me3¹⁷의 증가된 모집과 관련이 있습니다. 유전자 말단에서, R-loops는 이전 관찰²⁴과 일치하는 효율적인 전사 종결¹⁷을 겪는 밀접하게 배열된 유전자와 연관됩니다. R-loops는 또한 박테리오파지, 플라스미드, 미토콘드리아 및 효모 게놈 25,26,27,28,29,30,31의 복제 기원에서 DNA 복제 시작에 참여하는 것으로 나타났습니다. 또한, R-루프가 발생하기 쉬운 인간 CpG 아일랜드 프로모터의 76%는 초기의 구성적 복제 기원 ^32,33,34,35로 기능하여 R-루프와 복제 기원 사이의 연결을 더욱 강화합니다. 종합적으로, 이러한 연구는 R-루프가 상황에 따른 방식으로 특정 생물학적 출력을 유발할 수 있는 새로운 유형의 생물학적 신호를 나타낸다는 것을 시사합니다²³.

초기에 R-loops는 면역글로불린 클래스 스위치 재조합 과정 동안 클래스 스위치 시퀀스에서 형성되는 것으로 나타났습니다 ^3,36,37. 이러한 프로그래밍된 R-루프는 이중 가닥 DNA 절단(double-stranded DNA break)³⁸의 도입을 통해 클래스 스위치 재조합을 시작하는 것으로 생각된다. 그 이후로, 일반적으로 과도한 R-loop 형성으로 인해 발생하는 것으로 이해되는 유해한 R-loop 형성은 게놈 불안정성 및 hyper recombination, transcription-replication collisions, replication 및 transcriptional stress와 같은 과정과 관련이 있습니다(검토 39,40,41,42,43). 결과적으로, R-loop 구조의 개선된 매핑은 건강과 질병에서 이러한 구조의 분포와 기능을 더 잘 해독하기 위한 흥미롭고 필수적인 도전입니다.

DNA:RNA 면역침전(DRIP)은 DNA:RNA 하이브리드⁴⁴에 대한 S9.6 단클론 항체의 높은 친화력에 의존합니다. DRIP-seq는 R-loop 형성 ^4,45의 강력한 게놈 전체 프로파일링을 허용합니다. 이 기술은 유용하지만 부드러운 DNA 단편화를 달성하기 위해 제한 효소가 사용된다는 사실로 인해 해상도가 제한되어 있습니다. 또한 DRIP-seq는 R-루프 형성의 방향성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 여기에서는 가닥 특이적 방식으로 고해상도에서 R-루프를 매핑할 수 있는 DRIP-seq의 변형을 보고합니다. 이 방법은 면역 침전 전에 게놈을 단편화하기 위해 초음파 처리에 의존하며, 따라서이 방법을 sDRIP-seq (초음파 처리 DNA : RNA 면역 침전과 고 처리량 시퀀싱과 결합)라고합니다 (그림 1). 초음파 처리를 사용하면 분해능을 높일 수 있으며 DRIP-seq 접근법⁴⁶에서 관찰되는 제한 효소 결합 단편화 편향을 제한할 수 있습니다. sDRIP-seq는 DRIP-seq 및 이전에 설명한 고분해능 DRIPc-seq 방법의 결과와 매우 일치하는 R-루프 맵을 생성하며, 이 방법에서는 면역침전된 R-루프 구조의 RNA 가닥으로부터 염기서열분석 라이브러리가 구축됩니다⁴⁵.

선택할 수 있는 방법이 너무 많아짐에 따라 사용자는 자신의 요구에 어떤 특정 DRIP 기반 접근 방식이 더 선호되는지 궁금할 수 있습니다. 우리는 다음과 같은 조언을 제공합니다. DRIP-seq는 한계에도 불구하고 기술적으로 가장 쉽고 여기에서 논의된 세 가지 방법 중 가장 강력한(가장 높은 수율) 방법입니다. 따라서 널리 유용합니다. 새로운 데이터 세트에 대한 유용한 비교 지점을 제공하는 수많은 DRIP-seq 데이터 세트가 게시되었습니다. 마지막으로, 생물정보학 분석 파이프라인은 데이터가 좌초되지 않기 때문에 더 간단합니다. 신규 사용자는 DRIP을 사용하여 R-loop 매핑 기술을 연마한 다음 qPCR(quantitative polymerase chain reaction) 및 DRIP-seq를 사용하는 것이 좋습니다. sDRIP-seq는 약간 더 높은 수준의 기술적 난이도를 나타냅니다 : 초음파 처리 (아래 논의)로 인해 수율이 약간 감소하고 시퀀싱 라이브러리 프로세스가 약간 더 복잡합니다. 그러나 좌초성과 더 높은 해상도의 이점은 매우 중요합니다. sDRIP-seq는 2가닥 RNA:DNA 하이브리드와 3가닥 R-루프를 모두 캡처합니다. 라이브러리 구축 단계로 인해 DRIP-seq는 2가닥 RNA:DNA 하이브리드를 캡처하지 않습니다. DRIPc-seq는 기술적으로 가장 까다롭고 더 많은 양의 출발 물질이 필요합니다. 그 대가로 최고의 해상도와 좌초성을 제공합니다. 염기서열분석 라이브러리는 R-루프 또는 하이브리드의 RNA 부분으로 구축되기 때문에 DRIPc-seq는 특히 S9.6이 dsRNA ^19,47,48에 대한 잔류 친화도를 가지고 있기 때문에 RNA 오염 가능성이 있을 수 있습니다. sDRIP-seq는 염기서열분석 라이브러리가 DNA 가닥에서 파생되기 때문에 RNA 오염에 대한 걱정 없이 가닥 특이적 고해상도 매핑이 가능합니다. 전반적으로 이 세 가지 방법은 여전히 유용하며 복잡성의 정도가 다르고 주의 사항이 약간 다릅니다. 그러나 세 가지 모두 매우 일치하는 데이터 세트⁽⁴⁸)를 생성하고 RNase H 전처리에 매우 민감하며, 이는 신호 특이성(signal specificity)^45,49를 보장하기 위한 필수 대조군을 나타냅니다. 염기서열분석 라이브러리에 부과된 크기 선택을 감안할 때, 지연된 가닥 DNA 복제 프라이밍 부위(Okazaki 프라이머) 주변에서 일시적으로 형성되는 것과 같은 작은 하이브리드(추정 <75 bp)는 제외될 것입니다. 마찬가지로, 모든 DRIP 방법은 DNA 단편화를 포함하기 때문에 안정성을 위해 negative DNA supercoiling이 필요한 불안정한 R-loop는 손실됩니다⁵. 따라서 DRIP 접근법은 특히 생체 내 접근법을 사용하여 가장 잘 포착할 수 있는 짧고 불안정한 R-루프의 경우 R-루프 부하를 과소평가할 수 있습니다^45,48. R-루프는 또한 중아황산나트륨 처리 후 단일 DNA 분자에서 깊은 범위, 고분해능 및 가닥 특이적 방식으로 S9.6 독립적인 방식으로 프로파일링할 수 있습니다¹². 또한, 촉매 비활성 RNase H1 효소를 사용하는 전략은 생체 내에서 네이티브 R-루프를 매핑하기 위해 사용되었으며, 주로 일시 중지된 프로모터에서 형성되는 짧고 불안정한 R-루프를 강조합니다 50,51,52.

프로토콜

다음 프로토콜은 배양에서 성장한 인간 Ntera-2 세포주에 최적화되어 있지만, 다른 인간 세포주(HEK293, K562, HeLa, U2OS), 일차 세포(섬유아세포, B 세포) 및 변형이 적은 다른 유기체(마우스, 파리)에 변형 없이 성공적으로 적용되었습니다.

1. 세포 수확 및 용해

1. Ntera-2 세포를 75%-85% 포화도로 배양합니다. 최적의 세포 수가 5-600만 개의 세포이고 >90%의 생존 가능한 세포로 DRIP 절차를 시작할 수 있는지 확인합니다.
2. 1x PBS로 세포를 한 번 세척하고 1.5mL의 Trypsin-EDTA 1x를 첨가한 다음 세포가 접시에서 분리될 때까지 37°C에서 2분 동안 배양합니다.
3. 5mL의 따뜻한 배지와 피펫 웰을 첨가하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 재현탁합니다. 내용물을 새 15mL 튜브에 옮기고 300 x g 에서 3분 동안 세포를 부드럽게 펠릿화합니다.
4. 5mL의 1x PBS로 세포를 한 번 세척하고 300 x g 에서 3분 동안 세포를 부드럽게 펠릿화합니다.
5. 1.6mL의 TE 완충액(10mM Tris-Cl pH 7.5, 1mM EDTA pH 8.0)에 세포를 완전히 재현탁합니다. 5μL의 proteinase K(20mg/mL 원액)와 50μL의 SDS(20% 원액)를 넣고 용액이 점성이 될 때까지 튜브를 5회 부드럽게 뒤집습니다. 용액을 피펫팅하려고 하지 말고 반전으로만 혼합하십시오.
6. 37°C에서 밤새 튜브를 배양합니다.

2. DNA 추출

1. DNA 용해물을 미리 방사된 15mL 고밀도 위상 잠금 겔 튜브에 붓고 페놀/클로로포름 이소아밀 알코올(25:24:1) 1부피(1.6mL)를 추가합니다. 부드럽게 5회 뒤집고 1,500 x g 에서 5분 동안 스핀다운합니다.
2. 새 15mL 튜브에 3M 아세트산나트륨(NaOAc)(pH 5.2) 1/10과 100% 에탄올 2.5부피를 추가합니다. 위상 잠금 겔 튜브에서 상단 수성상을 붓고 DNA가 완전히 침전될 때까지(최대 10분) 부드럽게 반전시킵니다.
3. 구멍이 넓은 1,000 μL 팁을 사용하여 DNA 스레드를 스풀링하고 잔류 상등액이 전달되지 않도록 주의하면서 깨끗한 2 mL 튜브로 옮깁니다.
4. 1.5mL의 80% 에탄올을 첨가하여 DNA를 세척하고 튜브를 5회 부드럽게 뒤집습니다. 10분 동안 배양합니다.
5. 이전 단계를 두 번 반복합니다. 세척 단계에서 원심분리하지 마십시오. DNA를 방해하지 않도록 마지막 세척 후 피펫팅을 통해 가능한 한 많은 에탄올을 조심스럽게 제거하십시오.
6. 튜브를 뒤집는 동안 DNA가 공기 중에서 완전히 건조되도록 합니다. 이 단계는 DNA의 양에 따라 30분에서 1시간이 소요될 수 있습니다.
7. DNA 펠릿에 125 μL의 TE 완충액을 직접 첨가하여 제한 효소 분해를 통해 DNA를 단편화하거나 100 μL의 TE 완충액을 첨가하여 초음파 처리를 통해 DNA를 전단합니다. 얼음 위에 1시간 동안 보관하고 넓은 구멍의 200 μL 팁으로 몇 차례 피펫팅하여 DNA를 부드럽게 재현탁시킵니다. 단편화 단계를 시작하기 전에 1시간 동안 얼음 위에 두십시오.

3. DNA 단편화

참고: 제한 효소 기반 DRIP-seq의 경우 3.1단계를 따르십시오. 초음파 처리 기반 DRIP-seq의 경우 3.2단계로 건너뜁니다.

1. 제한 효소(RE) 단편화
   1. 공급자의 지침에 따라 RE 칵테일을 사용하여 재현탁된 게놈 DNA(매우 점성이 있음)를 분해합니다.
      1. 최종 반응에 0.1mM 스페르미딘을 추가합니다. 총 부피 150μL에 각 효소 30U가 포함된 4-5개의 효소 칵테일을 사용합니다.
         참고: DRIP-seq(HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)⁴ 에 대한 초기 칵테일은 5킬로베이스의 평균 단편 길이를 생성하기 위해 개발되었습니다. CpG 메틸화에 대한 간섭을 피하고 게놈의 GC가 풍부한 영역을 절약하십시오. 다른 칵테일도 가능합니다¹⁶). 이 칵테일은 인간 게놈과 마우스 게놈 모두에 적합하지만 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
      2. 반응 혼합물을 37°C에서 밤새 배양합니다.
         참고: 분해 후 DNA 혼합물은 더 이상 점성이 없어야 합니다. 이 단계에서 점도가 남아 있으면 분해가 완료되지 않았음을 나타냅니다.
      3. 관찰되는 경우 각 효소를 10U씩 추가하고 37°C에서 2-4시간 더 배양합니다.
         참고: 사용자는 여기에서 권장하는 것보다 더 많은 세포를 수확한 경우 전체 펠릿을 소화하지 못할 수 있습니다.
   2. 하룻밤 사이에 분해된 DNA(150μL)를 미리 방적된 2mL 위상 잠금 젤 라이트 튜브에 부드럽게 피펫팅합니다. 물 100μL와 페놀/클로로포름 이소아밀 알코올 1량(250μL)을 추가합니다(25:24:1). 부드럽게 5회 뒤집고 16,000 x g 에서 10분 동안 회전합니다.
   3. 새 1.5mL 튜브에 글리코겐 1.5μL, 3M NaOAc(pH 5.2) 1/10 부피 및 100% 에탄올 2.5부피를 추가합니다. 위상 잠금 겔 튜브의 DNA를 피펫팅하고 5회 반전하여 혼합합니다. -20 °C에서 1 시간 동안 배양합니다.
   4. 16,000 x g 에서 4°C에서 35분 동안 회전합니다. DNA를 200 μL의 80% 에탄올로 세척하고 16,000 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 회전합니다.
   5. 펠릿을 자연 건조하고 펠릿에 50μL의 TE 완충액을 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 30분 동안 그대로 두고 DNA를 부드럽게 재현탁합니다.
   6. 분광 광도계를 사용하여 단편화된 DNA의 농도(OD₂₆₀)를 측정합니다.
   7. 선택 사항이지만 권장: 0.8% 아가로스 젤에 분해된 DNA 1μg을 크기 마커와 함께 로드하여 분해가 완료되었는지 확인합니다. 100V에서 한 시간 동안 젤을 실행합니다.
      참고: 불완전한 경우 추가 효소를 추가할 수 있습니다. 불완전한 소화는 면역침전 후 해상도 상실로 이어질 수 있습니다.
   8. 이 단계 후, 37°C에서 1-2시간 동안 4μL의 리보뉴클레아제 H(RNase H)로 분해된 DNA 10μg을 처리하여 면역침전 시 검색된 신호가 DNA:RNA 하이브리드에서 파생되었는지 확인합니다. 그런 다음 S9.6 면역침전(4단계)으로 진행합니다.
      참고: 소화된 DNA는 수율의 큰 손실 없이 최대 1개월 동안 -80°C에서 냉동 상태로 유지할 수 있습니다.
2. 쥡니다
   1. 추출된 DNA의 전부 또는 일부를 0.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 총 100μL 부피로 초음파 처리합니다. 초음파 발생기에서 30 초 ON / 30 초 OFF의 15-20 사이클을 수행합니다 (균일 한 초음파 처리를 보장하기 위해 5, 10 및 15 사이클 후에 회전).
   2. 분광 광도계에서 초음파 처리된 DNA의 농도(OD₂₆₀)를 측정합니다.
      참고: 이 단계에서 DNA의 점도가 사라졌어야 합니다.
   3. 아가로스 겔을 실행하여 초음파 처리된 DNA(300-500bp)의 크기 분포를 확인합니다.
      참고: DNA를 과도하게 초음파 처리하면 R-루프 구조의 파손 및 해리로 인한 수율이 크게 감소할 수 있습니다.
   4. 이 단계 후, 37 ° C에서 1-2 시간 동안 10 μg의 초음파 처리 된 DNA를 4 μL의 RNase H로 처리하여 면역 침전 시 검색된 신호가 DNA:RNA 하이브리드에서 파생되도록 합니다. 그런 다음 S9.6 면역침전(4단계)으로 진행합니다.

4. S9.6 면역침전

참고: 면역침전 단계는 DNA가 RE 또는 초음파 처리를 통해 단편화되었는지 여부에 관계없이 유사합니다.

1. 3개의 튜브를 준비하고 튜브당 500μL의 TE 완충액의 최종 부피에서 4.4μg의 단편화된 DNA를 분취합니다. 각 튜브에서 50 μL(부피의 1/10)을 저장하여 나중에 입력 DNA로 사용할 수 있습니다.
2. 희석된 DNA 450μL에 50μL의 10x 결합 완충액(100mM NaPO4 pH 7, 1.4M NaCl, 0.5% Triton X-100) 및 10μL의 S9.6 항체(1mg/mL)를 추가합니다.
3. 4 °C에서 7-10 rpm의 미니 튜브 로테이터로 밤새 배양합니다.
4. 각 튜브에 대해 50μL의 단백질 A/G 아가로스 비드 슬러리를 700μL의 1x 결합 완충액으로 세척하여 미니 로테이터의 튜브를 실온에서 10분 동안 7-10rpm으로 뒤집습니다. 1,100 x g 에서 1분 동안 비드를 스핀다운하고 상층액을 버립니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
5. 4.3단계의 DNA를 50μL의 비드에 추가하고 미니 로테이터에서 7-10rpm으로 반전하면서 4°C에서 2시간 동안 배양합니다.
6. 1,100 x g 에서 1분 동안 비드를 스핀다운하고 상층액을 버립니다.
7. 미니 로테이터에서 7-10rpm으로 15분 동안 반전하여 750μL의 1x 결합 버퍼로 비드를 세척합니다. 1,100 x g 에서 1분 동안 스핀다운하고 상층액을 버립니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
8. 250μL의 용출 완충액(50mM Tris-Cl pH 8, 10mM EDTA pH 8, 0.5% SDS) 및 7μL의 proteinase K(20mg/mL stock)를 비드에 추가하고 55°C(12rpm)에서 45분 동안 회전하면서 배양합니다.
9. 1,100 x g에서 1분 동안 구슬을 돌립니다. 상층액을 미리 방사된 2mL 위상 잠금 젤 라이트 튜브로 옮기고 페놀/클로로포름 이소아밀 알코올(25:24:1) 1부피(250μL)를 추가합니다. 튜브를 5회 뒤집고 실온에서 16,000 x g 에서 10분 동안 회전합니다.
10. 새 1.5mL 튜브에 글리코겐 1.5μL, 3M NaOAc(pH 5.2) 1/10 및 100% 에탄올 2.5부피를 추가합니다. 위상 잠금 겔 튜브의 DNA를 피펫팅하고 5회 반전하여 혼합합니다. -20 °C에서 1 시간 동안 배양합니다.
11. 16,000 x g 에서 4°C에서 35분 동안 회전합니다. DNA를 200 μL의 80% 에탄올로 세척하고 16,000 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 회전합니다.
12. 펠릿을 자연 건조시키고 각 튜브에 15μL의 10mM Tris-Cl(pH 8)을 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 20분 동안 그대로 두었다가 부드럽게 다시 매달아 둡니다. 3개의 튜브의 내용물을 하나의 튜브(45μL)로 결합합니다.
13. 45 μL 재현탁 DNA 중 5 μL를 사용하여 qPCR로 DRIP 효율을 확인합니다( 대표 결과 참조). 물 10μL에 5μL를 희석하고 반응당 2μL를 사용합니다.

5. 초음파 처리된 DNA만을 위한 사전 라이브러리 단계

참고 : 초음파 처리는 R- 루프의 변위 된 ssDNA 가닥을 끊습니다. 따라서, 3 가닥 R- 루프 구조는 초음파 처리시 2 가닥 DNA : RNA 하이브리드로 변환됩니다. 결과적으로, 이러한 DNA:RNA 하이브리드는 라이브러리 구축 전에 이중 가닥 DNA로 다시 전환되어야 합니다. 여기서, 제2 가닥 합성 단계가 채용된다. 성공적으로 사용된 대안적인 접근법은 대신 단일 가닥 DNA 접합을 수행한 후 두 번째 가닥 합성을 수행하는 것입니다⁵³.

1. 4.12단계에서 DRIP'ed DNA 40μL에 5x 2차 가닥 완충액 20μL(200mM Tris pH 7, 22mM MgCl₂, 425mM KCl), 10mM dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTT 또는 사용자가 가닥 특이적 DRIP 염기서열분석을 달성하려는 경우 dTTT 또는 dUTP), 1μL 16mM NAD, 및 32μL 물. 잘 섞어 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
2. DNA polymerase I (10 units) 1 μL, RNase H 0.3 μL (1.6 units) 및 E. coli DNA ligase 0.5 μL를 추가합니다. 혼합하고 16 ° C에서 30 분 동안 배양합니다.
3. 즉시 1.6x 비율의 상자성 비드를 사용하여 반응을 청소합니다. DNA를 40μL의 10mM Tris-Cl(pH 8)로 용리합니다.

6. RE DNA에 대해서만 사전 라이브러리 초음파 처리 단계

참고: DRIP은 길이가 킬로베이스인 경우가 많아 즉각적인 라이브러리 구축에 적합하지 않은 RE 프래그먼트를 복구합니다.

1. 라이브러리 구축을 위한 물질의 크기를 줄이려면 0.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 면역침전된 DNA를 초음파 처리합니다. 초음파 발생기에서 15 초 ON / 60 초 OFF의 12 사이클을 수행합니다 (균일 한 초음파 처리를 위해 6 사이클 후에 회전). 7단계로 진행합니다.
   참고 : 면역 침전 된 물질은 여전히 측면 이중 가닥 DNA와 다르게 초음파 처리에 반응하는 3 가닥 R- 루프를 가지고 있습니다.
2. 선택 단계: DRIP 프로파일을 균일하게 하려면 초음파 처리 전에 37°C에서 1시간 동안 1x RNase H 버퍼에 1μL의 RNase H로 면역침전된 물질을 처리합니다.

7. 도서관 건설

1. 4.12단계(RE 단편화) 또는 5.3단계(초음파 처리, 전단)의 40μL에 10x 말단 수리 모듈 완충액 5μL, 10mM ATP 2.5μL 및 말단 복구 모듈 효소 2.5μL(총 50μL)를 추가하여 말단 복구를 수행합니다. 잘 섞어 실온에서 30분 동안 배양합니다. 1 μg의 RE-digested and sonicated (DRIP) 또는 sonicated (sDRIP) input DNA를 포함하여 input DNA에 해당하는 control sequencing library를 생성합니다.
2. 상자성 비드(1.6x 비율)를 사용하여 반응을 세척하고 34μL의 10mM Tris-Cl(pH 8)에서 용리합니다.
3. 5 μL의 버퍼 2, 10 μL의 1 mM dATP 및 1 μL의 Klenow exo-(총 50 μL)를 추가하여 A-tailing을 수행합니다. 잘 섞고 혼합물을 37 ° C에서 30 분 동안 배양합니다.
4. 상자성 비드(1.6x 비율)를 사용하여 반응을 정리하고 12μL의 10mM Tris-Cl(pH 8)에서 용리합니다.
5. 15 μL의 2x 퀵 ligation buffer, 1 μL의 15 μM adapters, 2 μL의 quick ligase(총 30 μL)를 추가하여 어댑터를 접합합니다. 잘 섞어 실온에서 20분 동안 배양합니다.
6. 상자성 비드(1x 비율)를 사용하여 반응을 정리하고 20μL의 10mM Tris-Cl(pH 8)에서 용리합니다.
7. 초음파 전단을 수행하고 5.1 단계에서 dUTP를 사용한 경우 1.5 μL (1.5 U)의 Uracil N-glycosylase를 첨가하고 37 ° C에서 30 분 동안 배양하여 가닥 특이적 DRIP를 얻습니다.
8. PCR은 6.6단계 또는 6.7단계에서 라이브러리의 10μL를 증폭합니다. PCR 프라이머 1.0 P5 1μL( 재료 표 참조), PCR 프라이머 2.0 P7 1μL( 재료 테이블 참조), 마스터 믹스 15μL 및 물 3μL를 추가합니다. 잘 섞는다.
9. 열 순환기에서 표 1과 같이 프로그램을 실행합니다.
10. 상자성 비드를 사용하여 라이브러리의 2단계 정리를 진행합니다. 먼저 0.65x의 비율을 사용하여 500bp 이상의 단편을 제거합니다. 상층액을 유지하십시오. 상층액에서 1x 비율로 진행하여 200bp 미만의 단편을 제거합니다. 10mM Tris-HCl(pH 8)의 12μL에서 용리합니다.

8. 품질 관리

1. Pfaffl 방법을 사용하여 2개의 음성 유전자 자리와 3개의 양성 유전자 자리에서 qPCR로 R-loop enrichments를 확인하려면 6.10단계의 정리 라이브러리 1μL를 사용합니다. 라이브러리 1μL를 물 10μL에 희석하고 유전자좌당 2μL를 사용합니다.
2. 고감도 DNA 키트를 사용하여 6.10단계에서 클린업된 라이브러리의 크기 분포를 확인합니다.

결과

DRIP과 sDRIP은 qPCR(그림 2A) 및/또는 염기서열분석(그림 2B)을 통해 분석할 수 있습니다. 면역침전 단계 후에는 먼저 양성 및 음성 대조군 유전자좌에 대한 qPCR과 RNase H 처리 대조군으로 실험의 품질을 확인해야 합니다. 여러 인간 세포주에서 자주 사용되는 유전자 자리에 해당하는 프라이머는 표 2에 나와 있습니다. qPC...

토론

여기에는 S9.6 항체를 사용하여 잠재적으로 모든 유기체에서 R-loop 구조를 매핑하는 두 가지 프로토콜이 설명되어 있습니다. DRIP-seq는 개발된 최초의 게놈 전체 R-루프 매핑 기술을 나타냅니다. 이는 쉽고 강력하며 재현 가능한 기술로, 모든 게놈을 따라 R-루프의 분포를 매핑할 수 있습니다. sDRIP-seq라고 하는 두 번째 기술도 견고하고 재현성이 높지만 초음파 처리 단계와 좌...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL tube High density Maxtract phase lock gel	Qiagen	129065
2 mL tube phase lock gel light	VWR	10847-800
Agarose A/G beads	ThermoFisher Scientific	20421
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881
AmpErase Uracil N-glycosylase	ThermoFisher Scientific	N8080096
Index adapters	Illumina		Corresponds to the TrueSeq Single indexes
Klenow fragment (3’ to 5’ exo-)	New England BioLabs	M0212S
NEBNext End repair module	New England BioLabs	E6050
PCR primers for library amplification			primer 1.0 P5 (5’ AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3’)
PCR primers for library amplification			PCR primer 2.0 P7 (5’ CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT 3’)
Phenol/Chloroform Isoamyl alcohol 25:24:1	Affymetrix	75831-400ML
Phusion Flash High-Fidelity PCR master mix	ThermoFisher Scientific	F548S
Quick Ligation Kit	New England BioLabs	M2200S
Ribonuclease H	New England BioLabs	M0297S
S9.6 Antibody	Kerafast	ENH001	These three sources are equivalent
S9.6 Antibody	Millipore/Sigma	MABE1095
S9.6 Antibody	Abcam	ab234957