인간 1차 피부 섬유아세포를 기반으로 한 헌팅턴 병 모델의 마이크로튜블러 플러스 엔드 다이내믹스 시각화

요약

이 프로토콜은 EB3 단백질 트랜스퍼션에 의한 마이크로튜블러 플러스 엔드 시각화에 전념하여 1차 세포 배양에서 그들의 역동적인 특성을 연구합니다. 이 프로토콜은 헌팅턴병 환자로부터 얻은 인간 1차 피부 섬유아세포에 구현되었다.

초록

시간 경과 비디오 현미경 검사법과 함께 관심의 형광 표지 마커 단백질과 함께 경질은 세포 골격의 동적 특성을 연구하는 고전적인 방법입니다. 이 프로토콜은 1 차적인 세포 경작 조건의 세부 사항 때문에 어려울 수 있는 인간 1 차섬유아 성 전염을 위한 기술을 제안합니다. 또한, 사이토스켈레톤 동적 특성 유지 보수는 미세투알 안정화를 일으키지 않고 좋은 신호 대 잡음 비율을 얻기 위해 낮은 수준의 트랜스페트가 필요합니다. 빛으로 인한 스트레스와 형광염 변색으로부터 세포를 보호하기 위한 조치를 취하는 것이 중요합니다. 우리의 일의 과정에서, 우리는 인간 적인 1 차적인 섬유아세포 연구 결과에 적합한 조건의 제일 조합을 선택하기 위하여 다른 transfection 방법 및 프로토콜 및 다른 벡터를 시험했습니다. ImageJ를 사용하여 결과 시간 경과 비디오와 계산된 마이크로튜뮬 역학을 분석했습니다. 다른 세포 부분에서 microtubules의 플러스 끝의 역학은 유사하지 않습니다, 그래서 우리는 하위 그룹으로 분석을 분할 - 중심 영역, 라멜라, 섬유 아세포의 꼬리. 특히, 이 프로토콜은 환자 샘플에서 세포 골격 역학의 체외 분석에 사용할 수 있으며, 다양한 질병 개발의 역학을 이해하는 다음 단계를 가능하게 합니다.

서문

헌팅턴병(헌팅턴병)은 돌연변이 유전자 인코딩헌팅틴 단백질(HTT)에 의한 난치성 신경퇴행성 병리학이다. HTT는 주로 소포 및 마이크로 투튜브와 관련이 있으며 아마도 마이크로 튜블러 의존 운송 프로세스^1,2에 관여할 수^{있습니다.} 미세 수염 역학에 돌연변이 HTT의 영향을 연구하기 위해, 우리는 결합하고 성장하는 플러스 엔드를 안정화하여 마이크로 투비의 동적 특성을 조절하는 EB3 단백질의 체외 시각화를 사용했습니다. 형광으로 표시된 EB3를 인간 피부 섬유아세포에 적재하기 위해 플라스미드 트랜스펙션이 적용되었습니다. 우리는 이 연구를 위해 헌턴타곤 환자의 피부 생검에서 얻은 1차 섬유아세포 배양을 사용했습니다.

HTT 단백질 유전자의 돌연변이는 폴리글루타민 관^3의신장으로 이어집니다. HTT는 내분비성^4,세포 수송^1,2,단백질 분해⁵등과 같은 세포 공정에 중요한 역할을 한다. 이러한 프로세스의 상당 부분은 마이크로 투튜플을 포함한 세포 세포 골격의 다양한 요소를 포함한다.

인간 1 차 세포는 가능한 한 밀접하게 환자 세포에서 발생하는 이벤트를 재현하는 가장 좋은 모델입니다. 이러한 모델을 만들려면 인간 생검 물질 (예 : 수술 샘플에서)에서 세포를 분리해야합니다. 결과 1 차 세포주 다양 한 유전, 생 화학, 분자 및 세포 생물학 방법을 사용 하 여 병 인 발생을 공부 하기 에 적합. 또한, 인간 1차 세포 배양은 다양한 환분화 및 형질전환^배양6을만들기 위한 선구자역할을 한다.

그러나, 불멸의 세포 배양과는 대조적으로, 1 차 세포의 중요한 단점은 그들의 제한된 통로 수용량입니다. 따라서 초기 통로 단계(최대 15개)에서 셀을 사용하는 것이 좋습니다. 오래된 문화권은 매우 빠르게 퇴화하여 고유한 특성을 잃게 됩니다. 따라서, 새로 얻은 1차 세포는 장기 저장을 위해 동결된 유지되어야 한다.

1 차적인 세포 배양은 재배 조건에 영향을 받기 쉽습니다. 따라서 종종 고유한 접근 방식과 증가하는 조건의 최적화가 필요합니다. 특히, 우리의 실험에 사용되는 인간의 피부 기본 섬유 아세포는 기판에 요구하고있다. 따라서 실험 유형에 따라 다양한 코팅(예: 젤라틴 또는 섬유네틴)을 사용했습니다.

세포 세포 골격은 세포 모양, 이동성 및 운동을 결정합니다. 세포 골격의 역학은 상호 및 미토시스 모두에서 많은 세포 내 과정에 매우 중요합니다. 특히, 튜룰린에서 중합된 사이토스켈레톤은 매우 역동적이고 극성 구조로, 모터 단백질 매개 방향 세포 내 수송을 가능하게 한다. 마이크로튜블의 끝은 일정한 재배열에 있으며, 조립 단계는 분해 단계와 번갈아 가며,이 동작을 "동적^{불안정성"7,8,9라고}합니다. 다양한 관련 단백질은 중합체 형성 또는 단백질 단량체 형성으로 이어지는 중합 반응의 평형을 이동시킵니다. 튜룰린 서브유닛의 첨가는 주로^{마이크로튜블(10)의}플러스 엔드에서 발생한다. 최종 결합 (EB) 단백질 가족은 EB1, EB2 및 EB3의 세 가지 구성원으로 구성됩니다. 그들은 플러스 엔드 추적 단백질 (+TIP)의 역할을하고 결합하고 성장하는 플러스 엔드^11을안정화하여 마이크로 튜버의 동적 특성을 조절합니다.

많은 연구는 형광 분자 표지 튜룰린 미세 주입 또는 시간 경과 이미징 및 비디오 분석을 사용하여 체외에서마이크로 투튜브를 시각화합니다. 이 방법은 세포, 특히 1 차적인 인간 세포에 침략적이고 유해할 지도 모릅니다. 가장 어려운 단계는 세포 형질 전환에 대한 조건을 찾는 것입니다. 우리는 생존력과 네이티브 세포 형태에 영향을 미치지 않고 가능한 한 높은 수준의 트랜스페션에 도달하려고 노력했습니다. 이 연구는 헌팅턴병을 앓고 있는 건강한 기증자와 환자의 피부 섬유아세포에 있는 microtubule 역학에 있는 다름을 연구하기 위하여 고전적인 방법을 적용합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 2015년 9월 08일자 연방 의학 생물학 기관의 물리적 화학 의학 의연방 연구 및 임상 센터의 지침을 따릅니다.

참고: 그림 1은 프로토콜에 대한 개요를 제공합니다.

1. 인간의 피부 섬유아세포의 1차 배양 (그림2)

1. 덜벡코의 수정된 이글 미디어(DMEM) 배지에서 몇 시간 이내에 생검을 50μg/mL의 페니실린과 50U/mL의 연쇄절제술로 보충합니다.
   참고: 환자가 정보에 입각한 동의서에 서명한 후 의사가 멸균 조건하에서 피부 생검을 수행해야 합니다.
2. 생검 조직을 소량의 배지와 함께 6cm 페트리 접시에 놓습니다.
3. 멸균 메스를 사용하여 생검 샘플을 약 0.5-1mm 크기로 자른다. 1-2개의 얻은 조각을 3.5cm 페트리 접시에 넣고 생검 조각 위에 멸균 커버슬립을 놓습니다. DMEM, 50 U/mL 페니실린-연쇄절제술, 10% 태아 소 혈청(FBS)을 다음과 같은 조성물에 성장 배지의 1.5mL을 천천히 추가합니다.
4. CO₂ 인큐베이터 내부의 성장 배지내의 배양 섬유아세포는 5% CO_2,37°C, 습도 80%로 유지하였다.
   참고: 4-7일 후에, 첫번째 각질 세포, 그 후에 섬유아세포는, 접시의 바닥으로 조직에서 이동하기 시작합니다.

2. 기본 문화의 저장, 동결 및 동결

1. 배양 접시에서 세포를 제거합니다(포인트 3.2-3.4 참조).
2. 셀 서스펜션을 15mL 원물 튜브및 원심분리기로 200 x g에서 5분 동안 전송한다. 그런 다음 상체를 버리고 냉각 된 FBS의 900 μL에서 셀 펠릿을 다시 중단하십시오.
3. 낙하하여 냉동 보존 튜브드롭으로 옮기고 디메틸 설프리산화물(DMSO)의 100μL를 추가한다.
4. 저온 냉동고에 저온 냉동고에 저온 냉동고를 -80°C로 놓습니다. 24시간 후, 장기간 보관을 위해 극저온을 액체 질소(−196°C)로 전송합니다.
5. 냉동 보존 된 세포를 해동하기 위해, 질소 저장에서 극저온을 제거하고, 1 분 이내에, 37 °C로 예열 된 수송 매체의 9 mL을 포함하는 15 mL 원색 튜브로 함량의 1 mL를 전송합니다.
6. 조심스럽게 다시 중단 한 다음 200 x g에서5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상체를 버리고, 성장 배지의 필요한 부피에서 세포 펠릿을 재연하고 필요한 직경의 페트리 접시에 놓습니다.

3. 세포 재배

1. 증류수로 제조된 오토클레이브 0.1% 젤라틴 용액으로 접시 바닥을 덮습니다. 15분 동안 배양합니다.
   참고: 투명 변환 시각화의 경우 유리 바닥 플레이트 접시(유리 두께 170 μm의 공초점 요리)를 사용해야 합니다.
2. 다음과 같은 구성을 갖는 배양 매체를 준비하십시오: DMEM은 10% FBS, 2m L-alanyl-L-글루타민, 50 U/mL 페니실린-연쇄절제술로 보충한다. 철저히 섞어서 4°C에 보관하십시오. 세포에 추가하기 전에 중간을 37°C로 데우도록 데우습니다.
3. 현미경의 밑에 문화를 평가합니다. 매체를 제거하고 덜벡코의 인산염 용액(DPBS)으로 섬유아세포를 세척합니다.
4. 셀에 사전 따뜻하게 된 0.25 % 트립신 용액 1 mL을 추가하십시오. 그들은 완전히 기판에서 분리 하는 경우 현미경 아래 세포를 확인. 배양 배지의 1mL로 트립신을 비활성화합니다.
5. 세포 현탁액을 15mL 원문 튜브로 옮기다. 5 분 동안 200 x g에서 튜브를 원심 분리하고, 상류체를 제거하고, 배양 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 재연한다.
6. 셀 수를 계산합니다. 8-15 x 10^3/cm2의 밀도로 종자하는 데 필요한 셀 수를 계산하고 배양 배지의 2mL로 재중단한다.
7. 배양 접시에서 젤라틴 용액을 제거하고 즉시 세포 현탁액의 2mL를 추가합니다. CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 섬유아세포를 재배합니다.
8. 매 2-4 일 마다 매체를 새로 고칩니다.
   참고: 실험의 경우 4-11개의 구절의 세포를 사용합니다.

4. 트랜스페션

1. 배양 배지를 24시간 전에 신선한 배양 매체로 교체한다.
   참고: 세포 합류는 70-80%여야 합니다.
2. 세포 파종의 면적과 밀도에 기초하여 DNA 지질 복합체를 준비한다. 리포솜 기반 형질 전환제를 사용합니다.
   참고: 세포 파종 밀도를 1 x 10⁴ 셀/cm^2로사용합니다.
3. 튜브의 벽을 건드리지 않고 항생제를 포함하지 않는 최적의 최소 필수 매체(Opti-MEM)의 125 μL에 상업용 형질 시약 3 μL을 추가합니다. 부드럽게 다시 중단합니다.
4. 플라스미드 DNA(GFP-EB3)를 Opti-MEM의 125 μL에 플라스미드 DNA의 1 μg를 첨가하여 희석시. 부드럽게 다시 중단합니다.
   참고: GFP-EB3^11을 인코딩하는 발현 벡터는 A. 아크마노바 박사(에라스무스 대학, 로테르담)의 허가를 받아 I. Kaverina 박사(내슈빌 밴더빌트 대학)로부터 친절한 선물로 받았다.
5. 희석 된 송피션 시약의 각 튜브에 희석 된 플라스미드 DNA를 추가하십시오 (1:1). 30분 동안 배양합니다.
6. DNA 지질 복합체를 세포를 함유한 6cm 페트리 접시에 넣고 30s의 십자형 스윙과 섞는다. 24시간 동안 형질산제로 세포를 배양한 다음 신선한 배지로 변경합니다. 24시간 48시간 후 의 경질 효율을 분석한다.
   참고: 24시간 경질 후 효율은 10-15%, 48시간 40%까지 이었다.

5. 이미징 준비

1. 세포의 라이브 이미징 전에, 자가 형광을 줄이기 위해 pH 표시기 염료없이 배지로 배양 매체를 변경합니다.
2. 매체표면에 미네랄 오일을 조심스럽게 적용하여 매체를 완전히 덮어, 외부 환경으로부터 분리하여_O2 침투및 중간 증발을 줄입니다.
3. 수은 램프와 오일 침지 60배 또는 100x 목표 렌즈를 사용하여 숫자가 높은 조리개가 이미지를 찍습니다.
   참고: 생체 내 관찰의 경우, 현미경은 물체 테이블과 렌즈를 +37°C로 가열하는 것을 포함하여 세포에 필요한 조건을 유지하기 위해 인큐베이터를 장착해야 하며,_CO2 공급이 있는 폐쇄 챔버, 습도 수준 지원. 이중 증류수를 사용하여 습도를 만드세요. 촬영 전에 이중 증류수의 수준을 확인하십시오.
4. 이미징 전에 현미경 홀더에 세포와 함께 공초점 접시를 놓습니다. 접시와 카메라가 이미지를 촬영하는 동안 표류하지 않도록 홀더에 단단히 부착되어 있는지 확인합니다.

6. 이미징 매개 변수 설정

1. 빛이 세포 손상 반응성 산소 종 (ROS)을 유도하기 때문에 낮은 노출 값을 선택합니다.
   참고: 인간의 피부 섬유아세포에서 마이크로투블러의 역학을 연구하기 위해 300ms 노출이 선택되었습니다.
2. 관심 있는 대상에 집중합니다.
   참고: 장기 경과 이미징의 경우 자동 초점 안정화 시스템을 사용하여 z축을 따라 가능한 시프트를 보정합니다.
3. 세포의 감광성 및 형광화 퇴색 속도에 따라 최적의 이미징 조건을 선택합니다.
   참고: 마이크로튜브는 매우 역동적인 구조이므로 합리적으로 짧은 시간 간격을 선택할 수 있으며 프레임 속도가 충분히 높어야 합니다. 피부 섬유아세포의 미세수염 역학을 조사하기 위해, 우리는 3-5 분 동안 1 프레임 / s의 주파수에서 사용했습니다.
4. 이미지를 얻으려면 다음 개체를 선택할 때 이미 이미지된 영역에서 멀리 이동합니다. 이 지역은 빛의 영향을 받았기 때문에 눈에 띄는 사진 표백이있을 것입니다.
   참고: 이미징 빈도가 상대적으로 높았기 때문에 셔터가 이미지 간에 닫히지 않았고, 램프는 이미징 의 전체 기간 동안 조명을 비추었기 때문에 퇴색이 증가했습니다.
5. 현미경의 역학을 시각적으로 연구하기 위한 최적의 비디오를 선택하여, 현미경의 질, 마이크로투블러 이미지의 품질(최적의 신호 대 잡음 비율), 분석된 셀의 경우 표류의부재(그림 3)를고려한다.
6. 선택한 비디오를 사용하여 ImageJ 또는 Fiji프로그램(그림 4)에서추적하여 마이크로튜블의 플러스 엔드 역학을 연구합니다.
   참고: 정량 분석 지침은 보충 그림 2 및 보충 파일 1을참조하십시오.

결과

프로토콜(그림 1)을사용하여 생성된 결과 GFP-EB3 영화는 마이크로튜블의 동적 특성을 보여 줍니다. 마이크로투볼은 상이한 세포 과정에 관여하며, 이들의 역동적인 특성은 환자의 생검 물질로부터 1차 인간 세포 배양의 다양한 생명 특성에 영향을미친다(도 2).

다음 매개 변수는 미세 투부의 동적 불안정을 결정합니다: 성장속도(중?...

토론

마이크로튜블러의 역학 분석을 위한 더 나은 품질 결과는 고품질 현미경 심상에서 얻을 수 있습니다. 살아있는 세포의 시간 경과 화상 진찰을 위해 필요한 모든 조건을 관찰하고 화상 진찰 매개변수를 정확하게 조정하는 것이 중요합니다. 유리는 플라스틱보다 빛의 다른 굴절 인덱스를 가지고 있기 때문에 유리 바닥 (공초점 요리)와 특수 세포 배양 접시를 사용하는 것이 중요합니다. 이러한 매개...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Instrumentation
Camera iXon DU897 EMCCD	Andor Technology
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf Corporate
Fluorescence filter set HYQ FITC	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell Counte	Logos Biosystems	L40002
Microscope incubator for lifetime filming	Okolab	Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS
		Gas controller CO2-O2-UNIT-BL
Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)	Open source image processing software
NIS Elements	Nikon		Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Additional reagents
Mineral oil (Light white oil)	MP	151694
Cell culture dish
Cell Culture Dish	SPL Lifesciences	20035
Confocal Dish (glass thickness 170 µm)	SPL Lifesciences	211350	Alternative: MatTek
Conical Centrifuge tube	SPL Lifesciences	50015
Cryogenic Vials	Corning-Costar	430659
Microcentrifuge Tube	Nest	615001
Cultivation
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Dimethyl sulfoxide	PanEko	135
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)	PanEko	C420
DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution)	PanEko	P060
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	K053/SH30071.03
Gelatin (bovine skin)	PanEko	070
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050038
Opti-MEM (1x) + Glutamax	Gibco	519850026
Penicillin-streptomycin	PanEko	A063
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200072
Transfection
Plasmid DNA with EB3-GFP	Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam]	Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003