마우스에서 간내 섬 이식 중 주입 후 포털 정맥 출혈 최소화

요약

여기서 우리는 마우스에서 임상적으로 관련이 있지만 기술적으로 도전적인 수술 절차 인 포털 내 섬 이식을 성공적으로 수행하는 세련된 수술 절차를 제시합니다.

초록

간은 현재 임상 환경에서 인간 섬의 일차 이식 부위로 인정되고 있지만, 대부분의 설치류 전임상 췌도 이식 연구에서 췌도는 신장 캡슐 아래에 이식됩니다. 이 모델은 뮤린 간내 섬 이식이 기술적으로 어렵고 높은 비율의 마우스가 외과 적 합병증, 특히 이식 후 주사 부위의 출혈로 사망 할 수 있기 때문에 일반적으로 사용됩니다. 이 연구에서는 주입 후 포털 정맥 출혈의 발생률을 최소화 할 수있는 두 가지 절차가 입증되었습니다. 첫 번째 방법은 흡수성 지혈 젤라틴 스폰지를 주사 부위에 적용하고, 두 번째 방법은 지방 조직을 통해 췌도 주사 바늘을 먼저 침투 한 다음 지방 조직을 물리적 장벽으로 사용하여 문맥 정맥으로 침투하여 출혈을 멈추게합니다. 두 방법 모두 출혈로 인한 마우스 사망을 효과적으로 예방할 수 있습니다. 간내 이식의 전형적인 특징인 췌도 분포 및 이식 후 췌도 혈전증의 증거를 보여주는 전체 간 절편이 제시되었다. 이러한 개선 된 프로토콜은 간내 섬 이식 절차를 개선하고 실험실이 전임상 환경에서 췌도 생존과 기능을 연구하는 절차를 설정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서문

포털 정맥을 통한 포털 내 췌도 이식 (IIT)은 임상 환경에서 인간 췌도 이식에 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 마우스 IIT 모델은 췌도 이식을 연구하고 췌도 이식의 효능을 향상시킬 수있는 유망한 중재 접근법을 테스트 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다¹. IIT는 1970 년대에 처음 기술되었으며 여러 그룹 ^1,2,3,4,5에서 사용되었습니다. 그것은 20006,7 년에 인간 섬 이식의 돌파구 이후 인기를 되찾았다. 그러나, 대부분의 췌도 이식 연구는 그것의 쉬운 성공으로 인해 실험적인 췌도 이식을 위한 선호되는 부위로서 신장 캡슐을 이용했다. 반대로, IIT는 기술적으로 더 도전적이며 췌도 이식 연구에 덜 자주 사용됩니다^8,9. 그러나 IIT와는 달리, 신장 캡슐 아래에 이식된 섬은 혈전증, 염증 및 간 조직 허혈을 특징으로 하는 즉각적인 혈액 매개 염증 반응을 겪지 않으며, 따라서 간으로 이식된 섬보다 더 나은 기능을 갖는다. 따라서 신장 캡슐 모델은 인간 섬 이식에서 섬에 의해 발생하는 스트레스를 완전히 모방하지 못할 수 있습니다^10,11,12.

마우스에서 IIT의 주요 합병증 중 하나는 이식 후 주사 부위에서 출혈이며, 이는 다른 마우스 균주 중에서 사망률의 10-30 %를 유발할 수 있습니다¹². 이 논문에서는 출혈을보다 빠르고 안전하게 멈추고 IIT 후 마우스 사망률을 줄이기 위해 두 가지 세련된 접근법이 개발되었습니다. 이러한 세련된 세부 사항에 대한 시각적 데모는 연구자가이 기술적으로 도전적인 절차의 핵심 단계를 식별하는 데 도움이됩니다. 또한, 수용자의 간에서 췌도 이식편의 위치는 이식된 섬을 지닌 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색된 간 조직(전체 절편)의 조직학적 검사에 의해 결정되었다.

프로토콜

모든 절차는 사우스 캐롤라이나 의과 대학 (Medical University of South Carolina)의 기관 동물 관리 및 사용위원회와 찰스턴의 랄프 H 존슨 의료 센터 (Ralph H Johnson Medical Center)의 승인을 받아 수행되었습니다.

1. 스트렙토조토신(STZ)을 이용한 당뇨병 유도

1. 수용자 마우스 준비:
   1. 모든 마우스의 무게를 개별적으로 측정합니다.
   2. 글루코 미터를 사용하여 꼬리 정맥 혈액 샘플에서 혈당 수준을 확인하십시오.
2. 세 가지 다른 시나리오에 대한 STZ 용량 결정 :
   1. 지방간 질환을 앓고있는 마우스의 경우 STZ [40 mg / kg / day, 복강 내 (i.p.) 주사]를 5 일 연속 주사하십시오.
   2. NOD-SCID 마우스의 경우 125 mg / kg의 STZ, 단일 주사, 즉 야간 금식 후 주사하십시오.
   3. C57BL / 6 마우스의 경우 225 mg / kg의 STZ, 단일 주사, i.p.
3. STZ (13.5 mg / mL)에 대한 계산 :
   참고: 이 계산은 체중이 30g인 C57BL/6 마우스 5마리에 대한 계산입니다.
   1. 총 체중: 5마리의 마우스 x 30g/마우스 = 150g
   2. 필요한 STZ : 150g x 225mg / 1000g STZ = 33.75mg
4. STZ 준비:
   1. 미리 계산된 용량에 따라 STZ를 계량합니다.
   2. 칭량된 STZ 분말을 얼음 위의 10 mL 비이커로 옮긴다.
   3. 3 mL의 시트르산나트륨 용액을 비이커에 첨가하여 STZ를 용해시킨다.
   4. 잘 섞고, 0.22-μm 기공을 통해 여과 멸균하고, 준비 후 10분 이내에 STZ 용액을 사용한다.
5. STZ 주입:
   1. 원하는 양의 STZ 용액 (마우스 한 명에게 충분함)을 1 mL 주사기에 로딩하십시오.
   2. 마우스 복부의 오른쪽 아래 사분면에서 복강 주사를 수행하십시오.
   3. 주사 후 5 분 동안 마우스를 관찰하고이 기간 동안 불편 함의 징후가 있는지 확인한 후 케이지에 다시 넣으십시오.
   4. STZ 주사 후 매일 글루코미터를 사용하여 꼬리 정맥 혈액 샘플에서 혈당 수준을 모니터링합니다.
      참고 :이 실험에서 쥐는 비 공복 혈당이 이틀 연속 350 mg / dL> 될 때 당뇨병 환자로 간주됩니다.

2. 섬 준비

참고: 인간 섬은 100 mm 세포 배양 접시 당 10,000 섬 등가 수 (IEQ)의 밀도에서 10% 태아 소 혈청 (FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (P/S)이 보충된 CMRL-1066 배지에서 배양되었다⁹. 마우스 섬을 동일한 밀도로 10% FBS 및 1% P/S로 DMEM에서 배양하였다¹³. 6-10주령의 수컷 NOD-SCID 및 C57BL/7 마우스를 상업적 공급원으로부터 수득하였다.

1. 배양된 섬을 세포 배양 접시에서 부드럽게 긁어서 분리한다.
2. 1cc 주사기를 사용하여 원하는 수의 섬(예를 들어, 300-350개의 섬)을 직접 골라서 얼음 위에 멸균된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣는다.
3. 마이크로원심분리기를 사용하여 튜브를 10초 동안 회전시킨다.
4. 상층액을 제거하고 펠렛을 잃지 않도록 약간의 액체를 남겨 둡니다.
5. 펠렛을 200 μL의 HBSS에 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 재현탁시켰다.
6. 재현탁된 섬을 0.5 mL 인슐린 주사기에 흡인한다.
7. 주사기를 똑바로 세운 위치에 놓습니다. 섬이 1 분 동안 가라 앉게하십시오.
8. 주사기를 밀어 모든 기포를 제거하고 섬을 포함하는 액체의 약 100-150 μL를 남깁니다.
9. 주사기 머리를 아래로 내리고 주사기의 측면을 부드럽게 두드려 섬이 액체 전체에 균등하게 분포하도록하십시오. 섬은 이제 주사 할 준비가되었습니다.

3. 섬 이식

1. 마우스를 2% 이소플루란으로 전신 마취하에 유도하고 유지시킨다. 동물의 적절한 마취를 보장하기 위해 페달 반사 신경이 부족한지 확인하십시오.
2. 면도하고 마우스의 복부 부위에있는 모피를 제거하십시오.
3. Buprenorphine의 단일 수술 전 복용량을 투여하십시오 (0.1 mg / kg i.p.).
4. 2 % 요오드와 75 % 알코올의 세 가지 번갈아 가며 닦아서 수술 부위를 소독하십시오.
5. 마이크로 가위로 개복술을 수행하여 1-1.5cm 절개를 생성합니다.
6. 리트랙터로 복강을 엽니 다. 아래에 설명 된대로 방법 A 또는 방법 B 중 하나를 따르십시오.

4. 방법 A : (젤 폼으로 출혈 중지, 그림 1A) ^14,15,16

1. 마우스 준비
   1. 절개 주위에 멸균 거즈를 놓습니다.
   2. 포셉을 사용하여 내장을 부드럽게 꺼내 거즈에 보관하십시오.
   3. 포털 정맥의 위치를 파악하고 잘 노출시킵니다.
   4. 전체 수술 중에 따뜻한 식염수 젖은 거즈로 장을 덮으십시오.
2. 십이지장 근처의 포털 정맥을 통해 미리 로딩된 인슐린 주사기 바늘을 췌도에 삽입합니다(그림 1B). 이렇게하려면 구멍 (경사)이 아래를 향하도록 바늘을 잡고 벽을 관통하기 전에 개구부의 각도를 포털 정맥 벽과 평행하게 배치하십시오.
   1. 플런저를 당겨 주사기에 혈액(20-50 μL)을 좀 끌어당겨 섬을 먼저 섞는다.
   2. 섬을 포털 정맥에 천천히 주입하면서 반복적으로 플런지를 당기고 밀어 넣으십시오.
   3. 젤 폼 조각 (약 0.5cm x 0.5cm 크기)을 넣어 주사 부위를 덮으십시오.
   4. 젤 폼을 면화 팁으로 누르면서 포털 정맥에서 바늘을 꺼냅니다.
   5. 활성 출혈이 없는지 확인하기 위해 약 2 분 동안 젤을 계속 누릅니다.
   6. 젤 폼에서 면화 팁을 반복해서 굴려 젤 폼이 포털 정맥을 잘 덮는지 확인하십시오.

5. 방법 B : (뚱뚱한 패드로 출혈을 멈추십시오, 그림 1C)¹⁷

1. 포털 정맥을 철저히 노출하십시오.
   1. 두 개의 면봉을 사용하여 노출 된 포털 정맥을 왼쪽과 오른쪽 모두에서 잡으십시오.
   2. 십이지장과 문맥 정맥 사이의 지방 조직 패드를 확인하십시오.
   3. 바늘을 포털 정맥에 삽입하기 전에 지방 패드를 통해 침투하십시오 (그림 1D).
   4. 방법 A의 파트 4.2.1 및 4.2.2에서 위에서 설명한 유사한 절차에 따라 섬을 주입하십시오.
   5. 면봉으로 지방을 누르면서 바늘을 당겨 내십시오.
   6. 바늘을 제거한 후 1 분 동안 지방 패드를 계속 누릅니다.
2. 포털 정맥에서 출혈이 없음을 확인한 후 장을 원래 위치의 복강으로 부드럽게 되돌립니다.
3. 폐쇄 전에 0.5 mL의 따뜻한 식염수 (36-37 °C)를 복강에 두십시오.
   참고: 따뜻한 식염수는 수술 후 장의 움직임과 회복을 촉진하고 장 괴사를 예방합니다.
4. 5-0 봉합사로 근육층을 닫습니다.
5. 4-0 봉합사로 표피층을 닫습니다.
6. 마취에서 완전히 회복 될 때까지 마우스를 가열 패드의 깨끗한 케이지에 넣으십시오.
7. 12 시간마다 진통제 (예 : buprenorphine 0.1 mg / kg i.p)를 계속 제공하고 수술 후 48 시간 동안 보충 열을 제공하십시오.
   참고 : 췌도 이식 절차는 완료하는 데 약 15-20 분이 걸립니다.

6. H&E 염색 및 전체 간 단면의 사진

1. 간 관류
   1. 마우스를 3.1부에서 상기 기재된 바와 같이 마취하에 놓는다.
   2. 조심스럽게 포털 정맥을 노출시키고 열등한 정맥 카바를 자릅니다.
   3. 수동으로 20 mL의 10% 파라포름알데히드를 사용하여 약 5분 동안 문맥 정맥을 통해 간을 관류시키고, 25G ^needle18이 있는 20 mL 주사기를 사용한다.
      참고 : 간 관류는 간 조직에서 혈액을 제거하고 췌도 이식편을 방해하지 않고 간 고정을 향상시킬 수 있습니다.
   4. 관류 된 전체 간을 다른 장기에서 해부하십시오.
   5. 관류 된 간 조직을 10 % 파라 포름 알데히드에 24 시간 동안 고정하십시오.
   6. 조직을 파라핀에 내장하십시오.
   7. 조직 절편을 각각 5 μm 두께로 절단하고 염색을 위해 유리 슬라이드 위에 올려 놓는다.
   8. 표준 방법^15,16을 사용하여 H&E, 인슐린^, 피브린 및 다형핵 호중구(PMN) 염색을 수행합니다.
   9. 현미경으로 전체 간 섹션을 스캔하십시오.

결과

우리는 포털 정맥을 통해 syngeneic 및 xenogeneic 섬 이식을 수행했습니다. 췌도 이식 기능은 두 췌도 이식 모델 모두에서 용량 의존적 방식으로 관찰되었다. C57BL/6 마우스를 사용한 합성섬 이식 모델에서, 250개의 섬을 이식한 결과, 마우스가 고혈당증으로 복귀하기 전에 일시적인 노르모글리혈증이 발생하였다. 500개의 섬을 투여받은 마우스는 이식 후 30일 이상 노르모글리혈증에 도달하고 유지되었다...

토론

이 연구에서는 출혈을 예방하고 마우스 IIT 동안 마우스 사망률을 줄일 수있는 두 가지 개선 된 절차가 입증되었습니다. 이 연구를 통해 연구자들은 이식 후 즉각적인 혈액 매개 염증 반응을 연구하는 데있어 독특한 췌도 이식 모델을 시각화 할 수 있습니다. IIT 모델은 췌도 이식에 대한 반응으로 췌도 세포 생존 및 간 허혈성 손상을 연구하기위한 독특한 모델입니다¹⁹. 여기에서, ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral buffered formalin v/v	Fisher Scientific	23426796
1 mL Syringe with needle	AHS	AH01T
20 mL Syringe	BD	301031
25G x 5/8" hypodermic needles	BD	305122
Alcohol prep pads, sterile	Fisher Scientific	22-363-750
Animal Anesthesia system	VetEquip, Inc.	901806
Buprenorphine hydrochloride, injection	Par Sterile Products, LLC	NDC 42023-179-05
Centrifuge tubes, 15 mL	Fisher Scientific	0553859A
CMRL-1066	Corning	15110CV
DMEM	Corning	10013CV
Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade	Fisher Scientific	BP2818500
Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5882
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35011CV
FreeStyle  Glucose meter	Abbott	Lite
FreeStyle Blood Glucose test strips	Abbott	Lite
Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP)	Pharmacia & Upjohn Company	34201
Graefe forceps 4” extra delicate tip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5136
Heated pad	Amazon	B07HMKMBKM
Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25”	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7850
Insulin syringe with 27-gauge needle	BD	879588
Iodine prep pads	Fisher Scientific	19-027048
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Penicillin/streptomycin (P/S)	HyClone	SV30010
Polypropylene Suture 4-0	Med-Vet International	MV-8683
Polypropylene Suture 5-0	Med-Vet International	MV-8661
Sodium chloride, 0.9% intravenous solution	VWR	2B1322Q
Streptozocin (STZ)	Sigma	S0130
Surgical drape, sterile	Med-Vet International	DR1826
Tissue Cassette	Fisher Scientific	22-272416