티 임플란트의 혈소판 유래 세포 외 소포 기능화

요약

여기서, 우리는 혈소판 용해 (PL)에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 티타늄(Ti) 임플란트 표면코팅에 대한 이들의 사용에 대한 방법을 제시한다. 우리는 낙하 주조 코팅 방법, 표면에서 의 EV 방출 프로파일, 그리고 티 표면 코팅 된 전기 EV의 생체 내 생체 적합성을 설명합니다.

초록

세포 외 소포 (EV)는 세포 통신에서 중요한 역할을 하는 생물학적 나노 채소입니다. 그들의 함량은 재생 의학에 있는 중대한 잠재력을 제시하는 단백질 과 핵산과 같은 적극적인 생체 분자를 포함합니다. 최근에는 혈소판 리사테(PL)에서 추출한 전기자동차가 PL에 필적하는 골성 능력을 보여주었다. 게다가, 생체 재료는 정형 외과 또는 치과 복원에 자주 사용됩니다. 여기서는 골성 특성을 향상시키기 위해 PL 유래 EV로 Ti 표면을 기능화하는 방법을 제공합니다.

EV는 크기 제외 크로마토그래피에 의해 PL에서 분리되며, 그 후 Ti 표면은 드롭 캐스팅에 의해 PL-EV로 기능화됩니다. 기능화는 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출 분석서에 의해 EV 방출 및 생체 적합성에 의해 입증된다.

서문

전기자동차는 모든 세포에 의해 분비되는 멤브레인 소포(30-200 nm)이며 화물을 전달함으로써 세포 간 통신에서 중요한 역할을 한다. 그(것)들은 핵산, 성장 인자, 또는 생리활성 지질¹을 포함할 수 있는 액티브한 생체 분자의 각종을 포함합니다. 이러한 이유로, EV치료에서 그들의 잠재적인 사용에 대 한 평가 되었습니다. 정형 외과 및 뼈 재생의 관점에서, 다른 소스에서 전기 테스트 되었습니다. 그 중에서도 혈소판 유래 전기는 낮은 세포^{독성 프로파일2,3}을 유지하면서 줄기 세포에 대한 분화 효과를 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, 매일 임상 실습에서 이를 사용하기 위해서는 전기자동차와 생체재료의 결합 가능성을 탐구하기 위한 추가 연구가 필요하다.

티타늄 기반 생체 재료는 기계적 특성, 높은 생체 적합성 및 장기 내구성으로 인해 뼈 치유 임상 개입을위한 발판으로 널리 사용됩니다⁴. 그럼에도 불구하고, Ti 임플란트는 생물활성 물질이므로 주변 ^{뼈 조직5}와 결합할 수 있는 능력이 좋지 않습니다. 이러한 이유로, 티타늄 수정은 표면에 보다 기능적인 마이크로 환경을 달성하여 성능을 향상시키기 위해 연구되고있다^4,6,7. 이러한 의미에서, 전기자동차^{는 화학8} 또는 물리적 상호작용에 의해 티타늄에 고정될 수 있다^9,10. 줄기 세포 또는 대식세포로부터 유래된 고정된 전기는 세포 접착 및 증식을 촉진하여 Ti의 생체 활성을 향상시켜 골성 효과를 유도합니다^8,9,10.

이 문서는 PL 유래 EV로 Ti 표면을 코팅하기위한 드롭 캐스팅 전략에 중점을 둡니다. 또한, 우리는 시간이 지남에 따라 코팅 된 표면에서 EV 방출 프로파일을 평가하고 체외에서 세포 생체 적합성을 확인합니다.

프로토콜

혈소판 리사테(PL)는 IdISBa Biobank가 제공하는 신선한 버피 코트를 사용하여 기관 가이드라인³ 에 따라 이전에 설명된 바와 같이 얻어진다. 현재 프로젝트에 대한 그들의 사용은 윤리위원회 (IB 1995/12 BIO)에 의해 승인되었습니다.

1. PL에서 격리된 EV

1. 더 큰 바디 제거
   1. 실온에서 PL을 해동하십시오.
   2. 원심분리기 PL에서 1,500 x g 에서 4°C에서 15분 동안. 이 셀 파편이 포함된 펠릿을 폐기하십시오.
   3. 상체를 수집하고 4 °C에서 30 분 동안 10,000 x g 에서 2 개의 연속 원심 분리를 수행합니다.
      참고: 펠릿은 마이크로베실과 같은 더 큰 전기에 해당하며,이 경우 폐기됩니다.
   4. 상체를 먼저 0.8 μm 다공성 멤브레인을 통과한 다음 0.2 μm 다공성 멤브레인을 통해 필터링합니다.
      참고: 이러한 단계는 원하지 않는 모든 EV를 제거합니다.
   5. 필터링된 PL을 풀로 풀과 사용 전까지 -20°C에 보관하십시오.
2. 크기 제외 크로마토그래피
   1. 여과된 PBS와 원하는 유량으로 크로마토그래피 장비에 결합된 컬럼을 상형화합니다.
      참고: 사용되는 유량은 열 특성에 따라 다릅니다. 이 경우 0.5 mL/분으로 설정됩니다.
   2. 처리된 PL(5mL)을 주사기로 장비에 적재합니다.
   3. PL을 컬럼에 주입하고 15mL 튜브에서 5mL 분획을 수집하기 시작합니다.
   4. EV농축 분획을 수집하고 사용할 때까지 -80°C에 보관하십시오.
      참고: 처음으로 실험을 수행할 때, 단백질 정량화 및 면역 검출에 의해 모든 분획을 특성화하여 EVs3,11로 농축된 것을 결정합니다. 이 실험에서 9^번째 분획이 수집됩니다.
   5. 크로마토그래피 컬럼을 0.2% NaOH 용액의 30mL로 세척하고 평형에 도달하면 20% 에탄올 용액에 보관하십시오.

그림 1: 혈소판 리세이트(PL) 세포외 소포(EV) 절연의 회로도도. PL은 먼저 1,500 x g에서 원심 분리된 다음 10,000 x g 에서 더 큰 바디를 제거합니다. 상체는 0.8 및 0.2 μm 필터를 통해 필터링됩니다. 처리된 PL은 컬럼에 로드되고, EV는 크기 배제 크로마토그래피로 구분된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. EV 특성화

참고: 기능학을 수행하기 위해서는 전기자동차 특성화가 필요합니다¹². 전자 현미경 검사법 또는 서부 얼룩 특성화는 이전에보고되었다¹³. 이 보고서는 Ti 표면 기능화를 위한 필수 특성화 기술에 중점을 둡니다.

1. 나노 입자 추적 분석 (NTA)
   1. 0.2 μm 여과 된 PBS에서 전기 자동차 (1:1000)를 희석시하십시오.
      참고: 너무 농축된 시료 또는 너무 희석된 시료는 NTA 측정을 위해 범위를 벗어나고 조정이 필요합니다.
   2. 희석된 전기자동차의 1mL을 주사기로 NTA 장비에 적재하고 NTA 장비에 주입한다.
   3. 입자 농도 및 크기 분포 측정을 위해 제조업체의 프로토콜을 따릅니다.
2. 단백질 농도
   1. 1μL의 EV 용액을 사용하여 농도를 결정합니다. 280 nm의 파장에서 분광계로 흡광도를 측정합니다.
      참고: 전기 는 입자의 수에 비해 단백질의 낮은 수준을 제시한다.
   2. 제조 업체의 지시에 따라 분광계를 사용하여 흡광도 판독을 얻을 수 있습니다.

3. 티타늄 표면 기능화

참고:이 방법에서는 가공티타늄 디스크, c.p. 등급 IV, 직경 6.2mm 및 높이 2mm가 사용됩니다. 디스크는 Ti 핀셋으로 조작될 수 있지만 표면을 긁지 않는 것이 중요합니다. 또한, 가공된 쪽은 전체 프로세스 중에 위쪽으로 직면해야 합니다.

1. 티 디스크 세척
   참고 : Ti 세척에 사용되는 솔루션의 양은 Ti 디스크를 커버하기에 충분해야합니다. 티 디스크를 유리 비커에 넣고 솔루션을 붓습니다. 그런 다음 해독하여 용액을 제거합니다.
   1. 티 임플란트를 탈온화(DI) 물로 씻은 다음 물을 버립니다.
   2. 에탄올70%로 Ti 임플란트를 세척한 다음 용액을 제거합니다.
   3. 임플란트를 DI 물에 놓고 50°C에서 5분 동안 초음파 처리합니다. 물을 버리십시오.
   4. 교반으로 10 분 동안 50 °C에서 40 % NaOH 용액으로 Ti 임플란트를 인큐베이션합니다. 솔루션을 폐기합니다.
      주의: NaOH 솔루션은 준비 중에 따뜻해합니다. 용액은 부식성이며 연기 후드 내부에 사용해야합니다.
   5. 50°C에서 50°C에서 임플란트를 초음파 처리한 다음 물을 제거합니다.
   6. 중립 pH에 도달할 때까지 DI 워터(최소 5개)로 여러 번 세서히를 수행합니다. pH 표시기와 pH를 확인합니다.
   7. 50°C에서 DI 수에서 임플란트를 5분 동안 초음파 처리하여 물을 제거합니다.
   8. 50°C에서 50° C의 50% _HNO3 용액에 Ti 임플란트를 10분 동안 교배하여 배양합니다. 솔루션을 제거합니다.
      주의: _HNO3 는 부식성 및 산화제 물질이며 연기 후드 내부에 사용해야 합니다.
   9. 50°C에서 50°C에서 DI 수에서 임플란트를 5분 동안 초음파 처리합니다. 물을 제거합니다.
   10. 중립 pH가 얻어질 때까지 DI 수(최소 5)로 여러 번 의 세하를 수행한다. pH 표시기로 pH를 확인합니다.
   11. 50°C에서 50°C에서 DI 수에서 임플란트를 5분 동안 초음파 처리합니다. 물을 제거합니다.
       참고: 이 시점에서 Ti 임플란트를 70% 에탄올 용액에 저장하여 실험을 중지할 수 있습니다.
2. 티 패시베이션
   참고: Ti 통과 단계는 아래에 나열된 순서대로 Ti 디스크를 다른 솔루션으로 완전히 덮음으로써 수행됩니다. 티 디스크는 유리 비커에 배치하고 솔루션은 부드럽게 그들에 부어된다. 모든 세척 단계에서 사용되는 볼륨은 임플란트를 완전히 커버해야하며 탈충을 통해 제거됩니다.
   1. Ti 임플란트를 30% _HNO3 솔루션으로 배양하여 부드러운 동요 하에서 실온에서 30분 동안 배양합니다. 솔루션을 제거합니다.
   2. 중립 pH에 도달할 때까지 DI 워터(최소 5개)로 여러 번 세서히를 수행합니다. pH 표시기로 pH를 확인합니다.
   3. 디 워터의 실온에서 하룻밤 동안 티 임플란트를 인큐베이션합니다.
   4. 진공 조건에서 임플란트를 40°C에서 10분 동안 건조시하십시오.
3. EV 드롭 캐스팅
   참고: 세포 기능 연구의 경우 세포 배양 캐비닛에서 작업하는 것이 중요합니다.
   1. Ti 임플란트를 96웰 플레이트에 놓고 가공된 면이 위를 향합니다.
      참고: 임플란트가 거꾸로 뒤집힌 경우 바늘을 사용하여 다시 설정할 수 있습니다.
   2. 전기자동차 용액을 해동하고 교반과 섞습니다. 소용돌이를 사용하여 3초 동안 펄스를 사용하십시오.
   3. 티 표면에 전기 를 입금합니다. 이 연구에서는 NTA가 결정한 농도에 따라 임플란트당 최대 4 x ¹⁰¹¹ EV를 고정하기 위해 40μL의 EV 용액을 Ti에 배치합니다.
   4. 낙하가 완전히 건조 할 때까지 진공 조건하에서 Ti가 함유 된 플레이트를 37 °C에서 놓습니다 (~2 h).
      참고: 진공 챔버에 존재하는 임플란트 수와 물에 따라 시간을 조정합니다.

그림 2: 드롭 캐스팅에 의한 Ti 패시베이션 및 EV 기능화의 회로도. Ti 임플란트는 실온에서 30% _HNO3 용액에서 30분 동안 인큐베이션으로 먼저 전달됩니다. DI 물로 여러 번 해시 한 후 pH는 중립에 도달합니다. 그런 다음, Ti 임플란트는 DI 물의 실온에서 하룻밤 동안 배양됩니다. 그 후, 임플란트는 40 °C에서 진공 조건하에서 건조된다. 전기자동차의 경우 40μL의 전기자동차 용액이 Ti 임플란트에 증착됩니다. 다음으로, 임플란트는 전기가 물리적으로 표면에 결합될 때까지 진공 상태에서 2시간 동안 배양됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. Ti 표면 특성화

1. 릴리스 스터디
   1. 37°C에서 여과된 PBS의 200 μL로 Ti 표면을 배양합니다.
      참고: PBS는 NTA 측정과의 간섭을 피하기 위해 필터링됩니다.
   2. PBS를 다른 시점에서 교체하고 -80 °C에 저장합니다.
      참고: 이 연구에서는 2일, 6일, 10일, 14일 의 시간 점을 분석했습니다.
   3. 제조업체의 지침에 따라 NTA에 의해 입자 연구를 위해 저장된 PBS를 분석합니다.
      참고: PBS의 입자 농도는 시간이 지남에 따라 EV 릴리스 프로파일을 나타냅니다.
2. 생체 적합성 연구
   참고: 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(hUC-MSC)는 기관 가이드라인에 따라 IdISBa 바이오뱅크로부터 수득된다.
   1. 사용 전까지 20%의 FBS로 보충된 DMEM 저혈당에서 hUC-MSC를 유지하십시오. 일주일에 두 번 매체를 변경합니다.
   2. 세포 파종의 경우, PBS의 5mL로 플라스크에서 셀을 두 번 세척하십시오.
   3. 트립신 솔루션의 1 mL을 추가하여 hUC-MSC를 트립시니즈합니다. 세포의 단층이 완전히 커버되는지 확인합니다. 트립신 용액을 제거하고 세포 배양 플라스크를 37°C에서 약 2분 동안 배치합니다. 현미경의 밑에 세포 분리를 봅니다. 분리된 셀은 둥근 모양으로 나타나며 서스펜션에 있을 것입니다.
   4. 1% 전기 자동차고갈고갈기 FBS와 DMEM 낮은 포도당에서 세포를 다시 중단합니다.
      참고: 1% FBS로 보충된 미디어를 준비한 다음 18h에 120,000 x g 의 초원심분리기를 준비하여 FBS-EV를 제거합니다. 혈소판 EV와의 간섭을 피하기 위해 전기 를 제거하는 것이 중요합니다.
   5. Neubauer 챔버를 가진 세포의 수를 계산하여 세포 농도를 결정¹⁴.
   6. hUC-MSC를 50,000세포/mL 농도로 가져옵니다.
   7. 세포 용액의 200 μL을 Ti 임플란트에 시드합니다.
   8. 48h 후, 50 μL의 매체를 수집하고 제조업체의 프로토콜에 따라 젖산 탈수소효소(LDH) 활동 키트를 사용하여 세포독성 측정을 수행한다.

결과

이 문서에 제시된 방법을 사용하면 기능성 티타늄 디스크를 사용하여 EV를 얻을 수 있습니다. 전기 자동차는 물리적으로 표면에 결합되어 시간이 지남에 따라 지속적인 방출을 허용합니다. 방출되는 전기자동차의 양은 2일, 6, 10 및 14일에 NTA로 측정할 수 있다. 첫 번째 측정, 2 일에, 약 ¹⁰⁹ EV가 출시 되는 것을 보여, 6 일에 지속적인 출시 다음 (~¹⁰⁸ EV); 10일(~^107EV ), 14일차(~^...

토론

이 프로토콜은 TI 표면에 EV 기능화에 대한 명확한 지침을 제공하는 것을 목표로합니다. 제시된 방법은 기능화의 물리작용 형인 낙하 주조 전략을 기반으로 한다. Ti 표면에 대한 EV 기능화에 관한 불쌍한 참고 문헌이 존재하지만 ^Ti10에서 EV를 고정하여 다른 이점을 보여주는 연구는 거의 없습니다. 어쨌든, 탐구된 전략의 몇몇은 생화학적 결합⁸, 중합체 함정

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,8 µm syringe filter	Sartorius	16592K
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1mL syringe	BD	303174
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolut ethanol	Scharlau	ET0006005P	Used to prepare 20 %  ethanol with Milli-Q® water
AKTA purifier System	GE Healthcare	8149-30-0014
Allegra X-15R Centrifuge	Beckman Coutler	392934	SX4750A swinging rotor
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
Conical Tube, Conical Bottom, 50ml	SPL life sciences	PLC50050
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
Disposable Syringes 10 ml	Becton Dickinson	BDH307736
DMEM Low Glucose Glutamax	GIBCO	21885025
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified	GIBCO	16000044
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR	GE Healthcare	28-9356-04	Precast columns
human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC)	IdISBa Biobank
Nanodrop 2000 spectrophotometer	ThermoFisher	ND-2000
NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Needle	Terumo	946077135
Nitric acid 69,5%	Scharlau	AC16071000
Optima L-100 XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	8043-30-1124	SW-32Ti Rotor
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Biowest	L0022
pH Test strips 4.5-10.0	Sigma	P-4536
Platelet Lysate (PL)	IdISBa Biobank		Obtained from  buffy coats discarded after blood donation
Polypropylene centrifuge tubs	Beckman Coutler	326823
Power wave HT	BioTek	10340763
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print	Sarstedt	62554502
Sodium hidroxide	Sharlau	SO04251000
Titanium implants replicas	Implantmedia, SA	NA	Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm
Trypsin-EDTA 1 X	Biowest	L0930
Tryton X100	Sigma	T8787