[18F]FDG 마이크로 PET/MR 이미징을 사용한 마우스의 갈색 및 베이지 지방 조직의 시각화 및 정량화

요약

마이크로 PET/MR 이미징 기반 접근법을 사용하여 마우스에서 열원성 지방 창고의 기능적 이미징 및 정량화.

초록

갈색과 베이지 색 지방세포는 이제 비만 및 대사 증후군의 잠재적 인 치료 대상으로 인식되고 있습니다. 비침습적 분자 이미징 방법은 이러한 열원성 지방 창고에 대한 중요한 통찰력을 제공하는 데 필수적입니다. 여기서, 프로토콜은 마우스 견갑골 간 갈색 지방 조직 (iBAT) 및 사타구니 피하 백색 지방 조직 (iWAT)에서 갈색 및 베이지 색 지방세포의 활성을 평가하기위한 PET / MR 이미징 기반 방법을 제시합니다. 열원성 지방 데포의 시각화 및 정량화는 MR 영상화에 의해 제공된 정확한 해부학적 정보와 결합될 때 방사선추적기로서 비대사성 글루코스 유사체인 [^18F]FDG를 사용하여 달성되었다. PET/MR 영상은 냉간 순응 후 7일 후에 실시되었으며, 열원성 지방 조직의 상대적 동원을 평가하기 위해 다른 지방 창고에서 [^18F]FDG 신호의 정량화가 수행되었다. iBAT의 제거는 마우스의 iWAT에서 감기유발[^18F]FDG 흡수를 실질적으로 증가시켰다.

서문

변화하는 영양 요구에 대응하여 지방 조직은 신체의 요구를 충족시키기 위해 지질 저장 또는 동원 모드를 채택하는 에너지 캐시 역할을합니다¹. 또한, 지방 조직은 또한 비 떨림 열 발생이라고도하는 과정을 통해 온도 조절의 핵심 기능을 수행합니다. 이것은 전형적으로 갈색 지방 조직 (BAT)에 의해 달성되며, 이는 단백질 1 (UCP1)의 결합 해제 단백질 미토콘드리아 막 단백질의 풍부한 수준을 발현한다. 양성자 운반체로서, UCP1은 양성자 수송과 ATP 생산²을 분리하여 열을 발생시킨다. 차가운 자극시, BAT의 열발생은 교감신경계(SNS)의 활성화에 의해 움직이고, 이어서 노르에피네프린(NE)의 방출에 의해 설정된다. NE는 β3 아드레날린 수용체에 결합하고 세포내 사이클릭 AMP(cAMP)의 상승을 유도한다. 결과적으로, CREB (cAMP 반응 요소-결합 단백질)의 cAMP/PKA 의존성 결합은 CREB 반응 요소 (CRE)²에 대한 직접 결합을 통해 Ucp1 전사를 자극한다. BAT 이외에, 갈색과 같은 지방세포는 또한 백색 지방 조직 내에서 발견되고, 따라서 베이지 색 또는 브리트 (갈색-인-화이트) 세포^1,3로 명명된다. 특정 자극 (감기와 같은)에 반응하여, 이들 그렇지 않으면 정지된 베이지 색 세포는 다구상 지질 방울, 조밀하게 패킹된 미토콘드리아, 및 증강된 UCP1 발현 3,4,5를 포함하는 다수의 갈색 유사 특징을 나타내도록 리모델링된다.

동물 연구에 따르면 갈색과 베이지 색 지방세포는 인슐린 감작, 지질 저하, 항 염증 및 항 죽상 동맥 경화증^6,7을 포함하여 지방 감소 효과 이상의 여러 대사 효과를 가지고 있습니다. 인간에서 베이지색/갈색 지방의 양은 나이, 인슐린 저항성 지수 및 심장 ^{대사 장애8}와 반비례합니다. 더욱이, 감기 순응 또는 β3 아드레날린 수용체 작용제에 의한 인간에서 베이지/갈색 지방세포의 활성화는 일련의 대사 장애^에 대한 보호를 부여한다^4,9,10. 이러한 증거들은 갈색 및 베이지 색 지방 조직의 유도가 비만 및 관련 의학적 합병증의 관리를위한 잠재적 인 치료 전략이라는 것을 총체적으로 나타냅니다⁸.

흥미롭게도, 그들은 유사한 기능을 공유하지만, 베이지 색과 고전적인 갈색 지방세포는 다른 전구체로부터 유래되고 겹치지만 뚜렷한 메커니즘에 의해 활성화됩니다¹. 따라서, 갈색 및 베이지 색 지방세포의 생체내 이미징 및 정량화는 이들 지방 조직의 분자 조절에 대한 더 나은 이해를 달성하기 위해 필수적이다. 현재 18F-플루오로데옥시글루코오스([^18F]FDG) 양전자 방출 단층촬영(PET) 스캔과 컴퓨터 단층촬영(CT)이 결합된 것은 임상 연구에서 열원성 갈색 및 베이지 색 세포의 특성화를 위한 황금 표준으로 남아 있습니다⁸. 자기 공명 영상 (MRI)은 강력한 자기장과 무선 주파수 펄스를 사용하여 상세한 해부학 적 구조를 생성합니다. CT 스캔과 비교하여 MRI는 더 높은 해상도로 장기 및 연조직 이미지를 생성합니다. 여기에 제공된 것은 감기 노출에 순응 한 후 마우스 모델에서 기능적 갈색 및 베이지 색 지방을 시각화하고 정량화하기위한 프로토콜이며, 지방 갈변을 유도하는 일반적이고 가장 신뢰할 수있는 방법입니다. 이 방법은 높은 정밀도로 작은 동물 모델에서 열 생성 지방 창고를 특성화하기 위해 적용될 수 있습니다.

프로토콜

아래에 설명 된 프로토콜은 홍콩 대학의 동물 관리 지침을 따릅니다. 연구에 사용된 동물은 8주령의 C57BL/6J 마우스였다.

1. 동물 수술 절차 및 감기 도전

1. 견갑골 간 BAT (iBAT) 해부를 수행하십시오.
   1. 케타민 / 자일라진 (100 mg / kg 체중 케타민 및 10 mg / kg 체중 자일라진)의 복강 내 주사로 마우스를 마취하십시오. 마취 후 마우스의 머리카락을 목에서 견갑골 바로 아래로 면도하십시오.
   2. 소독 후 마우스를 가열 패드에 놓고 마우스의 등쪽 중간 선을 따라 2cm 절개를하십시오.
   3. iBAT 패드(양측)를 분리합니다. 가짜 작동 그룹에서는 동일한 절개를하되 iBAT 패드는 그대로 두십시오.
   4. 출혈이 멈춘 후 7mm 스테인레스 스틸 상처 클립을 사용하여 절개를 닫습니다.
   5. 수술 후 멜록시캄 (식수 5mg / kg)을 생쥐에게 6 일 동안 투여하고 14 일 동안 중환자 실 (ICU)에 보관하십시오. 상처가 치유 되 자마자 클립을 제거하십시오 (7-10 일).
2. 마우스의 콜드 챌린지: 마우스를 14일 동안 열중성(30°C)에서 보관한다. 13일째에, 동물 케이지를 밤새 냉장(6°C)에서 미리 식힌다. 14일째에, 마우스를 6°C에서 7일 동안 환경 챔버에 넣는다. 각 새장에 두 마리의 마우스를 놓습니다.

2. 마이크로 PET/MR 교정 및 워크플로우 설정

참고: 마이크로 PET/MR 이미징은 순차적 PET/MR 시스템을 사용하여 수행됩니다( 재료 표 참조). 각각의 마우스는 이미징 베드 상에 배치되고; 먼저 정적 [^18F]FDG PET 획득을 위해 PET 시야각(FOV)의 중심으로 진행하기 전에 해부학적 기준(스카우트 뷰)을 MR로 스캔한 다음, 해부학적 참조를 위한 MR 이미징을 수행합니다. 이미징 세션 전에 자동화된 순차적 PET/MR 스캔을 가능하게 하기 위해 스캐너 운영 소프트웨어( 자료 표 참조)에서 이미징 워크플로우가 생성됩니다.

1. 운영 소프트웨어에서 정적 PET 획득, 감쇠 보정을 위한 MRI 획득, T1-계량 3D 이미징 및 T2 가중 2D 이미징을 사용한 해부학적 참조를 포함하는 이미징 워크플로우를 생성합니다.
2. PET를 획득하려면 400-600keV 레벨 차별, F-18 연구 동위원소, 1-5 우연의 일치 모드 및 20 분 스캔을 설정하십시오.
3. T1 가중 MR(감쇠 보정용)을 획득하려면 그라디언트 에코-3D(TE = 4.3ms, TR = 16ms, FOV = 90 x 60mm, 여기 수(NEX) = 3, 두께가 0.9mm인 슬라이스 28개, 복셀 크기 = 0.375 x 0.375 x 0.9mm)를 설정합니다.
4. T2 가중치 MR(해부학적 참조)을 획득하려면 고속 스핀 에코 2D(TE = 71.8ms, TR = 3000ms, FOV = 90 x 60mm, NEX = 5, 두께가 0.9mm인 슬라이스 32개, 복셀 크기 = 0.265 x 0.268 x 0.9mm3)를 설정합니다.
5. PET를 재구성하려면 1-3 일치 모드의 Tera-Tomo 3D(TT3D) 알고리즘(8회 반복, 6개 하위 집합)을 사용하고 감쇠, 데드 타임, 랜덤, 감쇠 및 산란 보정을 사용하여 전체 0.3mm3 복셀 크기의 이미지를 생성합니다.
6. 이미징 연구가 시작되기 하루 전에 마이크로 PET/MR 스캐너의 PET 활성 테스트를 수행하여 PET 정량의 정확성을 확인합니다.
   1. 제조업체 지침(물 또는 식염수에 140-220 μCi/5-8 MBq)의 권고에 따라 [^18F]FDG가 채워진 5mL 주사기를 준비합니다.
   2. 용량 교정기를 사용하여 주사기의 활동을 기록하고 ( 재료 표 참조) 측정 시간을 기록하십시오.
   3. 보간된 타원 ROI를 선택하여 재구성된 이미지에 VOI(관심 볼륨)를 그려 복구된 활동을 위에서 설명한 대로 측정된 값과 비교합니다. 잘 보정된 스캐너의 복구 활동은 ±5% 이내로 정확합니다.

3. [^18F]FDG의 주입

1. 첫 번째 예정된 주사 약 30 분 전에 이미징 실험실에 도착하기 위해 공급 업체로부터 [^18F]FDG (10 mCi / 370 MBq)의 임상 용량을 주문하십시오. 방사성 물질이 들어있는 패키지를 수령 할 때 실험실 코트, 장갑, 개인 방사선 선량계 (예 : 손가락, 전신)와 같은 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. 방사능의 교차 오염을 방지하고 방사능 소스와의 거리를 가능한 한 늘리기 위해 장갑을 정기적으로 교체하십시오.
2. 포셉을 사용하여 [^18F]FDG 스톡 바이알을 L 블록 테이블 상단 실드 뒤로 조심스럽게 옮깁니다.
3. [^18F]FDG의 분취량을 분주하고 멸균 식염수로 희석하여 100-150 μL의 200-250 μCi/7-9 MBq)에서 총 활성 농도를 수득한다.
4. [^18F]FDG 용액을 바늘이 있는 1 mL 주사기에 넣고( 표 자료 참조), F-18로 설정된 선량 교정기를 사용하여 방사능을 측정하고, 측정 시간을 기록한다.
5. 주사 전에 마우스의 무게를 기록하십시오. 준비된 [^18F]FDG 용액을 꼬리 정맥을 통해 주사하십시오. 주사기의 방사능의 주입 시간과 잔류 물을 기록하여 붕괴 교정을 가능하게하십시오.
6. 마우스를 케이지에 다시 넣고 PET 스캔 전에 60 분 동안 [^18F]FDG 흡수를 허용하십시오.
7. 다음 ^화학식 11을 이용하여 주입된 [^18F]FDG 활성을 계산한다:
   주입된 활동(μCi/MBq)
   = 주사 전 주사기에서의 활성
   - 주사 후 주사기에서의 활성

4. 마이크로 애완 동물 / MR 취득

1. 따뜻한 공기가 통과하도록 에어 히터를 마우스 침대에 켭니다.
2. 5% 이소플루란(1L/min 의료용 _O2)을 사용하여 마우스를 마취합니다. 일단 유도되면, 마우스를 따뜻한 마우스 침대로 옮기고 코 마스크 콘을 통해 2 % -3 % 이소플루란에서 마취를 유지하십시오. 물린 막대 위에 마우스를 놓고 마우스가 침대 직경 밖으로 튀어 나오지 않도록하십시오. 각막 궤양의 건조와 형성을 피하기 위해 눈 윤활제를 바르십시오.
3. 열 프로브와 호흡 패드에 의해 체온과 호흡률을 각각 모니터링합니다. 체온을 36-37°C로 유지하고, 이소플루란 수준을 조절하여 분당 70-80회 호흡(bpm)으로 호흡률을 유지한다.
4. 스카우트 보기를 수행하여 마우스 위치를 확인합니다. 마우스 베드 위치를 조정하여 마우스 몸 전체를 포함하고, MR의 중심 FOV가 마우스 몸의 중심에 있도록 한다.
5. 연구 목록 창의 PET 획득에서 이전 획득 시 스캔 범위를 선택하여 위에서 설명한 대로 스카우트 보기 위치를 사용합니다. 동물 침대를 MR에서 PET로 옮기기 위해 준비를 클릭하십시오. 확인을 선택하여 PET 스캔을 시작합니다. [^18F]FDG 투여 전후에 측정된 주사 용량 및 시간을 방사성의약품 편집기에 기록한다. 제목 정보 메뉴 아래에 마우스의 무게를 입력합니다.
6. PET 스캔이 완료되면 MR로 이동하기 위해 준비를 선택하고 연구 목록 창에서 모든 MR 획득을 완료합니다. 확인을 선택하여 MR 스캔을 시작합니다.
7. 전체 워크플로우가 완료된 후 후처리 소프트웨어를 사용하여 획득한 MR 이미지의 품질을 간략하게 평가 합니다(자료표 참조). 홈 버튼을 클릭하여 마우스 침대를 MR에서 원래 위치로 이동합니다.
8. 스캐너에서 마우스를 조심스럽게 제거하고 따뜻한 환경에서 회복 할 수 있도록 아래에 가열 된 패드가있는 깨끗한 하우징 케이지로 되돌립니다. 마우스에 음식과 물을 공급하십시오. 이제 시스템이 큐에 있는 다음 마우스를 사용할 준비가 되었습니다.
9. 데이터를 재구성하려면 원시 스캔 메뉴에서 PET 수집을 선택하여 완료된 PET 스캔을 로드합니다. 재료 맵 생성을 위해 T1 가중 MR 획득을 선택합니다. 위에서 설명한 대로 데이터를 재구성합니다(단계 2.5 참조).
10. PET 후 이미징 마우스의 관리 및 취급에 관한 지역 및 연구소 규정을 따르십시오. 사용 된 모든 주사기 / 바늘, 장갑, 침구 및 분변 물질을 현지 규정에 따라 특별한 취급 / 폐기가 필요한 방사성 폐기물로 간주하십시오.

5. 이미징 후 분석

1. 이미지 분석 소프트웨어(재료 표 참조)를 열고 DICOM 데이터 로드를 클릭하여 해당 MR 및 PET 이미지를 검색합니다.
2. 이러한 이미지를 디스플레이 창으로 드래그하여 MR 및 PET 이미지의 공동 등록을 수행합니다. 자동 등록 기능을 클릭합니다.
   1. 등록 설정 드롭다운 메뉴에서 [고지드 변환]을 선택합니다. 리지드/어파인 메뉴에서 시프트와 회전을 확인합니다.
   2. T1 가중 MR 획득을 참조로 선택하고 PET 획득을 전역 역할 선택 메뉴에서 리슬라이스로 선택합니다.
   3. MR과 PET 이미지 간의 완벽한 정렬을 확인하기 위해 세 가지 차원 모두에서 등록을 검사합니다. 수동으로 조정하려면 수동 등록을 클릭하십시오.
3. 보간된 타원 ROI를 사용하여 MR 이미지를 사용하여 관심 조직, 즉 iBAT 및 사타구니 백색 지방 조직(iWAT)에 VOI를 그립니다. 브러시 도구 및 지우개 도구를 사용하여 VOI 테두리를 정의하십시오. 따라서 조직의 해부학. PET 이미지를 사용하여 이웃 장기에서 유출되지 않도록 겹치는 흡수가 없는지 확인하십시오. 전체 VOI가 표시될 때까지 슬라이드별로 이 과정을 반복합니다. 필요한 경우 VOI를 편집하여 각 마우스 간에 일관된 VOI 볼륨을 유지합니다.
4. 타원체 VOI를 사용하여 폐에 ^3mm3 VOI를 기준 기관으로 그립니다. 이웃 심장과 근육에서 유출을 피하십시오.
5. 완료되면 ROI 테이블 표시 를 클릭하여 각 VOI의 이름을 바꿉니다. VOI 및 조직 부피로 평균 방사능을 스프레드시트에 기록합니다. VOI 도면 및 이미징 데이터를 데이터 저장 장치에 보관합니다.
6. 다음 방정식 ¹¹을 사용하여 모든 VOI에 대한 표준화된 흡수 값(SUV)을 계산합니다.
   _SUVmean = kBq/(붕괴 - kBq/마우스 체중에서 보정된 주사 용량을 kg)에서의 VOI 방사능으로, 조직 밀도가 1 g/mL라고 가정한다.

결과

3 그룹의 마우스 (그룹 당 n = 3)는이 연구에서 마이크로 PET / MR 이미징을 실시하여 7 일 동안 열중성 (30 ° C) 또는 저온 (6 ° C)에 보관했습니다. 한 그룹의 마우스(n=3)는 냉간 처리 전에 그들의 iBAT를 제거(iBATx)하였다(도 1A). 이 방법은 세 마리의 마우스 모두에서 백색 지방 조직 활성의 변화를 가져왔다. 특히, 마이크로 PET/MR 이미징을 사용한 iWAT에서 [^18F]FDG 흡수의 현저?...

토론

이 연구에서, PET/MR 기반 영상화 및 작은 동물에서 기능성 갈색 및 베이지 색 지방 조직의 정량화가 기술되었다. 이 방법은 비대사성 글루코스 유사체 [^18F]FDG를 이미징 바이오마커로서 사용하여 비침습적 방식으로 높은 글루코스 요구량을 갖는 지방 조직을 확인한다. MR은 좋은 연조직 대비를 제공하며 지방 지방 조직을 이웃 연조직 및 근육과 더 잘 구별 할 수 있습니다. PET와 결합할 때, 이...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sterile saline	BBraun		0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
Dose Calibrator	Biodex		Atomlab 500
Eye lubricant	Alcon Duratears		Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle
InterView Fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Isoflurane	Chanelle Pharma		Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
Metacam	Boehringer Ingelheim		5 mg/mL Meloxicam solution for injection for dogs and cats, 10 mL
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso		3 Tesla MR
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Wound clips	Reflex 7	203-100	7mm Stainless steel wound clips, 20 clips
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL