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요약

여기서 설명된 프로토콜은 스파이크 당단백질로 의사형인 향상된 녹색 형광 단백질 표지 된 정맥낭염 바이러스에 의해 감염을 억제하는 병류 혈청 샘플의 능력을 평가함으로써 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.

초록

중증 급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로 인한 COVID-19 전염병이 계속 진화함에 따라 바이러스에 대한 항체중화의 존재가 향후 감염에 대한 보호를 제공할 수 있다는 것이 명백해지고 있다. 따라서 효과적인 COVID-19 백신의 생성 및 번역이 전례 없는 속도로 계속됨에 따라 SARS-CoV-2에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법의 개발은 이전에 감염되고 예방 접종된 개인 모두에 대한 감염에 대한 장기적인 보호를 결정하는 것이 점점 더 중요해질 것이다. 본 논문은 최근 COVID-19에서 회복된 환자로부터 회복세럼에서 항체를 중화시키는 존재를 측정하기 위해 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 함께 가시성 성 정맥성 구내염 바이러스(VSV)를 이용한 고처리량 프로토콜을 설명합니다. 복제 의사유형 바이러스를 사용하면 SARS-CoV-2 처리에 필요한 봉쇄 레벨 3 시설의 필요성을 제거하여 이 프로토콜을 거의 모든 봉쇄 수준 2 실험실에 액세스할 수 있게 합니다. 96웰 형식을 사용하면 24h의 짧은 처리 시간으로 많은 샘플을 동시에 실행할 수 있습니다.

서문

2019년 12월, 새로운 코로나바이러스가 확인되었으며, 현재 코로나바이러스 질환의 원인제인 SARS-CoV-2(COVID-19)1로알고 있다. SARS-CoV-2는 코로나비대 가문에 속하는 베타코로나바이러스입니다. 이러한 봉투바이러스는 큰 양성감지 RNA 게놈을 포함하며 인간과동물2 모두에서 호흡기 및 장 감염에 대한 책임이 있다. 2021년 5월 현재 전 세계적으로 1억 5,700만 건이상의 COVID-19사례가 보고되었으며 320만 명 이상이 사망했다. 효과적인 백신의 발달은 적어도 77의 전임상 백신을 조사하고 90현재 임상 시험을 겪고 있는 전 세계 연구원의 1차 목표가 되었습니다4.

코로나바이러스는 스파이크 단백질(S), 뉴클레오캡시드(N), 봉투 단백질(E), 막 단백질(M)을 포함한 4가지 구조 단백질을 인코딩한다. SARS-CoV-2의 진입은 숙주 수용체와 S의 수용체 결합 도메인(RBD), 인간 혈관신생-변환 효소 2(hACE2), 및 후속 멤브레인 융합다음의 상호 작용이 필요하며, 숙주 세포 세린 프로테제, 트랜스멤브레인 프로테아제 세린 2(TMPRSS2)5,6,7,8,10, 10, 10 . SARS-CoV의 S 단백질의 유머 면역도는 이전에 보고되었으며 현재 SARS-CoV-211,12,13에도대해서도 도시되었다. 실제로, S에 대한 항체 반응을 중화시키는 것은SARS-CoV 환자로부터 24개월 후 SARS-CoV 환자로부터 병영 혈청에서 검출되어 장기 면역 반응에서 중요한 역할을 강조하고 있다. S 단백질은 유망한 백신 표적으로 확인되고 따라서 개발15,16의밑에 대부분의 백신의 핵심 분대가 되었습니다.

중화 항체의 급속한 검출은 백신 발달의 중요한 양상이지만, 또한 영향받은 지역에 있는 감염 및 혈청 역학 감시의 비율에 빛을 비출 수 있습니다17. 생물안전 수준 2 설정에서 SARS-CoV-2 감염을 연구하기 위해, SARS-CoV-2 S 당단백질 대신 SARS-CoV-2 S 당단백질을 가진 복제 유능한 VSV 가시형은 웰란과동료(18)에의해 친절하게 기증되었다. VSV 발현 스파이크(VSV-S)는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체 반응을 결정하는 데 활용될 것이다. 여기에서 사용되는 VSV-S는 또한 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 표현하기 때문에, eGFP 포시는 감염을 정량화하기 위해 24 시간 이내에 검출 될 수 있지만 플라크 형성은 48 에서 72 h를 취할 수 있습니다. 여기에 요약VSV-S-eGFP 감염을 중화하는 병결 환자 혈청의 능력을 결정하는 간단하고 효과적인 프로토콜입니다. 이 방법은 또한 SARS-CoV-2 S 단백질의 호스트 바이러스 성 상호 작용을 방해하는 것을 목표로 하는 그밖 잠재적인 치료체를 심문하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.

프로토콜

1. SARS-CoV-2 의사 바이러스의 생산 및 정량화를 위한 도금 세포(1일)

  1. 조직 배양 준비
    1. 따뜻한 1x 덜벡코의 인산염 완충식식(DPBS); 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM)는 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린/연쇄절제술(선택 사항)을 함유하고 있습니다. 및 약 15분 동안 수조에서 37°C까지 트립신-에틸렌디아민 테트라아세틱산(EDTA)을 0.25% 하였다.
    2. 70% 에탄올로 조직 배양 후드를 소독하고, 필요에 따라 조직 배양 후드에 조직 배양 접시, 파스퇴르 파이펫 및 세로지학적 파이펫을 배치합니다. PBS, DMEM 및 트립신을 수조에서 제거하고 조직 배양 후드에 넣기 전에 70 % 에탄올로 소독하십시오.
  2. 세포 도금 및 유지 관리
    1. T75 조직 배양 플라스크에서 DMEM(10% FBS 함유)에서 베로 E6 세포를 성장시키고, 37°C 인큐베이터에서 15cm 조직 배양식을 5%CO2로성장한다. 세포가 80-90% 컨할 때 필요에 따라 세포를 통과합니다.
    2. 각 접시에 1x PBS의 10mL를 추가하고 부드럽게 4-5 번 흔들어 세포를 씻어; PBS를 흡인합니다. 각 접시에 트립신-EDTA 3mL을 추가하고 접시를 흔들어 전체 표면이 덮여 있는지 확인합니다. 세포를 37°C에서 약 5분 동안 5% CO2로 배양하거나 세포가 분리될 때까지 배양한다.
    3. 트립신을 비활성화하기 위해 DMEM7 mL(10% FBS 포함)을 추가하고 여러 번 배관하여 셀을 다시 일시 중지합니다. 500 × g에서 벤치탑 원심분리기를 사용하여 트립신을 제거하고, 세포 펠릿을 방해하지 않고 미디어를 흡인시키고, DMEM의 10mL에서 세포를 재보선(10% FBS 포함)으로 세포를 스핀다운한다. 향후 실험에 세포가 필요한 경우 1mL를 신선한 DMEM 15mL(10% FBS 포함)를 포함하는 새로운 접시에 놓습니다.
    4. 자동 세포 카운터 또는 혈류계를 사용하여 세포를 계산하고, 각 15cm 플레이트에 약 1 × 107 세포를 추가하고, 100 % 컨서크 (1-2 일)가 될 때까지 5 % CO2로 37 ° C에서 배양한다.

2. VSV-S-EGFP 의사 바이러스 제제

  1. 감염
    1. 감염의 복합성에서 세포를 감염 (MOI) 0.01 VSV-S-eGFP 주식 바이러스와 함께 12 mL의 혈청 없는 DMEM에 대한 37 °C에서 37 °C에 5 % CO2, 때때로 플레이트를 흔들어. inoculum을 신선한 DMEM(2% FBS 및 20m HEPES, pH 7.7 포함)으로 교체하고 5% CO2로34°C로 설정된 인큐베이터로 이동한다.
      참고: 세포 배양에서 VSV-S-eGFP의 전파를 위해 34°C의 온도가 요구된다.
    2. 광범위한 세포 병증 효과 (CPE) 및 세포 분리의 관찰시 세포 초신수를 수집, 약 48 h 감염 후. 형광 현미경을 사용하여 감염 후 24시간부터 감염된 세포에 의한 광범위한 eGFP 발현을 시각화합니다.
  2. 수집
    1. 4°C에서 1,00 ×0g에서 5분 동안 벤치탑 원심분리기를 사용하여 서너너티지를 원심분리하여 세포 이물질을 제거합니다. 여러 동결 해동 주기를 피하기 위해 상체를 알리쿼트하고 -80 °C에 저장합니다.

3. VSV-S-eGFP 의사 바이러스 를 적시

  1. 바이러스 성 티터를 결정하는 직렬 희석
    1. 플레이트 베로 E6 셀6의 파종 밀도에서 6 × 105 세포의 시드 밀도(10% FBS), 5% CO2로37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
      참고: TMPRSS2 및 hACE2를 과발현하는 베로 셀도 사용할 수 있습니다.
    2. 7개의 미세원심분리기 튜브에 900 μL의 미디어를 배치하여 차가운 혈청 없는 DMEM에 VSV-S-eGFP 바이러스의 10배 직렬 희석 시리즈를 설정합니다. 라벨 튜브는 1에서 7까지입니다. 바이러스 성 육수의 100 μL을 첫 번째 튜브및 소용돌이에 간략하게 추가하십시오. 튜브 1에서 튜브 2및 소용돌이로 희석 된 바이러스의 100 μL을 간략하게 전송; 튜브 7까지 계속합니다.
    3. 베로 E6 세포를 포함하는 6웰 플레이트의 모든 우물에서 배지를 흡인하고, 희석10-2 ~10-7의500 μL로 대체한다. 플레이트를 37°C에서 5% CO2로45분간 배양하여 15분마다 부드럽게 흔들수 있습니다.
    4. inoculum을 흡인하고 2x DMEM과 6 % 카박스티메틸 셀룰로오스 (CMC)의 1:1 혼합물을 포함하는 오버레이로 대체, 3 % CMC의 최종 농도, 10 % FBS로 보충; 48h에 대해 5 % CO2와 34 °C에서 배양.
      참고: 감염 단계 동안 15분 동안 37°C 수조에서 오버레이 혼합물을 미리 데우세요. 1:1 의 혼합물 1% 아가로즈와 2배 DMEM을 보충하여 10% FBS를 보충하여 CMC 대신에 사용될 수 있다. 아가로즈와 오버레이하려면 1% 아가로즈(dH2O)를 끓이고 차가운 2배 DMEM과 섞습니다. 세포 단층(약 37-40°C)에 첨가하기 전에 혼합물이 적절한 온도인지 확인하십시오. 아가로즈가 오버레이에 사용되는 경우, 세포는 염색하기 전에 적어도 한 시간 동안 3:1 메탄올 : 아세트산의 2 mL에서 배양하여 고정해야합니다.
  2. 바이러스 성 티터를 염색하고 계산
    1. 형광 현미경으로 eGFP의 크리스탈 바이올렛 또는 직접 시각화로 플라크를 시각화합니다.
    2. 더러움 플레이트에, 오버레이를 흡인하고, PBS로 한 번 씻은 다음, 각각 의 양에 0.1 % 크리스탈 바이올렛 (80 % 메탄올과 dH2O)의 2 mL을 추가합니다. 탈염색 전에 실온에서 약 20분 동안 접시 로커에 놓습니다. 크리스탈 바이올렛을 제거하고 dH2O 또는 PBS를 사용하여 두 번 부드럽게 씻습니다.
      참고: 세척 및 염색 단계는 세포 단층이 절차 전반에 걸쳐 그대로 유지되도록 각 우물의 측면을 천천히 파이프로 사용하여 부드럽게 수행해야합니다.
    3. 플라크를 계산하기 전에 플레이트가 적어도 1 시간 동안 건조하도록 허용하십시오. 플라크 수가 20~200개의 플라크를 포함하는 우물에서 획득되는지 확인합니다. mL당 플라크 형성 단위(PFU)에서 바이러스의 티터를 계산하기 위해, 감염의 부피로 잘 계산된 희석계수를 곱하고, 각각의 우물에 존재하는 플라크에서 이 숫자를 나눕니다.
      figure-protocol-3553

4. 시판 되는 항체 및 회복 환자 혈청에 의한 SARS-CoV-2 의사 바이러스의 중화 측정을 위한 도금 세포(1일)

  1. 조직 배양 준비
    1. 섹션 1에 설명된 바와 같이 중간 및 조직 배양 후드를 준비한다. 또한, 샘플 당 최소 2 복제를 수용하기 위해 96 개의 웰 플레이트의 필요한 수를 준비합니다 (즉, 6 샘플 당 1 플레이트); 샘플 볼륨이 허용하는 경우 복제를 추가합니다.
  2. 세포 도금 및 유지 관리
    1. 1항에 설명된 대로 Vero E6 세포를 성장하고 유지합니다. mL당 2× 105셀의 농도로 96웰 플레이트당 최소 10mL의 세포 현탁액을 준비한다(필요한 경우 48h 후에 수행된 소사에 대해 mL당 플레이트 1.5 × 105셀). 멀티채널 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 각 웰에 100μL의 셀 서스펜션을 추가하고, 5%CO2로37°C에서 24시간 동안 배양한다.
      참고: 셀 서스펜션을 잘 섞고 각 플레이트를 모든 방향으로 부드럽게 흔들어 세포의 분포를 보장합니다.

5. 항체 또는 혈청 희석제 및 감염 (2일차)

참고: 이 프로토콜은 시판되는 항체 및 환자 혈청 뿐만 아니라 전임상 백신 개발 연구를 위해 동물에서 수집한 혈청에 의해 VSV-S-eGFP의 중화를 측정하기 위해 적용될 수 있다. *환자/동물 혈청 샘플을 처리할 때 나열된 추가 단계를 기록해 둡드립니다.

  1. 직렬 희석 시리즈
    1. 혈청 샘플을 희석하기 전에 56°C 수조에서 각 샘플을 30분 동안 비활성화하여 보완을 비활성화합니다. 환자 샘플을 취급할 때 필요한 안전 예방 조치를 취하십시오. 조직 배양 후드에 있을 때만 시료 용기를 열고 적절한 봉쇄 레벨 2 개인 보호 장비를 착용하십시오.
    2. 빈 96웰 플레이트(플레이트 1)에 희석 시리즈를 설정합니다.
    3. 80 μL에서 96웰 플레이트의 행 A에서 모든 희석을 시작합니다. * 환자 샘플의 경우 혈청이없는 DMEM의 72 μL에 8 μL의 혈청을 배치하여 10 에서 희석 시리즈를 시작합니다 (1 % 페니실린 / 연쇄 상류술).
      참고: 사용되는 중화 항체의 농도는 제조업체가 예측한 활성에 따라 달라집니다. 여기서 사용되는 SARS-CoV-2 스파이크 중화 항체의 경우(재료의 표참조), 5 μg/mL로 시작하여 50% 이상의 중화를 관찰한다.
    4. 혈청이 없는 DMEM(페니실린/연쇄절제술 1%)의 40μL을 B행에 넣고 H행에 80 μL을 추가합니다. 셀 전용 컨트롤 역할을 하므로 H행에 바이러스를 추가하지 마십시오.
    5. 12웰 멀티채널 파이펫을 사용하여 A행 A에서 행 B로 희석된 혈청 또는 항체의 40 μL을 혼합하고 전송하고 행 F까지 반복하고 행 F에서 40 μL을 폐기합니다. 바이러스 전용 제어 행을 나타내기 때문에 행 G에 혈청을 추가하지 마십시오.
  2. 감염 및 오버레이
    1. 적절한 양의 희석 된 VSV-S-eGFP를 준비하여 MOI 0.05 (또는 2000 pfu)에서 각 우물을 잘 치료하십시오. (이 계산을 완료할 때, 총 80 μL 부피의 60 μL만이 세포로 이동될 것이라는 점을 명심하십시오; 따라서, 2000 pfu를 유지하기 위하여 바이러스의 부피를 1.33으로 곱해야 함).
      참고: VSV-S-eGFP는 온도에 민감하기 때문에 사용하지 않을 때마다 바이러스 성 재고가 얼음 위에 남아 있는지 확인하고, 반복적으로 동결 한 후 티터가 다를 수 있으므로 여러 동결 해동 주기를 피하십시오.
    2. 1번 의 G행A에 각 우물에 40 μL을 추가하고 4-5배 위아래로 피펫팅하여 섞는다. 플레이트를 37°C에서 5% CO2로배양한다.
    3. 인큐베이터(플레이트 2)에서 셀을 함유한 플레이트를 제거하고 모든 우물에서 미디어를 조심스럽게 흡인시합니다. 플레이트 1에서 플레이트 2로 항체/바이러스 혼합물60μL을 전송하고, 37°C에서 1시간 동안 5%CO2로배양하고, 20분마다 플레이트를 흔들어 놓습니다.
    4. DMEM에 CMC를 함유한 140μL의 오버레이로 각각 3%의 CMC(FBS 10%, 페니실린/연쇄절제술 1%)를 최다 로 상향 조정합니다. 이미징 전에 약 24시간 동안 5% CO2로 34°C로 설정된 인큐베이터에 플레이트 2를 놓습니다.
      참고: 감염 단계 동안 15분 동안 37°C 수조에서 오버레이 혼합물을 미리 데우세요.

6. 이미징 및 정량화 (3일차)

  1. 자동 형광 이미저를 사용하는 이미지 플레이트(형광이소이소시아네이트(FITC) 필터 또는 488nm의 난동파장이 있는 대체 필터를 사용함). 개별 eGFP foci를 자동으로 식별하고 계산하는 프로토콜을 만들어 바이러스 감염을 정량화합니다. 자동 계수 기능을 사용할 수 없는 경우 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 eGFP foci 수를 정량화합니다.

결과

이 프로토콜은 VSV-S-eGFP 의사 바이러스 감염의 억제를 통해 SARS-CoV-2 S 단백질에 대한 중화 항체를 검출하는 신속하고 효과적인 방법을 간략하게 설명합니다(eGFP 포시의 손실에 의해 정량화 가능). 프로토콜의 회로도 표현은 그림 1에묘사됩니다. 분석이 실행될 때마다 상용화 가능한 항체를 양성 대조군으로 사용하여 분석의 일관성을 보장하는 것이 좋습니다. 여기서, 우리는 I...

토론

여기에 설명된 방법은 필요에 따라 다양한 실험실 환경과 리소스에 맞게 조정될 수 있습니다. 중요한 것은, 이 프로토콜의 주요 한계는 봉쇄 수준 2 공간 및 조직 배양 후드에 대한 필요성이다. VSV-S-eGFP와 같은 SARS-CoV-2 스파이크를 사용하여 가시형RNA 바이러스를 복제하는 응용은, 봉쇄 수준 3 작업 영역을 필요로 하지만, 일부 그룹에 대한 제한으로 남아있을 수 있는 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 강력?...

공개

저자는이 출판물과 관련된 경쟁 금융 이익이 없습니다.

감사의 말

우리는 관대이 프로토콜에 사용되는 VSV-S-eGFP 바이러스를 제공 Whelan 실험실감사 (케이스 외. 2020에 설명). 우리는 또한 환자 혈액 샘플을 수집한 빌 카메론 박사와 주타포르 코완 (및 팀)에게 감사드립니다 (REB 프로토콜 ID 20200371-01H). 저자는 이 기사의 연구, 저자 및/또는 출판에 대한 다음과 같은 재정적 지원의 수신을 공개합니다: 이 작품은 오타와 병원 재단의 관대 한 지원과 캐나다 보건 연구 원 (#448323)의 보조금과 COVID-19 과학을위한 엉겅퀴 재단의 빠른 보조금에 의해 조달되었으며, 온타리오 대학원 장학금 및 미택 펠로우십에 자금을 지원합니다. JP는 클러스터 미탁스 펠로우십에 의해 지원됩니다. T.A.는 CIHR 반팅 펠로우십의 지원을 받습니다. 우리는 또한 이 연구 결과에 참가하고 그들의 혈액 견본을 기증한 모든 개별에게 감사하고 싶습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTA (Gibco)Fisher scientificLS25200114
ArrayScan VTI HCSThermo Fisher ScientificAutomated fluorescent imager
carboxymethyl celluloseSigmaC5678
Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco)Fisher scientific10-013-CV
Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco)Thermo Fisher Scientific12-800-017
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Fisher scientific21-031-CV
HEPESFisher scientificBP-310-500
IgG Isotype Control (mouse)Thermo Fisher Scientific31903
Penicillin/streptomycinThermo Fisher Scientific15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse MabSinoBiological40592-MM57
Vero E6 cellsATCC CRL-1586

참고문헌

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