시투에서 전염 전자 현미경 검사를 사용하여 뮤린 메가 카요포이스의 탐사

요약

여기서, 우리는 투과 전자 현미경 검사법(TEM)을 사용하여 시투에서 거대 카르요세포의 초구조를 분석하는 프로토콜을 제시한다. 뮤린 뼈 졸은 수집, 고정, 에폭시 수지에 내장및 초박형 섹션에서 절단됩니다. 대조 염색 후, 골수는 120 kV에서 TEM 현미경으로 관찰된다.

초록

메가카요세포의 분화 및 성숙은 골수의 세포 및 세포 외 구성 요소와 밀접한 관련이 있습니다. 이러한 공정은 폴리플로이드 및 폴리로부트 핵과 같은 거대 카르요세포 세포질에서 필수 구조의 점진적인 출현, 경계막 시스템(DMS) 및 순환 혈소판에서 발견되는 조밀하고 알파 과립이라고 불리는 내부 멤브레인 네트워크인 폴리플로이드 및 폴리로부트 핵과 같은 필수 구조의 점진적인 외관을 특징으로 합니다. 본 기사에서는, 우리는 골수의 성숙 단계와 세포 밀도를 정의하는 주요 특성의 식별을 허용하는 전송 전자 현미경 검사법 (TEM)을 사용하여 뮤린 거대 카르요세포의 시투 초구조 적 연구를위한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 뼈 로는 플러시, 고정, 에탄올탈수, 플라스틱 수지에 내장, 횡단면을 생성하기 위해 장착된다. 반박형 및 얇은 단면은 각각 조직학 및 TEM 관측을 위해 준비됩니다. 이 방법은 모든 EM 시설에서 모든 골수 세포에 사용할 수 있으며 동일한 마우스에서 여러 이미징 접근법의 조합을 허용하는 작은 샘플 크기를 사용하는 장점이 있습니다.

서문

메가카요세포는 골수에 국한되어 혈소판 생산^1을담당하는 대형 폴리플로이드 세포를 특수화한다. 그(것)들은 복잡한 성숙 과정을 통해 조혈 줄기 세포에서 유래하고, 그 동안 거대 karyocyte 전구체가 점진적으로 크기가 증가하는 동안, 세포질과 핵^2에있는 광대한 수반성 형태 변경을 겪고 있는 동안. 성숙 하는 동안, 메가 karyocytes 포함 하 여 구별 할 수 있는 구조 요소의 수를 개발: 폴리로부이트 핵, 경계 막 시스템을 형성 하는 표면 막의 질 (DMS), 액틴 기반 사이토스켈레탈 네트워크에 의해 둘러싸인 세포기관이 없는 주변 영역, α-과립, 고밀도 과립, 굴절을 포함 하 여 수많은 세포기관. 초구조적 수준에서, 관찰된 주요 수정은 DMS^3에의해 분리된 이산 영역으로 세포질 구획화이다. 멤브레인의이 광범위한 공급은 혈소판 생산의 초기 단계에서 긴 세포질 공정의 확장을 연료, 다음 순환 내부 혈소판으로 리모델링됩니다. 메가카요세포 분화 및 성숙 중 모든 결함은 혈소판 수 및/또는 혈소판 기능의 기간 동안 혈소판 생산에 영향을 미칠 수 있습니다.

얇은 층 투과 전자 현미경 검사법 (TEM)은 혈전 포에이시스^4,5의생리학에 대한 우리의 이해를 형성 한 거대 카르요세포의 고품질 초구조를 제공하는 수십 년 동안 선택의 이미징 접근 방식이었다. 이 논문은 모든 골수 세포 유형을 분석하는 기초가 될 수 있는 토착 골수 마이크로 환경 내에서 발생하는 혈소판 생물 발생 과정을 포착할 수 있는 표준화된 TEM 방법에 초점을 맞추고 있습니다. 우리는 미숙한 에서 완전히 성숙에 메가 카르요세포의 개발의 초구조적 예를 제공, 이는 시누소이드^6의미세 순환으로 세포질 공정을 확장. 우리는 또한 골수의 재생 및 혈소판 생산 능력에 지시, 다른 메가 카요세포 성숙 단계를 정량화하는 쉬운 절차를 설명합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 유럽 표준 2010/63/EU및 스트라스부르 대학의 동물 실험 윤리에 대한 CREMEAS 위원회 (코미테 레지오날 데티크 앙 마티에르 디에리포앙 마티에르 데테리션 애니멀 스트라스부르)에 따라 수행되었습니다. 프로토콜은 그림 1에괄호로 표시됩니다.

1. 골수 수집 및 고정 (그림 1A)

주의: 이 절차는 발암성, 돌연변이 및/또는 독성 물질을 포함하며 화학 추출 후드에서 수행됩니다. 장갑및 보호 안경과 같은 적절한 보호 장비를 착용하십시오.

1. 캘코디레이트 버퍼에서 2.5% 글루타랄데히드로 구성된 고정 솔루션을 준비합니다(보충 파일참조).
2. 골수 컬렉션
   1. 성인 C57BL/6 생쥐를 성관계 12-18주 중으로 사용하십시오. CO₂ 질식 및 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시.
   2. 얇은 가위 한 켤레로 허벅지 주위의 피부를 자르고 핀셋을 사용하여 피부를 벗겨냅니다. 발의 사지를 제거한 다음 엉덩이와 허벅지 사이를 잘라냅니다. 무릎 관절에서 절단하여 대퇴골에서 경골을 분리하고 메스를 사용하여 음정과 대퇴골에 부착 조직을 제거합니다.
   3. 날카로운 면도날로 표피를 제거합니다. 핀셋으로 대퇴골을 들고 있는 동안 21G 바늘로 카콜딜레이트 버퍼로 채워진 5mL 주사기를 사용하여 골수를 2mL 의 교정 버퍼로 채워진 15mL 튜브로 플러시하십시오. 이렇게하려면, 골수 개구부에 바늘의 bevel을 삽입하고 골수가 추방 될 때까지 천천히 플런저를 누릅니다.
3. 골수 고정에 급속한 몰입에 의해 고정.
   1. 플러싱 직후 플라스틱 파이펫을 사용하여 골수 실린더를 실온에서 60분 동안 신선한 글루타랄데히드 고정 용액(이전에 1.1으로 준비)으로 옮기는 것입니다.
      참고: 조직을 보존하려면 뼈 해부에서 고정 단계에 이르는 전체 프로세스가 10분 이내에 완료되었는지 확인합니다. 고정을 위해, 고정 솔루션이 열 충격을 방지하기 위해 실온에 있는지 확인합니다.

2. 아가로즈에 골수를 포함

참고: 골수 조직은 다른 세척 단계 동안 무결성을 유지하기에 충분히 응집력이 없으며 재료는 쉽게 손실 될 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해, 골수는 탈수하기 전에 한천의 젤로 덮여있다.

1. 보충 파일에 설명된 대로 아가로즈 솔루션을 준비한다.
2. 1.3절에서 고정된 골수를 카코딜레이트 버퍼에서 세척하고 플라스틱 파이펫을 사용하여 유리 슬라이드로 조심스럽게 옮겨주세요. 따뜻한 파이펫을 사용하여 골수 실린더에 2% 액체 화고 한 방울을 빠르게 발라주세요.
   참고: 냉각 하는 동안 한천신속 하 게 고형화. 골수의 균일한 덮개를 보장하기 위해, 천 용액은 슬라이드에 증착 될 때까지 따뜻하게 유지해야합니다.
3. 한천이 굳어질 때까지 빠르게 슬라이드를 얼음 위에 놓습니다(1-2분).
4. 현미경의 밑에, 이 지역에 있는 가능한 조직 압축 때문에 골수 실린더의 사지를 절단하고 폐기하기 위하여 날카로운 면도날을 이용하십시오. 1mL의 카코딜레이트 버퍼를 포함하는 1.5mL 마이크로센트심심분리기 튜브에서 골수 블록을 전달한다.

3. 수지에 골수를 포함

주의: 수지 성분은 독성이 있습니다. 일부는 발암성이며 화학 추출 후드에서 주의를 기울여야합니다. 장갑및 보호 안경과 같은 적절한 보호 장비를 사용하십시오. 오스뮴 테트옥사이드는 실온에서 매우 휘발성이 높으며 증기는 눈, 코 및 인후에 매우 해롭습니다. 폐기되기 전에 식물성 기름의 두 배를 추가하여 2 % 오스뮴 테트옥사이드를 중화해야합니다.

1. 보충 파일에설명된 대로 에폭시 수지준비.
2. 수지 포함
   참고: 오스뮴, 우란 아세테이트 및 에탄올의 연속된 욕조에서 인큐베이션 하는 동안 동일한 미세 원심 분리튜브에 샘플을 보관하십시오. 파스퇴르 파이펫으로 슈퍼네이터를 흡인합니다. 각 욕조에 사용되는 용액의 부피는 샘플의 부피의 10배 이상이어야 합니다.
   1. 4°C에서 1시간 동안 1% 오스뮴으로 블록을 수정한 다음, 한 번 은근한 완충액을 한 번 세척한 다음 증류수로 한 번 세척합니다.
   2. 증류수에 4% 우라일 아세테이트를 1시간 동안 더러워, 증류수로 두 번 씻어낸 스테인.
   3. 증류수에 에탄올의 등급 시리즈를 통해 탈수: 5 분 동안 75 % 에탄올에서 4 번, 20 분 동안 95 % 에탄올에서 3 번, 그리고 20 분 동안 100 % 에탄올에서 3 번. 이 단계에서는 냉동고에서 에폭시 수지 1개를 꺼내십시오.
      참고: 프로토콜은 1시간 동안 100% 에탄올로 일시 중지할 수 있습니다.
   4. 골수 내부에 에폭시 수지의 균일한 침투 및 중합을 얻으려면, 15 분 동안 프로필렌 옥사이드의 2 연속 목욕에서 블록을 먼저 배양한다.
   5. 1:1 혼합물의 100% 프로필렌 옥사이드와 에폭시 수지와 1시간 동안 배양한다. 샘플을 실온에서 느린 회전 셰이커에 놓습니다.
   6. 100% 에폭시 수지를 추가하여 교반 하에서 하룻밤 잠복식시 샘플을 남깁니다.
   7. 2 시간 인큐베이션에 100 % 에폭시 수지추가 여전히 교반 중입니다.
   8. 현미경의 밑에, 평평한 실리콘 금형에 골수 블록을 놓습니다. 전체 골수의 후속 횡단 절위를 허용하기 위해 샘플을 지향한다. 에폭시 수지로 금형을 채우고 48 h에 대한 60 °C에서 배치합니다.
      참고: 모든 솔루션(에탄올 및 프로필렌 옥사이드 제외)은 샘플 오염을 방지하기 위해 0.22 μm 필터를 통해 필터링됩니다. 수지의 적절한 중합을 보장하기 위해 금형을 채우는 동안 거품을 피하십시오.

4. 초박형 단면(그림 1B)

참고: 전송 EM은 전자가 세포, 구조 및 내부 세포기관의 내부의 투영 영상을 생성할 수 있는 얇은 조직 섹션(과립, 내풍구성 망상, 골기) 및 세포세포 내 세포막의 배열을 요구합니다.

1. 초미세토메 지지대에서 시료 블록을 장착합니다. 샘플 홀더에 넣습니다. 회전 다이아몬드 또는 텅스텐 밀링 커터와 조직 주위 수지의 과잉을 제거하기 위해 45 °에서 샘플을 손질.
2. 물 탱크가 장착 된 다이아몬드 칼 날로 초미세 토메에 샘플을 장착하십시오. 조직학적 및 TEM 분석을 위해 500nm 및 100 nm 두께의 가로 부분을 각각 절단합니다. 루프를 통해 수면의 부동 섹션을 수집합니다.
3. 유리 슬라이드에 500 nm 두께의 섹션과 200 메쉬 얇은 바 구리 그리드에 100 nm 두께의 섹션을 종이 필터로 보관하십시오. 하나의 조건에 대해 5개의 그리드를 준비합니다: 두 개의 그리드를 먼저 염색하고 필요한 경우 나머지 세 개의 그리드를 백업으로 유지합니다.

5. 히스토로지톨루이딘 블루 스테인싱

참고: 조직학을 위한 염색 단면도는 3가지 이유로 중요합니다: 1) 조직이 실제로 절단되고 수지가 아닌지 확인하고, 2) 포함의 품질을 확인하고, 3) 골수 샘플을 빠르게 평가한다. 이것이 정확하지 않은 경우 블록에서 더 자세히 잘라냅니다.

1. 열판(60°C)에서 반박구간 슬라이드를 건조시다.
2. 슬라이드에 증류수에 여과된 1% toluidine 블루/1% 나트륨 붕산염을 넣고 핫 플레이트(60°C)에서 1-2분 동안 가열합니다. 증류수로 슬라이드를 씻고 열판에서 건조시키십시오.
3. 폴리(부틸 메틸 메타크릴레이트) 장착 매체를 장착하고 가벼운 현미경으로 검사하여 커버립에 단면을 장착합니다.

6. TEM 관찰을위한 중금속 염색(도 1C)

참고: 대조적으로, 그리드의 상부는 루프가 있는 각 연속 목욕의 100 μL 방울에 반전됩니다. 사용하기 전에 각 용액은 0.22 μm필터링됩니다. 필터 용지의 그리드 측에 부드럽게 접촉하여 각 욕조 사이에 액체의 과잉을 제거합니다.

1. 증류수에 4% 우라인 아세테이트를 5분 동안 더러워 진 스테인.
2. 증류수로 3회 5분 세척합니다.
3. 3 분 동안 리드 구연산염얼룩.
4. 증류수로 3회 5분 세척합니다.
5. 필터 용지와 접촉하여 아래쪽으로 그리드를 적기시켜 건조시합니다.
   참고: 중금속은 이산화탄소가 존재하여 반응합니다. 침전을 최소화하기 위해, 대조 하는 동안 공기 변위를 방지, 말을 하지 마십시오, 환경을 진정 유지 하 고 에어컨을 해제.

7. TEM(그림 1E)

참고: 섹션은 TEM 현미경으로 소개되고 120 kV에서 검사됩니다.

1. 먼저 낮은 배율(< 500x)에서 섹션을 검사하여 준비의 일반적인 측면을 평가합니다(수지의 구멍이 없는 경우, 단면의 주름/압축, 얼룩으로 인한 침전).
2. 그런 다음 더 높은 배율(~ 2000x~성숙의 단계를 구별할 수 있음)에서 단면을 검사합니다. 전체 트랜스버라 구간에서 성숙의 각 단계에서 메가카요사이클을 수동으로 계산합니다(각 스테이지를 시각적으로 식별하는 방법에 대한 대표 결과 참조).
   참고: 그리드의 각 사각형은 검사 영역으로 정의됩니다(200메쉬 구리 그리드의 경우 16000 μm2와 동일).
3. 메가카요사이클의 수를 평가하려면 섹션으로 완전히 덮인 사각형만 정량화합니다. 이렇게 하려면 범위의 스크리닝을 기반으로 모델을 사용합니다. 섹션의 극단에서 다른 사각형, 같은 방법으로 다른 범위 등으로 의 첫 번째 범위를 관찰하십시오. 이 절차를 사용하여 전체 골수 횡단 섹션 사각형을 정사각형으로 완전히 체계적으로 화면으로 검사합니다.
4. 각 사각형에 대해 스테이지 I, II 또는 III 메가카요사이클의 수를 점수매기세요.
   참고: 과립, DMS 조직, 세포질 영역의 크기 및 폴리로부이드 된 핵을 분석하기 위해서는 배율이 높아지도록 요구됩니다.

결과

골수 히스토로지
가벼운 현미경하에서 골수 톨루이딘 청색 조직학을 관찰하는 것은 조직 압축성, 미세혈관 연속성, 메가카르요세포의 크기 및 형상(도 1D)과 같은 관점에서 전체 조직 아키텍처를 빠르게 분석하는 열쇠이다. 그것은 골수 블록에서 더 깊은 절단의 필요성을 결정하기 위해 초박형 섹션 전에 수행됩니다. 거대한 크기와 핵 로빙으로 ?...

토론

그들의 토착 환경에서 메가 카요 세포의 직접 검사는 메가 karyopoiesis 및 혈소판 형성을 이해하는 데 필수적이다. 본 원고에서, 우리는 골수 홍조와 침수에 의한 고정을 결합한 투과 전자 현미경 법을 제공하여 골수에서 일어나는 메가 카요세포 형태 발생의 전체 과정의 형태 학적 특성을 시상할 수 있도록 합니다.

골수의 플러싱은 고품질 플러싱의 성공은 작업자의 연습...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30)	Ladd Research Industries, USA	21310
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar	Electron Microscopy Sciences, USA	1670-B
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate	Merck, Germany	2083
Copper grids 200 mesh thin-bar	Oxford Instrument, Agar Scientifics, England	T200-CU
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate	Merck, Germany	8.20670.0250
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA)	Ladd Research Industries, USA	21340
Double Edge Stainless Razor blade	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	EM-72000
Ethanol absolut	VWR International, France	20821296
Filter paper, 90 mm diameter	Whatman, England	512-0326
Flat embedding silicone mould	Oxford Instrument, Agar Scientific, England	G3533
Glutaraldehyde 25%	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	16210
Heat plate Leica EMMP	Leica Microsystems GmbH, Austria	705402
Histo Diamond Knife 45°	Diatome, Switzerland	1044797
JEOL 2100 Plus TEM microscope	JEOL, Japan	EM-21001BU
Lead citrate - Ultrostain 2	Leica Microsystems GmbH, Austria	70 55 30 22
LX-112 resin	Ladd Research Industries, USA	21310
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate	Sigma, France	M2393-100g
Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate)	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	15320
Nadic Methyl Anhydride (NMA)	Ladd Research Industries, USA	21350
Osmium tetroxide 2%	Merck, Germany	19172
Propylene oxide (1.2-epoxypropane)	Sigma, France	82320-250ML
Saline injectable solution 0.9% NaCl	C.D.M Lavoisier, France	MA 575 420 6
Scalpel Surgical steel blade	Swann-Morton, England	.0508
Sodium tetraborate - Borax	Sigma, France	B-9876
Sucrose	Merck, Germany	84100-1KG
Syringe filter 0.2µm	Pall Corporation, USA	514-4126
Toluidine blue	Ladd Research Industries, USA	N10-70975
Trimmer EM TRIM2	Leica Microsystems GmbH, Austria	702801
Ultramicrotome Ultracut UCT	Leica Microsystems GmbH, Austria	656201
Uranyl acetate	Ladd Research Industries, USA	23620