초파리 행동 연구를 위한 저렴하고 효율적인 "홈메이드" 플랫폼과 유충 미토콘드리아 호흡 측정을 위한 동반 프로토콜

요약

우리는 "메이커 문화" 마인드를 가진 사람이라면 누구나 필요한 많은 장비를 3D 프린팅하여 Drosophila melanogaster의 수많은 행동 매개변수에 대한 정량적 분석을 위한 플라이랩을 구축하기 시작할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 또한 유충을 사용하여 행동 및 미토콘드리아 대사 데이터를 결합하는 고해상도 호흡 측정 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

인간의 질병, 행동 및 기본 생물학 연구를 위한 모델 유기체로서의 초파리 의 유용성은 의심의 여지가 없습니다. 초파리 연구는 실용적이기는 하지만, 개발도상국에서는 인기가 부족한데, 이는 실험실을 설립하고 그러한 작은 곤충을 가지고 관련 실험을 수행하는 것이 어렵고 값비싸고 전문화된 기구가 필요하다는 잘못된 생각 때문일 수 있습니다. 여기에서는 필요한 많은 장비를 3D 프린팅하여 D. melanogaster의 수많은 행동 매개변수를 정량적으로 분석할 수 있는 저렴한 플라이랩을 구축하는 방법을 설명합니다. 사내 바이알 랙, 구애 경기장, 운동 분석 장치 등을 구축하여 일반적인 파리 유지 관리 및 성충 파리와 유충을 이용한 행동 실험을 수행하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 또한 고해상도 산소 그래프와 같은 보다 정교한 시스템을 사용하여 유충 샘플의 미토콘드리아 산소 소비량을 측정하고 미토콘드리아 대체 산화효소(AOX)의 이종 발현에 대한 유충의 행동 변화와의 연관성을 보여주는 방법에 대한 프로토콜을 제공합니다. AOX는 유충 활동과 미토콘드리아 누출 호흡을 증가시키고 저온에서 발달을 가속화하는데, 이는 효소의 발열 역할과 일치합니다. 우리는 이러한 프로토콜이 특히 개발도상국의 연구자들이 초파리 를 사용하여 행동 및 미토콘드리아 대사 데이터를 쉽게 결합하도록 영감을 주어 인간의 생리학 및 질병 상태를 조절할 수 있는 유전자 및/또는 환경 조건에 대한 정보로 이어질 수 있기를 바랍니다.

서문

초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster )는 100여 년 전에 잠재적으로 강력한 모델 유기체로 과학계에 소개되었습니다. 그 잠재력은 유전학, 진화, 발달 생물학, 신경 생물학, 분자 및 세포 생물학과 같은 생물학 및 생물 의학의 여러 분야에서 확고하게 검증되었습니다. 그 결과, 유전, 돌연변이 유발, 선천성 면역, 일주기 리듬, 후각 및 발달에 대한 이해에 실질적으로 기여한 10명의 초파리 연구자에게 6개의 노벨 의학상 또는 생리학상이 수여되었습니다¹. 아마도 더 중요한 것은 D. melanogaster 가 인간 생물학 및 질병에 대한 새로운 모델을 제공하는 것을 멈추지 않았다는 것인데, PubMed에서 빠른 검색을 통해 "초파리 모델"이라는 검색어를 사용하여 지난 5년 동안 거의 600개의 출판물을 찾을 수 있습니다(², 2021년 2월 기준). 초파리(Drosophila )가 생물의학계에 널리 퍼져 있는 모델 유기체인 미국에서는 2015년 NIH가 수여한 모든 R01 연구상 중 약 2.2%가 초파리 연구자에게 할당되었습니다³. 반면에, 브라질에서는 상파울루 주의 모든 과학 분야의 연구를 위한 가장 중요한 자금 지원 기관인 상파울루 연구 재단(FAPESP)의 웹사이트에서 현재 자금 지원을 받는 프로젝트를 검색한 결과, 초파리 를 주요 연구 주제로 한 연구비 지원 및 펠로우십은 24건에 불과했다⁴. 현재 FAPESP가 자금을 지원한 13,205개 프로젝트(2021년 2월 기준 ^5개)를 모두 고려할 때, 이 24개의 초파리 프로젝트는 전체 프로젝트의 0.2% 미만 비율을 나타내며, 이는 NIH보다 거의 12배 낮습니다. 생태학적 및/또는 진화론적 관점에서 초파리 를 연구하는 것을 목표로 하는 자금 지원 프로젝트를 제거하고 나머지 프로젝트가 이 유기체를 건강과 질병에 대한 인간의 생물학적 과정을 이해하기 위한 모델로 사용한다고 가정하면 그 비율은 충격적인 ~0.1%로 감소합니다.

사실, 브라질/상파울루의 초파리 연구가 자금 지원 프로젝트의 수에서 그다지 중요하지 않은 것처럼 보이는 이유를 밝히기 위해서는 적절한 조사가 필요합니다. 초파리를 배양하는 것은 비싸지 않으며, ^6,7,8 척추동물과 달리 실험을 위해 생명윤리위원회의 허가가 필요하지 않기 때문에 비교적 간단하다^9,10. 그러나 브라질¹¹에서는 유전자 변형 플라이 라인에 대한 승인이 필요하기 때문에 유전자 변형 생물체와 관련된 모든 작업에 내재된 관료주의가 추가됩니다. 그러나 이것이 관심 있는 연구자들이 플라이랩을 시작하는 것을 막지는 못할 것입니다. 우리는 모델의 힘에 대한 잘못된 정보와 플라이랩 설정 및 의미 있는 실험 수행과 관련하여 예상되는 높은 비용에 대한 잘못된 정보가 이 결정에 중요한 요소라고 추측합니다. 대부분의 과학 장비 및 소모품의 경우, 일반적인 파리 유지 관리 및 행동 분석을 수행하기 위한 적절한 장치를 북미, 유럽 및/또는 기타 지역에서 브라질로 수입해야 하며, 이는 비용과 시간이 많이 소요되는 프로세스입니다^12,13.

최근에는 3D 프린터가 더 저렴해지고 개발도상국의 초파리 연구자를 포함한 모든 사람이 접근할 수 있게 됨에 따라 특수 기구를 수입하는 것에 대한 대안이 등장했습니다. 3D 프린팅 기술은 지난 10년 동안 "메이커 문화(maker culture)"의 구성원들에 의해 널리 사용되어 왔으며, 이는 회사에서 제조한 제품에 전적으로 의존하는 것보다 자급자족한다는 아이디어에 기반을 두고 있습니다¹⁴. 이러한 아이디어는 전 세계의 학술 연구 실험실에 항상 존재 해 왔으므로 3D 프린터가 많은 곳에서 표준 실험실 장비가된 것은 놀라운 일이 아닙니다^15,16. 수년 동안 우리는 3D 프린팅 플라이 바이알 랙, 짝짓기 경기장, 등반 기구 등을 브랜드 이름의 동급 제품보다 훨씬 저렴한 비용으로 사용해 왔습니다. 집에서 만든 실험실 장비의 인쇄 및 조립 비용 절감은 고전적으로 FlyPi로 대표되며, 이 제품은 €100.00 미만으로 제작할 수 있으며 유전적으로 다루기 쉬운 제브라피시, 초파리 및 선충의 정교한 광유전학적 자극을 사용할 수 있는 광 및 열유전학적 자극 역할을 합니다¹⁵. 여기에서는 초파리 연구자가 되는 데 관심이 있는 사람(또는 자신의 기존 플라이랩을 확장)하여 필요한 많은 재료를 3D 프린팅하는 데 관심이 있는 모든 사람을 위한 일련의 프로토콜을 제공합니다. 시간을 투자하고 약간의 전문 지식을 개발함으로써 독자는 여기에 제시된 프로토콜을 최적화하여 자신의 연구 요구에 더 잘 맞는 장치를 인쇄할 수도 있습니다.

그러나 플라이랩은 "저렴한" 장비만을 위한 장소가 아니며, 특히 행동 분석을 근본적인 대사 현상과 연관시키려는 경우 더욱 그렇습니다. 우리는 또한 초파리 행동 패턴의 조절에서 미토콘드리아의 역할에 관심을 가지고 있는데, 이 소기관은 산화적 인산화(OXPHOS)로 수렴하는 여러 대사 경로를 통해 대부분의 조직에서 ATP의 대량 생산을 담당하기 때문입니다. 미토콘드리아 산소 소비량을 미토콘드리아 대사를 이해하는 방법으로 분석하려면 옥시그래프가 필요한데, 이는 불행히도 아직 3D 프린팅이 불가능한 보다 정교한 장비입니다. OXPHOS는 세포에서 발생하는 일련의 외환원 산화 환원 반응에 의존하기 때문에 실질적으로 모든 세포 과정에 영향을 미치기 때문에^17,18, 미토콘드리아에 제공된 산화 가능한 기질에 기반한 산소 소비율은 세포 소기관의 기능이 특정 행동의 원인 또는 결과인지 여부를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 우리는 또한 유충 샘플에서 미토콘드리아 산소 소비량을 측정하기 위한 프로토콜을 제공하며, 발표된 프로토콜의 대다수가 성체 샘플 분석에 초점을 맞추고 있다는 것을 알고 있습니다. 우리는 Ciona intestinalis alternative oxidase(AOX)의 형질전환 발현에 의해 유도된 미토콘드리아 호흡의 변화가 추위 스트레스 하에서 유충의 이동성을 증가시킨다는 것을 보여줍니다. AOX는 미토콘드리아 막 전위(ΔΨm) 및 ATP 생성 19,20,21에 기여하지 않고 OXPHOS 복합체 III 및 IV(CIII 및 CIV)의 활성을 우회할 수 있는 비양성자 펌핑 말단 산화효소이기 때문에 이는 열 발생 때문일 가능성이 가장 높습니다. 초파리(Drosophila)나 척추동물을 포함한 어떤 곤충도 자연적으로 AOX 21,22,23을 가지고 있지 않지만, 무수한 모델 시스템(24,25,26,27,28,29)에서의 AOX 발현은 특히 CIII 및/또는 CIV에 의해 유발될 때 일반적인 미토콘드리아 호흡 스트레스 상태에 대한 치료 잠재력을 보여주기에 성공적이었다 오버 로드. AOX는 독성 수준의 항마이신 A²⁴ 및 시안화물 ^24,25에 대한 내성을 부여하고 미토콘드리아 기능 장애와 관련된 다양한 표현형을 완화합니다 24,25,30,31,32. AOX 발현이 유충 행동과 미토콘드리아 기능을 변화시킨다는 사실은 후생동물 세포와 조직의 대사 및 생리학에서 이 효소의 역할에 대한 보다 심층적인 연구를 정당화합니다^33,34.

우리는 이 기사를 통해 브라질과 같은 개발도상국의 과학계 내에서 D. melanogaster 가 제시하는 우수한 유전 도구 세트를 행동 분석을 위한 효율적이고 저렴한 수제 장치와 함께 사용하여 상당한 번역 영향을 미치는 흥미로운 생물학적 과정에 대한 비교적 빠른 기본 연구 데이터를 생성할 수 있다는 인식을 높이는 데 도움이 되기를 바랍니다. 임상 연구에서 미래의 치료 연구를 지원합니다. 그러한 공동체적 이상을 발전시키는 것은 초파리주의자, 의학 연구자, 생물학 및 생물 의학에 큰 도움이 될 것이다. 가장 중요한 것은 공적 자금이 인간 질병을 이해하고 치료하는 데 더 번역적으로 사용될 수 있기 때문에 사회 전반에 도움이 될 것이라는 것입니다.

플라이랩용 장치의 3D 프린팅을 위해 여기에서 제공하는 프로토콜은³⁵에서 사용할 수 있는 Prusa I3 DIY 모델을 기반으로 RepRap 3D 프린터와 함께 사용하도록 설계되었습니다. 우리는 1.75mm 백색 폴리락트산(PLA) 필라멘트(SUNLU)를 인쇄용 원료로 사용하고, 모델 설계를 위한 Tinkercad 플랫폼³⁶ 을 사용하며, STL에서 G 코드로 변환하기 위해 Repetier-Host 소프트웨어³⁷ 을 프린터에 좌표를 제공하는 데 필요한 단계로 사용합니다. 독자가 대체 장비, 재료 및 소프트웨어를 사용하려는 경우 프로토콜의 추가 최적화가 필요합니다.

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프로토콜

1. 3D 모델 설계

참고: 3D 프린팅을 위한 작업 흐름에는 세 가지 기본 단계가 있습니다: (1) 3D 모델링; (2) 모델을 슬라이싱 소프트웨어로 가져오는 단계; (3) 올바른 필라멘트 선택, 프린터 구성, 마지막으로 인쇄. 소형 플라이 바이알 랙/트레이를 모델링하기 위한 기본 프로토콜은 다음과 같습니다. 이 랙은 직경이 약 2.5cm, 높이가 약 9.8cm인 표준 플라이 바이알과 함께 사용됩니다. 새로운 모델 설계의 경우 Tinkercad 소프트웨어에서 제공하는 도구를 사용하면 자신의 필요에 따라 다양한 모양, 크기 및 두께의 조각을 만들어 3 차원 구조를 쉽게 처리 할 수 있습니다. 3D 프린팅 영역에 처음으로 발을 들여놓는 초파리스트의 경우 모든 세부 사항에도 불구하고 아래 프로토콜을 따르는 것이 여전히 어려울 수 있으므로 최상의 결과를 위해 소프트웨어에 익숙해지는 것이 좋습니다.

1. Tinkercad 온라인^{로그인 38} (그림 1A). 플랫폼에 무료로 액세스하려면 사전에 개인 정보를 등록해야 합니다.
2. 새 프로젝트 만들기를 클릭하여 새 디자인을 시작하고 창의 오른쪽 상단 모서리에 있는 프로젝트 이름을 적절하게 바꿉니다. Enter 키를 눌러 프로젝트의 작업 평면으로 이동합니다(그림 1B).
3. 오른쪽 아래 모서리에 있는 Edit Grid (그리드 편집)에서 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 작업 평면의 치수가 200mm x 200mm인지 확인합니다( 그림 1B의 빨간색 사각형). 팝업 창(그림 1C)에서 "단위"가 밀리미터이고 "사전 설정"이 기본값인지 확인합니다. "Width(너비)"와 "Length(길이)" 필드에 200.00을 입력하고 Update Grid(그리드 업데이트 )를 클릭하여 변경 사항을 저장합니다.
4. Snap Grid가 1.0mm(그림 1B의 빨간색 사각형)로 설정되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 드롭다운 메뉴를 클릭하고 1.0mm를 선택합니다.
5. 오른쪽의 Basic Shapes 메뉴( 그림 1B의 파란색 사각형 2)에서 솔리드 상자를 선택하고 작업 평면의 중앙으로 드래그합니다.
6. 마우스 왼쪽 버튼이 있는 작업 평면의 상자 아무 곳이나 클릭하여 가장자리와 정점을 확인합니다. 정점(그러면 빨간색으로 바뀜)을 클릭하여 상자 치수( 그림 1D의 빨간색 사각형)를 표시합니다. 각 치수를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 길이(L)에 130mm, 너비(W)에 130mm, 높이(H)에 40mm를 입력합니다. 상자를 작업 평면의 가운데로 끌어 중심을 다시 맞춥니다.
7. 화면의 오른쪽 상단 모서리에 있는 도구 Ruler ( 그림 1E의 빨간색 사각형 1)를 클릭합니다. 그림 1E (빨간색 사각형 2)와 같이 상자의 왼쪽 하단 정점을 즉시 클릭하여 3차원 데카르트 좌표계의 초기점(x = 0, y = 0, z = 0)을 설정합니다. 이제 선택한 정점과 좌표 초기점 사이의 거리가 표시되며( 그림 1F의 빨간색 사각형), 여기서 "A", "B" 및 "C"는 각각 x, y 및 z 축(이 경우 0이어야 함)까지의 거리를 나타냅니다.
8. 그런 다음 오른쪽의 Basic Shapes 메뉴에서 빈(구멍) 상자( 그림 1B의 파란색 사각형 2)를 선택하고 작업 평면으로 드래그합니다. 치수를 30(L) x 30(W) x 40(H) mm로 설정하고 빈 상자( 그림 1G의 빨간색 사각형)의 오른쪽 아래 모서리에 있는 녹색 화살표 옆의 텍스트 상자에 "2.00"을 입력하여 작업 평면에서 2mm 들어 올립니다. 상자의 왼쪽 아래 모서리에 있는 녹색 화살표 옆의 텍스트 상자에 "2.00"을 입력하여 x,y 좌표 초기점에서 2mm 떨어진 단색 상자 안에 빈 상자를 배치합니다( 그림 1H의 빨간색 사각형, 그림 1G와 비교).
9. 빈 상자를 선택한 상태에서 키보드의 CtrL+D 키를 눌러 "복제" 명령을 배포하고 정확히 동일한 치수의 새 빈 상자를 만듭니다. y축을 따라 녹색 화살표 옆의 텍스트 상자에 "34.00"을 입력하고, 나머지 두 개의 녹색 화살표( 그림 1I의 빨간색 사각형) 옆의 텍스트 상자에 "2.00"을 입력하여 실선 상자 안의 첫 번째 빈 상자 옆에 있는 새 빈 상자를 배치합니다.
10. 이 단계를 반복하여 전체 솔리드 상자가 서로 2mm 간격의 빈 상자로 채워질 때까지 좌표 초기점으로부터 올바른 거리를 조정합니다(그림 1J).
11. 마우스의 왼쪽 버튼을 클릭하고 전체 영역으로 드래그하여 모든 상자(단색 및 빈 상자)를 선택합니다. 키보드의 CtrL+G 키를 눌러 "group" 명령을 배포하고 플라이 바이알을 위한 16개의 빈 공간이 있는 단일 상자를 만듭니다(그림 1K). 이것이 바이알 랙의 최종 디자인입니다.
12. Tinkercad 창의 오른쪽 상단 모서리에 있는 내보내기를 클릭합니다. 표시된 창 상자(그림 1L)에서 Include(포함) 옆에 있는 Everything(디자인)을 선택하고 를 선택합니다. 3D 인쇄의 경우 아래의 STL을 파일 형식으로 선택합니다. 설계 파일의 적절한 이름을 선택하고 컴퓨터의 적절한 위치에 저장합니다.

2. 3D 인쇄

참고: 이 섹션에서는 1단계에서 만든 STL 파일을 사용하는 방법과 인쇄 지침이 포함된 G-Code 파일로 3D 프린터로 변환하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이것은 Repetier-Host 소프트웨어를 사용하는 슬라이싱 프로세스입니다.

1. 추가 파일 1을 다운로드하여 컴퓨터의 적절한 위치에 저장합니다. 이것은 아래에서 사용할 프린터 구성을 포함하는 .rcp 파일입니다. .rcp 파일 형식에 대한 자세한 내용은³⁹를 참조하십시오.
2. ³⁷의 지침에 따라 컴퓨터에 이미 설치되어 있어야 하는 Repetier-Host 소프트웨어를 엽니다. 키보드의 CtrL+O 키를 눌러 프로토콜 1에서 만든 컴퓨터에서 STL 파일을 엽니다.
3. 열리면 설계된 바이알 랙을 클릭하고 키보드의 R 키를 눌러 화면 오른쪽에 있는 편집 메뉴를 엽니다(그림 2A의 빨간색 사각형 1). Object Placement 탭에서 그림 2A에서 빨간색 사각형 2로 표시된 Center Object 버튼을 클릭하여 인쇄 테이블에서 개체를 중앙 집중화합니다.
4. Object Placement 탭 옆에 있는 Slicer 탭(그림 2B의 빨간색 사각형 1)을 클릭한 다음 아래의 구성 버튼(그림 2B의 빨간색 사각형 2)을 클릭합니다. 왼쪽의 새 창이 열리면 속도, 레이어 두께 및 홀더와 같은 프린터 매개변수를 정의할 수 있습니다(자세한 내용은 아래 논의 참조).
5. Import 버튼(그림 2E의 빨간색 사각형 3)을 클릭하고 파일에서 Supplemental File 1을 선택한 다음 Enter 키를 누릅니다. 이 .rcp 파일(2.1단계에서 다운로드)은 이 바이알 랙에 최적화된 프린터의 자동 구성을 위한 매개변수를 제공합니다.
6. 인쇄 매개변수 구성을 완료하려면 오른쪽 메뉴(그림 2E의 빨간색 사각형 4)에서 지지 유형에 대해 없음을 선택합니다. 이 조각의 인쇄에는 굽힘이나 기타 변형을 방지하기 위한 지지대가 필요하지 않습니다. Infill Density(그림 2E의 빨간색 사각형 5)에서 20%를 선택하여 솔리드 구조를 만듭니다(이러한 매개변수에 대한 자세한 내용은 아래 논의 참조).
7. 화면 오른쪽 상단 모서리에 있는 Slice with CuraEngine을 클릭하여 슬라이싱 프로그램을 실행하고 프린터가 조각을 인쇄하는 데 필요한 정보가 포함된 G-Code를 생성합니다. 오른쪽 메뉴(슬라이서 탭 옆)의 인쇄 미리보기 탭 아래에 인쇄 작업을 완료하는 데 필요한 시간과 재료의 양에 대한 정보가 표시됩니다(그림 2F의 빨간색 사각형 1).
8. Save for SD Print를 클릭하여 G-Code 파일을 SD 카드(그림 2F의 빨간색 사각형 2)에 저장합니다. G-Code에는 프린터의 적절한 기능을 위해 레이어로 슬라이스된 설계된 조각의 3D 좌표가 포함되어 있습니다.
9. RepRap 3D 프린터에 SD 카드를 삽입한 다음 프린터 화면에 표시된 정보에 따라 SD 카드에서 인쇄를 선택합니다.
10. 바이알 랙의 G-Code 파일을 선택합니다. 프린터가 자동으로 예열되고 디자인된 조각의 인쇄를 시작하며 몇 시간이 걸립니다. 랙(그림 3A)은 인쇄 작업이 완료된 직후 사용할 수 있어야 합니다.

3. 행동 분석 장치

참고: 프로토콜 1 및 2에 설명된 단계를 적절하게 조정하여 필요한 여러 실험실 장비를 인쇄할 수 있습니다. 그러나 Tinkercad의 초보 사용자에게는 새로운 조각을 설계하는 것이 어렵고 시간이 많이 소요될 수 있으므로 모든 모델을 설계하는 방법에 대한 단계별 프로토콜을 제공하는 대신 STL 파일로 만든 여러 설계 모델을 다운로드할 수 있도록 하고 있습니다( 보충 파일 2-11 참조).

1. 작은 깔때기 모델(그림 3B)에 대한 보충 파일 2를 다운로드하면, 파리가 탈출하기 위해 이러한 용기의 내벽을 기어오르는 것을 방지하여 성체 파리를 새 바이알 또는 병으로 옮기는 데 도움이 되는 플라이랩에서 일상적으로 사용됩니다.
2. 에틸렌-비닐 아세테이트 폼 또는 갓 만든 식품이 담긴 새 용기에 파리를 넣을 때 유리병이나 병을 두드릴 수 있는 두꺼운 면 매트를 고정할 수 있는 태핑 매트 지지대(그림 3C)에 대한 추가 파일 3을 다운로드하십시오.
3. Stalker라고 명명한 카메라 스탠드 모델에 대한 추가 파일 4 및 추가 파일 5 를 다운로드합니다(그림 3D).
   알림: 이 장치를 사용하면 모든 카메라(전문가, 웹캠, 휴대폰 등)를 유충이나 성충 파리가 들어 있는 페트리 접시를 이미지화하거나 비디오로 녹화할 수 있는 베이스 위에 배치할 수 있습니다. Stalker를 사용하면 페트리 접시에서 항상 같은 거리를 두고 수평으로 발생하는 동물 행동을 이미징할 수 있으며, 예를 들어 다른 날에 녹화해야 하거나 녹화 사이에 다른 목적으로 카메라를 사용해야 하는 경우 실험 측정에 변동성이 발생하지 않습니다. 이 장치는 편리하게 모듈식이며 보충 파일 4에서 바닥과 상단을 인쇄하고 보충 파일 5에서 측면을 인쇄한 후 쉽게 조립할 수 있습니다. 영구 마커를 사용하여 강조 표시할 수 있는 바닥의 1cm² 칸은 개별 동물의 이동 거리를 추적하는 데 도움이 됩니다. 흰색 필라멘트를 사용하여 장치(최소한 바닥)를 인쇄하여 추적 소프트웨어가 각 파리를 식별할 수 있도록 배경과 동물 사이에 충분한 대비가 있도록 합니다.
4. 한 번에 10개의 개별 짝짓기 쌍의 비디오 녹화를 용이하게 하는 방식으로 조직된 10개의 구애 및 짝짓기 경기장(방)이 있는 Fly Motel(그림 3E)의 인쇄 가능한 디자인에 대한 추가 파일 6을 다운로드하십시오. Fly Motel은⁴⁰에 발표 된 장치를 기반으로하며, 여기에서 행동 연구에서의 사용에 대한 자세한 설명이 있습니다. 3D 프린팅 부품 외에도이 장치는 조립 된 장치를 안정화하기 위해 상부를 하부 부품에 고정하기위한 12 개의 나사 (3 x 8mm), 아크릴 판 (60 x 60 x 3mm) 및 지퍼 타이트가 필요합니다. Fly Motel의 구조는 더 복잡하기 때문에 필요한 모든 부품과 드라이버를 사용할 수 있다는 점을 감안할 때 올바르게 조립하는 방법에 대한 교육용 비디오(보충 파일 7)도 제공합니다.
5. 성충 파리를 사용한 기억 분석에 사용되는 T-Maze 모델(그림 3F)에 대한 보충 파일 8을 다운로드하십시오. T-Maze가 어떻게 파리로 하여금 혐오스러운 냄새 자극을 광방성 행동과 연관시키는지에 대한 자세한 설명은 원문⁴¹에서 찾을 수 있다. 이 장치는 또한 모든 실험실에서 흔히 볼 수 있는 두 개의 반투명 15mL 원뿔형 튜브를 사용하며 중앙 조각의 각 측면에 있는 2cm 너비의 원형 개구부에 부착되어 있습니다. T-Maze를 인쇄하려면 지지대가 필요합니다(자세한 내용은 그림 2의 범례 참조). 위의 2.1-2.6단계를 수행한 후 지원 유형(그림 4E의 빨간색 사각형 2.6)에 대해 "Everywhere"를 선택합니다.
6. 여러 유전자형 또는 환경 조건의 성충 파리와 동시에 등반 분석을 수행하여 보다 표준화되고 더 높은 처리량의 결과를 생성하는 데 사용되는 RING(Rapid Iterative Negative geotaxis) 분석(RING) 분석(그림 3G)을 위한 장치 버전의 인쇄 가능한 부분 설계에 대한 추가 파일 9 및 추가 파일 10 다운로드⁴². RING 장치는 또한 모듈식이며 3D 프린팅 부품 외에도 온라인이나 철물점에서 저렴한 비용으로 쉽게 구입할 수 있는 다른 부품이 필요합니다: Φ8 x 300mm 정류 샤프트 2개, Φ8mm 선형 베어링 4개, 고무 밴드(또는 끈 조각), 베이스용 240 x 60 x 20mm 나무 조각, 인쇄된 부품을 나무 바닥에 고정하기 위한 8개의 나무 나사(8mm). 추가 다운로드 File 11 모든 부품을 인쇄하거나 구매한 후 장치를 조립하는 방법에 대한 지침을 확인하십시오. RING 장치 사용 방법에 대한 자세한 설명은 원본 출판물⁴²에 나와 있습니다.

4. 유충 이동성 분석

참고: 우리는 원래 Nichols et ^al.42를 기반으로 한 이 프로토콜을 최적화하여 저온 스트레스 하에서 초파리 발달에 대한 AOX 발현의 영향을 연구했습니다. AOX 발현 유충 및 대조군 유충의 예로서 각각 사용된 3xtubAOX²⁵ 및 w¹¹¹⁸ 라인은 Saari et al.34에 따라 12°C에서 표준 사료²⁴로 배양하였다. 관심 있는 환경 조건에서 배양된 모든 유전적 조건의 유충 샘플의 이동성을 분석하기 위해 이 프로토콜을 권장합니다.

1. 2% 한천 플레이트를 탈이온수에 등량의 한천을 끓여 Φ90 X 15mm 페트리 접시에 붓고 실온에서 응고시켜 준비합니다. 최종 부피가 각각 20mL인 플레이트의 경우 0.4g의 한천을 사용합니다.
2. 한 쌍의 둥근 팁 집게 또는 브러시를 사용하여 배양 바이알/플라스크 측면에서 떠돌이 L3 유충을 조심스럽게 수집하고 개체를 탈이온수가 담긴 Φ90 x 15mm 페트리 접시에 10초 미만 동안 놓고 몸에 부착된 음식물 입자를 헹굽니다.
3. 개별 유충을 아가로스가 있는 접시에 옮기고 동물이 적응할 때까지 5분 동안 기다립니다.
4. 개별 유충이 들어있는 접시를 그래프 용지 (0.2cm² 그리드) 위에 놓고 동물이 한천 위로 이동할 때 1 분 동안 동물이 교차하는 선의 수를 세십시오. 교차하는 각 선은 2mm의 거리를 나타냅니다. 동일한 개인으로 절차를 10-15회 반복하여 기술적 복제를 얻습니다.
5. 서로 다른 튜브/플라스크에서 최소 8-10명의 개인을 대상으로 4.4단계를 반복하고, 서로 다른 시간에 배양하여 동일한 라인의 생물학적 복제를 얻습니다.
6. 4.4단계와 4.5단계를 반복하여 다른 플라이 라인(또는 분석하려는 만큼의 라인)에 대한 데이터를 얻습니다.
7. 단계 4.4-4.6에서 사용된 동일한 개별 유충을 사용하여 개별 유충이 있는 한천 접시를 실체 현미경 아래에 놓고 1분 동안 체벽의 연동 수축 횟수를 계산하여 신체 움직임에 대한 추가 데이터를 얻을 수 있습니다. 분석된 플라이 라인 간의 평균 이동성을 추정하기 위해 기술 및 생물학적 복제물을 얻습니다.
8. 통계적 테스트를 적용하여 이러한 유충 이동성 매개변수의 값이 관심 라인 간에 뚜렷할 확률을 계산합니다. 여기서는 두 줄의 데이터만 비교하기 때문에 학생의 t 테스트가 적용될 수 있습니다.

5. 유충 균질산을 이용한 미토콘드리아 호흡량 측정

참고: 다음 프로토콜은 12°C에서 배양된 AOX 발현 라인 3xtubAOX 및 대조군 w¹¹¹⁸의 유충 균질체에서 미토콘드리아 산소 소비량을 측정하기 위해 최적화되었지만, 모든 유전적 및 환경적 조건의 유충 샘플에도 사용할 것을 권장합니다. 우리는 실험실이 고해상도 옥시그래프를 획득하기 위해서는 상당한 초기 투자가 이루어져야 하기 때문에 이 기사에서 제공하는 다른 모든 프로토콜과 달리 이러한 실험을 수행하는 것이 "집에서 만든" 플라이랩의 "저렴한" 목표로 포함되어서는 안 된다는 것을 알고 있습니다. 이 프로토콜은 Oroboros Instruments의 Oxygraph-2k(O2k) 및 DatLab 소프트웨어와 함께 사용되므로 판독기가 대체 장비를 사용하려는 경우 추가 최적화가 필요합니다.

1. O2k를 켜고 산소 그래프에 연결된 컴퓨터에서 DatLab 소프트웨어를 시작합니다. 분석 챔버 내부의 마그네틱 바가 자동으로 교반을 시작해야 합니다. 챔버에서 에탄올 저장 용액을 제거합니다.
2. 챔버를 100% 에탄올로 최소 3회, 초순수로 3회 세척합니다.
3. DatLab에서 O2k Control 창이 자동으로 열립니다. 블록 온도[°C]에 12°C(또는 2-47°C 범위의 원하는 온도)를 입력하고 OK를 누릅니다.
4. 그러면 두 번째 창인 실험 편집이 자동으로 열립니다. 챔버 A와 B에 추가될 내용에 따라 Sample 필드에 샘플 이름을 입력하고 Save를 누릅니다.
5. 각 챔버에 1800 μL의 분석 완충액(120 mM KCl, 5 mM KH₂PO₄, 3 mM Hepes, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 2% BSA, pH 7.4)을 추가하고 부분적으로 닫아 외부 공기와 산소를 교환합니다. 산소 농도와 산소 플럭스 신호가 안정화되어 최소 10분 동안 최소한의 변동을 보이도록 합니다. 이 단계는 실험 당일 외부 공기로 장비의 보정을 제공합니다(실험 보정에 대한 자세한 내용은 아래 6.3 및 6.4 단계 참조).
6. 공기 보정 단계에서는 한 쌍의 집게 또는 작은 붓을 사용하여 배양 튜브/플라스크에서 적절한 유전자형의 떠돌이 유충 20마리를 조심스럽게 수집하여 샘플 준비를 시작합니다.
7. 각 유충을 탈이온수 또는 1x PBS(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 8mM Na2_HPO4 및 2mM KH_2PO4)로 빠르고 철저하게 헹구고 500μL의 얼음-저온 분리 완충액(250mM 자당, 5mM Tris HCl, 2mM EGTA, pH 7.4)
8. 5번의 스트로크로 전체 유충을 균질화하고 균질액을 얼음 위의 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 붓습니다.
9. 유리 균질기에 300μL의 분리 완충액을 추가하고, 남은 유충 조직을 3회 더 침식한 다음, 균질액을 얼음 위의 동일한 마이크로 원심분리기 튜브에 다시 붓습니다.
10. 유리 균질기에 200μL의 분리 완충액을 추가하고, 잔류 유충 조직을 2회 더 침식한 다음, 균질화를 얼음 위의 동일한 마이크로 원심분리기 튜브에 다시 붓습니다.
11. 튜브를 부드럽게 두 번 뒤집어 최종 균질액(~1mL)을 혼합하고 두 번째 샘플이 처리될 때까지 얼음 위에 보관합니다.
12. 5.6-5.11단계를 반복하여 다른 유전자형의 유충 균질성을 얻습니다.
13. 옥시그래프 챔버 A와 B를 열고 각 균질액 200μL를 각 챔버의 분석 버퍼로 이동시키며, 이 시점에서 정확히 12°C여야 합니다. 챔버를 완전히 닫고 산소 농도와 산소 플럭스 신호가 약 10분 동안 안정화되도록 합니다.
14. 각 챔버에 2M 피루브산 용액 5μL, 프롤린 2M(챔버 내 최종 농도 = 각각 5mM) 및 0.4M 말레이트(1.5mM) 용액 7.5μL를 추가하여 산소 소비량 측정을 시작합니다. 신호 안정화를 위해 최소 5분을 허용합니다. 이 시점에서 미토콘드리아는 트리카르복실산(TCA) 주기 반응을 시작하기 위해 산화가능한 기질로 충전됩니다. 산소 소비 신호의 증가는 단백질 분리의 기능(또는 다른 분리 현상으로 인해)으로 인한 것일 수 있으며, 일반적인 비결합 호흡(아데닐레이트가 없는 경우 누출 호흡이라고도 함, L_N- 자세한 내용은 대표 결과 참조)을 계산하는 데 사용할 수 있습니다.
15. 각 챔버에 0.5M ADP(1mM) 용액 4μL를 추가하고 신호 안정화를 위해 최소 5분을 허용합니다. 산소 소비량 신호의 현저한 증가는 일반적으로 즉시 관찰되며, 이는 산화적 인산화(OXPHOS) 호흡을 나타냅니다. 이 OXPHOS 호흡의 대다수는 복합체 I(CI)에 의해 주도됩니다.
16. CIII를 억제하기 위해 0.05M 안티마이신 A(0.05mM) 용액 2μL를 각 챔버에 첨가하고 신호 안정화를 위해 최소 5분을 허용합니다. w¹¹¹⁸ 대조군 샘플에 대해 피루브산, 프롤린 및 말레이트를 첨가하기 전에 보였던 기저 수준까지 산소 소비 신호의 감소를 관찰해야 합니다. AOX 발현 유충의 미토콘드리아 호흡은 이제 전자가 AOX로 향할 수 있기 때문에 antimycin-A에 부분적으로 내성이 있습니다. 전체 OXPHOS 호흡의 약 40%는 CIII 억제 후에도 유지되어야 하며, 이는 모두 AOX에 의해서만 지원되어야 합니다.
17. AOX를 억제하기 위해 0.1M 프로필-갈레이트(0.2mM) 용액 4μL를 각 챔버에 첨가하고 신호 안정화를 위해 최소 15분을 허용합니다. AOX 발현 유충 샘플의 산소 소비량 수준은 이제 피루브산, 프롤린 및 말산염을 첨가하기 전에 볼 수 있는 기저 수준으로 감소해야 합니다. 이러한 감소는 관찰된 항마이신-A 저항성 호흡이 AOX 기능 때문이라는 것을 증명합니다.
18. CI를 억제하기 위해 각 챔버에 1μL 0.01M 로테논(0.005mM)을 추가하고, 미토콘드리아 호흡과 무관하게 샘플의 산소 소비 신호를 얻기 위해 신호 안정화에 최소 5분을 허용합니다. 이 신호는 일반적으로 피루브산, 프롤린 및 말레이트를 첨가하기 전에 관찰된 것만큼 낮습니다.
19. 실험을 저장하고 DatLab 소프트웨어를 닫습니다.

6. 미토콘드리아 호흡량 측정 데이터 처리

참고: 산소 소비량 값은 결정된 기간 동안 산소 플럭스 신호의 평균으로 얻어지며 샘플의 총 단백질 mg당 초당 소비된 pmol O₂ 로 표시됩니다. 값은 실험 온도(공기 포화도라고 함) 및 최소 산소 농도를 기반으로 실험 당일 분석 버퍼에서 사용할 수 있는 최대 산소 농도에 대해 먼저 참조되며, 이는 분석 버퍼에_Na2S₂O₄ 를 추가하여 각 챔버에서 미리 측정됩니다( ⁴³ 참조 무산소 보정을 얻기 위한 제조업체의 지침). 값은 또한 각 챔버의 분석 완충액에 추가된 유충 균질액의 총 단백질의 양에 의해 정규화됩니다.

1. Bradford 방법⁴⁴를 사용하여 각 샘플의 총 단백질 농도를 측정합니다. DatLab 소프트웨어에서 저장된 실험을 다시 열고 상단 메뉴에서 실험을 누른 다음 편집을 누릅니다. 열린 창의 Unit 섹션에서 mg를 선택하고 Amount 섹션에서 각 챔버에 추가된 200μL의 샘플에 포함된 단백질 양을 입력합니다. 농도는 2mL의 총 챔버 부피를 고려하여 소프트웨어에 의해 자동으로 계산됩니다. 저장 버튼을 누릅니다.
2. 상단 메뉴에서 Graph 를 누른 다음 Select plots를 누릅니다. 열린 창에서 두 그래프(각각 챔버 A와 B를 나타내는 1과 2)에 대해 Flux per mass 를 선택합니다. 확인을 누릅니다. 실험 결과는 이제 샘플의 단백질 농도(pmol O₂/s/mg 총 단백질)에 의해 정규화됩니다.
3. 주요 실험 결과 페이지의 각 그래프(1 및 2)의 오른쪽 상단 모서리에서 O₂ 농도를 클릭합니다. x축을 따라 챔버에 샘플을 추가하기 전의 시간 범위를 식별하며, 여기서 산소 농도와 플럭스 신호가 매우 안정적입니다.
   1. 컴퓨터 키보드의 Shift 키를 누른 상태에서 처음 선택한 시간을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 시간 축을 따라 커서를 끌어 원하는 영역을 선택한 다음 마우스 버튼을 놓습니다. 각 그래프에 대해 이 절차를 개별적으로 수행합니다.
   2. 그래프 아래쪽에서 선택한 영역의 파란색 막대를 두 번 클릭하고 "air"를 입력하여 산소 공기 포화도를 계산하는 데 사용되는 선택된 영역임을 나타냅니다.
4. 상단 메뉴 표시줄에서 Calibration(보정 )을 클릭하고 A: Oxygen, O₂ 를 선택하여 챔버 A를 보정합니다. 열린 창에서 O₂ Calib 가 선택되어 있는지 확인합니다(노란색).
   1. 영점 보정의 경우 파일에서 복사를 클릭하고 이전에 수행된 제로 산소 보정이 있는 파일을 선택합니다(제조업체 지침은 ⁴³ 참조).
   2. 공기 보정의 경우 마크 선택 열에서 공기를 선택합니다. Calibrate and copy to clipboard(보정하고 클립보드에 복사)를 클릭합니다.
5. 상단 메뉴 표시줄에서 Calibration 을 클릭하고 B: Oxygen, O₂ 를 선택한 다음 6.4단계를 반복하여 챔버 B를 보정합니다.
6. 주요 실험 결과 페이지의 각 그래프(1 및 2)의 오른쪽 상단 모서리에서 질량당 O₂ 플럭스를 클릭합니다. 키보드의 Shift 키를 누른 상태에서 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하고 시간 축을 따라 커서를 드래그하여 산소 소비 신호의 원하는 안정적인 영역을 선택합니다. 피루브산/프롤린/말레이트 및 ADP의 첨가 사이에서 선택된 안정 영역은 L_{, N}을 나타냅니다. ADP와 항마이신 사이 A, OXPHOS; 항마이신 A와 프로필 갈레이트 사이(CIII 억제 시), 항마이신 A 내성 호흡; 프로필 갈레이트와 로테논 사이 (CIII + AOX 억제시), 잔류 호흡; 로테논 후(CI+CIII+AOX 억제 시), 잔류 비미토콘드리아 호흡. 그래프 아래쪽에서 선택한 영역의 빨간색 막대를 두 번 클릭하고 적절한 레이블을 입력합니다.
7. 상단 메뉴 표시줄에서 Marks(마크 )를 클릭한 다음 Statistics(통계)를 클릭합니다. 열린 창의 표시 탭에서 질량당 O₂ 플럭스를 제외한 모든 옵션의 선택을 취소합니다. 동일한 창의 선택 탭에서 챔버 A를 선택하여 첫 번째 샘플에 대한 호흡 데이터를 얻습니다. 클립보드에 복사 를 클릭하고 데이터를 스프레드시트에 붙여넣습니다. 절차를 반복하여 챔버 B의 두 번째 샘플에 대한 데이터를 얻습니다.
8. 스프레드시트에서 모든 호흡 값을 잔류 비미토콘드리아 호흡(로테논 덧셈 후의 데이터)으로 뺍니다. 여러 실험 반복실험에서 평균을 계산하고 원하는 대로 데이터를 플로팅합니다.

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결과

프로토콜 1 및 2의 단계를 따르면 간단한 플라이 바이알 랙을 설계하고 슬라이싱 프로그램을 통해 모델 STL 파일을 실행하여 3D 프린터의 좌표를 생성할 수 있습니다. 그림 3A는 설계 옆에 인쇄된 모델 단위를 보여줍니다. 또한 1단계를 통해 Tinkercad 플랫폼에서 사용할 수 있는 기본 모양을 사용하여 실험실에 유용한 장치를 만들 수 있는 기본 기술을 제...

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토론

여기에 제공된 3D 프린팅 프로토콜 및 STL 파일은 "홈메이드" 장비를 사용하여 새로운 플라이랩의 설정을 용이하게 하거나 기존 초파리 행동 시설의 장치 레퍼토리를 늘리기 위한 것입니다. 3D 프린팅 전략은 브라질과 같은 개발도상국에서 특히 유용할 수 있는데, 브라질에서는 초파리 를 인간 생물학 연구를 위한 모델 유기체로 사용하는 연구가 충분히 이루?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer RapRep			A popular 3D-printer based on the Prusa I3 DIY mode, instructions available in https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/
3xtubAOX fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line expressing the AOX gene from C. intestinalis under the control of the constitutive α-tubulin promoter. 5 and 6 copies of this construct are present in males and females in homo/hemizigosity, respectively, one in each of the chromosomes X, 2 and 3.
Acrylic plate			60 x 60 x 3 mm
ADP	Sigma-Aldrich	A2754	Adenosine 5′-diphosphate sodium sal (CAS number 20398-34-9); ≥95%; molecular weight = 427.20 g/mol; solubility in water at 50 mg/ml
Antimycin-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimycin A from Streptomyces sp. (CAS number 1397-94-0); molecular weight ~ 548.63 g/mol; solubility in 95% ethanol at 50 mg/mL
Agar	Kasv	K25-611001	For bacteriologal use; powder; solidifying agent (12-20 g/L)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free (CAS number 9048-46-8);pH 7; ≥98%; solubility in water 40g/ml
Deionized water
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CAS number 67-42-5); ≥97%; molecular weight = 380.35g/mol
Ethanol 99.5%
Ethylene-vinyl acetate foam			Can be replaced with thick pieces of cotton
Graph paper			0.2 cm2 grid
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (CAS number 7365-45-9), BioPerformance Certified; ≥99,5% (titration), cell cultured tested; molecular weight =238.30g/mol
Homogenizer	Sartorius		Hand glass homogenizer (S), 1 mL; composed of a cylinder made of borosilicate glass plus plunger S; often used for simple sample preparation, e.g. crushing of tissue samples.
KCl	Amresco	0395-2	Potassium chloride (CAS number 7447-40-7); ≥99,0%; molecular weight = 74.55g/mol
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Potassium phophate monobasic (CAS number 7778-77-0); ReagentPlus; molecular weight = 136.09g/mol
Linear bearings (LM8UU)			8 mm, any brand
Malate	Sigma-Aldrich	M1000	L-(-)-Malic acid (CAS number 97-67-6); ≥95-100%; molecular weight = 134.09 g/mol), solubility in water: 100 mg/mL. A solution is pH adjusted to approximately 7.0.
MgCl2	Amresco	0288-1KG	Magnesium chloride, hexahydrate (CAS number 7791-18-6); 99%-102%; molecular weight = 203.3g/mol
Microcentrifuge tubes			1.5mL; Graduated every 100µL, autoclavable
Na2HPO4	Amresco	0348-1KG	Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (CAS number 7782-85-6); 98-102%; molecular weight = 268.07 g/mol
NaCl	Honeywell	31434-1KG	Sodium chloride (CAS number 7647-14-5); ≥99,5%; molecular weight 58,44g/mol. For laboratory use only.
Oxigraph-O2k	Oroboros	10000-02	Series D-G; O2k-Core: includes O2k-Main Unit with stainless steel housing, O2k-Assembly Kit, two OroboPOS (polarographic oxygen sensors) and OroboPOS-Service Kit, DatLab software, the ISS-Integrated Suction System and the O2k-Titration Set.
Permanent marker			Preferably black
Petri dishes			90 X 15 mm dishes; commonly used for bacteriological culture
PLA 3D Printing Filament	Quantum3D Printing	http://quantum3dprinting.com/	High quality polylatic acid filament (PLA), strongly recomended, (1.0 kg Roll), any brand
Proline	Sigma-Aldrich	P0380	L-Proline (CAS number 147-85-3); powder; 99%; molecular weight = 115.13 g/mol
Propyl gallate	Sigma-Aldrich	P3130	Propyl gallate (CAS number 121-79-9); powder; ≥98%; molecular weight = 212.2 0g/mol; solubility in ethanol at 50 mg/ml
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Sodium pyruvate (CAS number 113-24-6), ≥99%; molecular weight = 110.04 g/mol; solubility in water at 100 mg/mL
Rectified shafts			8 x 300 mm, any brand
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Rotetone (CAS number 83-79-4); ≥95%, molecular weight 394.42 g/mol
Rubber bands			Can be replaced with pieces of a string
Screwdriver			To assemble some of the 3D-printed apparatuses
Screews			M3 x 8 mm
SD Card			At least 32Mb in size; usually provided with 3D printers
Software Repetier Host	Hot-World GmbH & Co. KG	https://www.repetier.com/	Excellent slicing software, available free of cost
Software Tinkercad	Autodesk	https://www.tinkercad.com	3D model design software, available free of cost
Stereomicroscope	Leica	M-80	Stereomicroscope, zoom 7.5-60X + Leica cls 150 led light source
Sucrose	Merck	107,651,000	Sucrose for microbiology use (CAS number 57-50-1);
Tris	Amersham Biosciences	17-1321-01	Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (CAS number 77-86-1); 99,8-100.1%; molecular weight 121.14 g/mol
Tweezer/forceps	Stark	ST08710	Histological tweezer, straight, round tip, 12 cm, AISI-410 stainless steel
w1118 fly line	Howy Jacobs´s lab, Tampere University		Drosophila line used as genetic background control for 3XtubAOX
Wood plate			240 x 60 x 20 mm
Zip tights			2 x 210 mm, any brand