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요약

이 프로토콜은 식물 숙주를 사용하여 딱정벌레의 타액 단백질을 검출하고 딱정벌레 벡터에 의해 방출되는 식물 바이러스 단백질을 검출하는 방법을 보여줍니다.

초록

곤충 벡터는 농업적으로 중요한 많은 식물 바이러스를 수평으로 전염시킵니다. 식물 바이러스의 절반 이상이 입 부분을 뚫고 빠는 반구 곤충에 의해 전염됩니다. 바이러스 전파 동안 곤충 타액은 타액 벡터 바이러스와 곤충 단백질이 곤충에서 식물 숙주로 식물의 면역 반응을 유발하거나 억제하기 때문에 바이러스 벡터 숙주를 연결합니다. 타액 단백질의 식별 및 기능 분석은 아르보 바이러스-숙주 상호 작용 연구 분야에서 새로운 초점 영역이 되고 있습니다. 이 프로토콜은 식물 숙주를 사용하여 딱정벌레의 타액에서 단백질을 검출하는 시스템을 제공합니다. 벼난쟁이 바이러스(RDV)에 감염된 딱정벌레 벡터 Nephotettix cincticeps 가 그 예입니다. N. cincticeps 의 타액에 의해 매개된 RDV의 비텔로제닌과 주요 외부 캡시드 단백질 P8은 N. cincticeps 가 먹는 벼에서 동시에 검출될 수 있습니다. 이 방법은 곤충 먹이 후 식물 숙주에 일시적으로 남아 있는 타액 단백질을 테스트하는 데 적용할 수 있습니다. 이 검출 시스템은 헤미프테란-바이러스-식물 또는 헤미프테란-식물 상호작용 연구에 도움이 될 것으로 믿어집니다.

서문

근본적인 문제인 아르보 바이러스의 벡터 숙주 전파 방식은 생물학의 최전선에 있습니다. 농업적으로 중요한 많은 식물 바이러스는 곤충 매개체에 의해 수평으로 전염된다1. 식물 바이러스의 절반 이상이 진딧물, 흰파리, 딱정벌레, 식물벌레 및 총채벌레를 포함한 반구 곤충에 의해 매개됩니다. 이 곤충들은 식물 바이러스를 효율적으로 전염시킬 수 있는 뚜렷한 특징을 가지고 있다1. 그들은 구멍을 뚫고 빨아들이는 입 부분을 가지고 있으며 체관부와 목부에서 수액을 먹고 타액을 분비합니다 1,2,3,4. 기술의 개발과 개선으로 타액 성분의 식별 및 기능 분석은 집중 연구의 새로운 초점이 되고 있습니다. 타액에 있는 알려진 타액 단백질에는 펙티에스테라제, 셀룰라아제, 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타제, 폴리페놀 산화효소 및 수크라제와 같은 수많은 효소가 포함되며, 그 중에서도 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . 타액의 단백질은 또한 숙주 방어 반응을 유발하여 곤충의 성능을 변화시키는 유도인자와 숙주 방어를 억제하여 곤충 적합성을 향상시키는 이펙터 및 숙주 병리학적 반응을 유도하는 성분을 포함한다14,15,16,17. 따라서 타액 단백질은 곤충과 숙주 사이의 의사 소통에 필수적인 물질입니다. 바이러스가 전염되는 동안 피어싱을 빨아들이는 독성 곤충의 타액선에서 분비되는 타액에는 바이러스 단백질도 포함되어 있습니다. 바이러스 성분은 타액의 흐름을 이용하여 곤충에서 식물 숙주로 방출합니다. 따라서 곤충 타액은 바이러스-벡터-숙주 삼영양 상호작용을 연결합니다. 독성 곤충이 분비하는 타액 단백질의 생물학적 기능을 조사하면 바이러스-벡터-숙주의 관계를 이해하는 데 도움이 됩니다.

동물 바이러스의 경우 모기의 타액이 웨스트 나일 바이러스 (WNV)와 뎅기열 바이러스 (DENV)의 전염 및 병원성을 매개한다고보고되었습니다. 타액 단백질 AaSG34는 뎅기열-2 바이러스 복제 및 전파를 촉진하는 반면, 타액 단백질 AaVA-1은 자가포식을 활성화하여 DENV 및 지카 바이러스(ZIKV) 전파를 촉진합니다18,19. 모기의 타액 단백질 D7은 DENV 비리온 및 재조합 DENV 외피 단백질20과의 직접적인 상호작용을 통해 시험관 내 및 생체 내에서 DENV 감염을 억제할 수 있습니다. 식물 바이러스에서 베고모바이러스 토마토 노란 잎 컬 바이러스(TYLCV)는 식물 숙주의 WRKY33 매개 면역을 억제하는 흰파리 타액 단백질 Bsp9를 유도하여 흰파리의 선호도와 성능을 증가시켜 결국 바이러스21의 전파를 증가시킵니다. 곤충 타액 단백질이 식물 숙주에서 수행하는 역할에 대한 연구가 동물 숙주보다 뒤쳐져 있기 때문에 식물 숙주에서 타액 단백질을 검출하는 안정적이고 신뢰할 수 있는 시스템이 시급히 필요합니다.

벼 왜소 바이러스 (RDV)로 알려진 식물 바이러스는 딱정벌레 Nephotettix cincticeps (Hemiptera : Cicadellidae)에 의해 높은 효율과 지속적으로 번식하는 방식으로 전염됩니다22,23. RDV는 곤충 매개체에 의해 전염되는 것으로 처음 보고되었으며 아시아에서 벼의 심각한 질병을 유발합니다24,25. 비리 온은 icosahedral 및 이중층 구형이며, 외층은 P8 외부 캡시드 단백질22를 함유한다. N. cincticeps에서 RDV의 순환 전파 기간은 14 일 26,27,28,29,30입니다. RDV가 타액선에 도착하면 비리온은 엑소사이토시스와 유사한 메커니즘을 통해 타액선의 타액에 저장된 공동으로 방출됩니다(23). 비텔로제닌(Vg)은 암컷 곤충의 난모세포 발달에 필수적인 난황 단백질 전구체입니다31,32,33. 대부분의 곤충 종은 약 220 kDa의 전구체 단백질을 암호화하는 6-7 kb의 적어도 하나의 Vg 전사체를 가지고 있습니다. Vg의 단백질 전구체는 일반적으로 난소에 들어가기 전에 큰 (140 내지 190 kDa) 및 작은 (<50 kDa) 단편으로 절단될 수 있다18,19. 이전의 단백질체 분석에서는 딱정벌레 Recilia dorsalis의 분비된 타액에서 Vg에서 파생된 펩타이드의 존재가 밝혀졌지만 그 기능은 알려져 있지 않습니다(미공개 데이터). 식물 호퍼로부터 경구로 분비되는 Vg가 식물34의 방어를 손상시키는 이펙터로 기능한다는 것이 새로보고되었습니다. N. cincticeps의 Vg가 타액 흐름으로 식물 숙주에게 방출 될 수 있는지, 그리고 식물에서 식물 방어를 방해하는 역할을 할 수 있는지 여부는 알려져 있지 않습니다. N. cincticeps가 Vg와 같은 타액 단백질을 이용하여 식물 방어를 억제하거나 활성화하는지 여부를 확인하기 위해 첫 번째 단계는 먹이를 주는 동안 식물에 방출되는 단백질을 식별하는 것입니다. 식물에 존재하는 타액 단백질을 식별하는 방법을 이해하는 것은 타액 단백질의 기능과 Hemiptera와 식물 간의 상호 작용을 설명하는 데 잠재적으로 필수적입니다.

여기에 제시된 프로토콜에서, N. cincticeps 는 곤충 먹이를 통해 도입된 식물 숙주에서 타액 단백질의 존재를 조사하는 방법을 제공하기 위한 예로서 사용된다. 이 프로토콜은 주로 타액 단백질의 수집 및 검출에 대해 자세히 설명하며 대부분의 반구에 대한 추가 조사에 도움이 됩니다.

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프로토콜

독성이 없는 성체 딱정벌레는 중국 푸젠 농림대학교의 벡터 매개 바이러스 연구 센터에서 전파되었습니다.

1. 무독성 곤충 사육

  1. 40cm x 35cm x 20cm(길이 x 너비 x 높이)의 큐브 케이지에서 벼 묘목에 성충을 올려놓습니다. 케이지의 한쪽을 환기를 위해 방충망으로 덮으십시오.
    1. 딱정벌레가 있는 케이지를 26°C의 내장 습도 조절기가 있는 인큐베이터에 보관하고 상대 습도는 60-75%이고 16시간 밝기와 8시간 어둠의 광주기에서 유지합니다.
  2. 흡인기 사용하여 케이지에서 모든 성인을 매주 신선한 벼 묘목이 들어있는 새 케이지로 부드럽게 옮깁니다.
    1. 200명 이상의 성인이 짝짓기를 하고 밥에 알을 낳게 하십시오.
    2. 님프가 나올 수 있도록 오래된 벼 묘목을 보관하십시오. 이 새로운 비독성 님프를 2-instar 단계로 후진시키십시오.

2. 바이러스 획득 및 독성 곤충 수집

  1. 흡인기 장치를 사용하여 굶주림을 위해 1-2 시간 동안 2-instar nonviruliferous 님프를 유리 배양 튜브 (직경 2.5cm, 높이 15cm)로 조심스럽게 옮깁니다.
    1. 화분에서 자란 RDV에 감염된 벼가 들어있는 새장에 님프를 풀어줍니다.
    2. 님프가 감염된 벼를 2 일 동안 먹도록 허용하십시오.
      알림: 벼에 조심스럽게 물을 주고 님프를 씻어내지 마십시오. 2-instar 님프의 길이는 약 1.6-2mm입니다.
  2. 이 님프를 16 시간의 빛과 8 시간의 어둠의 광주기에서 상대 습도가 60-75 % 인 신선한 바이러스가없는 쌀 묘목이 들어있는 새로운 새장으로 조심스럽게 옮깁니다. 님프가 RDV의 순환 전염 기간을 완료하기 위해 감염된 벼를 12 일 동안 먹도록 허용하십시오.

3. 먹이 케이지를 이용한 타액 단백질 수집

  1. 한쪽 끝이 방충망으로 덮여있는 5 개의 작은 파이프 모양의 먹이 케이지 (직경 2.5cm, 높이 4cm)를 준비하십시오.
  2. 각 먹이 케이지에 15-20 마리의 딱정벌레를 가둔 다음 케이지의 다른 쪽 끝을 얇은 폼 매트로 덮습니다.
    1. 케이지 끝과 테이프로 폼 매트 사이에 하나의 쌀 묘목 (높이 5-6cm)을 고정하십시오. 먹이 케이지의 딱정벌레가 케이지 내부에 노출 된 벼 묘목을 먹을 수 있는지 확인하십시오.
  3. 벼가 살아 남을 수 있도록 묘목 뿌리를 물에 담그십시오. 딱정벌레가 2 일 동안 먹이를 먹도록하십시오.
  4. 딱정벌레를 먹이 새장에서 꺼내고 먹이를 먹인 벼 묘목을 모으십시오. 새장 밖에서 묘목의 일부를 자르고 묘목의 먹이 영역을 복구하십시오.
    알림: 이 샘플은 즉시 검출에 사용되지 않는 경우 최대 80개월 동안 -3°C에서 보관할 수 있습니다.

4. 시약 준비

  1. 멸균수 1L에 Tris-base 15.1g, 글리신 94g, SDS 5g을 녹여 5xTris-glycine buffer를 제조한다. 5xTris-glycine 완충액 200mL를 멸균수 800mL로 희석하여 1xTris-glycine 완충액을 제조합니다(완충액 조성은 표 1 참조).
  2. 멸균수 1L에 NaCl 80g, Tris-base 30g, KCl 2g을 녹여 10xTris-buffered saline(TBS) 완충액을 제조한다. 용액을 121°C에서 15분 동안 오토클레이브합니다.
  3. SDS 8g, ß-메르캅토에탄올 4mL, 브로모페놀 블루 0.02g, 글리세롤 40mL를 0.1M Tris-HCl(pH 6.8) 40mL에 녹여 4x 단백질 시료 완충액을 제조한다.
  4. 800 mL Tris-glycine buffer와 200 mL 메탄올을 섞어 Transfer buffer를 제조하였다.
  5. 100 mL 10xTBS 용액 및 3 mL 트윈 20 내지 900 mL 멸균수를 첨가하여 트윈 20 (TBST) 용액으로 TBS 완충액을 제조하였다.

5. 타액과 바이러스 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블로팅

  1. 조직이 분말이 될 때까지 액체 질소로 쌀 샘플 0.1g을 분쇄합니다. 200μL의 4x 단백질 샘플 버퍼를 샘플에 추가하고 10분 동안 끓입니다. 샘플을 12,000 x g 에서 실온에서 10분 동안 원심분리합니다.
    1. 상층액을 제거하고 새 바이알에 넣습니다. 10μL의 샘플을 SDS-PAGE 젤에 로드하고 150V의 Tris-glycine 버퍼에서 45-60분 동안 실행합니다.
      알림: 원심분리 후 잔류물은 버릴 수 있습니다.
  2. 0.45μm 니트로셀룰로오스 멤브레인 및 기타 샌드위치 공급품을 Transfer buffer에 30분 동안 넣습니다.
    알림: 이 단계는 젤 실행이 완료되기 전에 수행할 수 있습니다.
  3. 젤을 샌드위치하고 Transfer 버퍼에서 100V에서 90-120분 동안 옮깁니다.
  4. 멤브레인을 가져다가 TBST 용액의 7% 무지방 분유 차단 용액에 20분 동안 넣습니다. RDV P8 또는 Vg에 대한 특이 항체를 TBST의 7 % 무 지방 분유 용액에 첨가하십시오. 멤브레인을 염색하기 위해 항체와 함께 2시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다.
  5. 멤브레인을 TBST 용액으로 세 번 세척하고 매번 5분 동안 세척합니다.
  6. TBST를 가진 7% 비지방 분유에 2 차 항체로 염소 항-토끼 IgG를 추가하십시오. 실온에서 60-90분 동안 항체와 함께 배양합니다.
  7. 매번 5분 동안 TBST 용액으로 멤브레인을 세 번 세척합니다.
  8. 화학발광 분석법에는 ECL Western 키트를 사용합니다. 키트의 검출 시약 1과 2를 튜브에서 1:1의 비율로 혼합합니다. 혼합 시약을 멤브레인에 넣고 5분 동안 블롯을 배양합니다.
  9. 과잉 시약을 배출하고 화학발광 사진의 비색 사진을 찍습니다. 단백질 밴드가있는 사다리를보기 위해 그들을 결합하십시오.

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결과

그림 1은 곤충 사육, 바이러스 획득, 벼 먹이를 통한 타액 단백질 수집 및 웨스턴 블롯과 같은 이 프로토콜의 모든 단계를 보여줍니다. 웨스턴 블롯 결과는 Vg에 대한 항체와 함께 배양된 막에서 벼와 곤충의 침샘을 먹이는 샘플에서 약 220kDa의 특정 및 예상 밴드가 관찰되었음을 보여주었습니다. 대조적으로, 비사료 쌀 샘플에서는 밴드가 관찰되지 않았습니다.

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토론

꿰뚫는 곤충의 침샘에서 직접 분비되는 타액은 숙주 조직과 벡터의 왕국 간 생물학적 인자를 숙주로 미리 소화하고 해독하기 때문에 중추적인 역할을 합니다 1,3,4. 유도 인자, 이펙터 및 작은 RNA를 포함한 교차 왕국 생물학적 요인은 곤충-숙주 통신에 중요합니다14,15,16

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공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (31772124 및 31972239)과 복건 농업 임업 대학 (보조금 KSYLX014)의 보조금으로 지원되었습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Tris baseRocheD609K69032For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
glycineSigma-AldrichWXBD0677VFor 5×Tris-glycine buffer preparation
SDSSigma-AldrichSLCB4394For 5×Tris-glycine buffer preparation
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019318For 10×TBS buffer preparation
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016318For 10×TBS buffer preparation
ß-mercaptoethanolXiya ReagentB14492For 4× protein sample buffer preparation
bromophenol blueSigma-AldrichSHBL3668For 4× protein sample buffer preparation
glycerolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618For 4× protein sample buffer preparation
methanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10014118For transfer buffer preparation
Tween 20Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGYCT30111220For TBST preparation
non-fat dry milkBecton.Dickinso and company252038For membrane blocking, antibodies dilution
goat anti-rabbit IgGSangon BiotechD110058-0001Recognization of the primary andtibody
ECL Western kitThermoFisher Scientific32209Chemiluminescent substrate
nitrocellulose membranePall Corporation25312915For proteins transfer
Buffers and Solutions
BufferCompositionComments/Description
 5×Tris-glycine buffer15.1 g Tris base
94 g glycine
 5 g SDS in 1 L sterile water		 Stock solution
1×Tris-glycine buffer200 mL of 5×Tris-glycine buffer
800 mL sterile water		Work solution, for SDS-PAGE
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer80 g NaCl
30 g Tris base
2 g KCl
in 1 L sterile water		Stock solution
TBS with Tween 20 (TBST) solution100 mL 10×TBS solution
3 mL Tween 20
900 mL sterile water		Work solution
4× protein sample buffer8 g SDS
4 mL ß-mercaptoethanol
0.02 g bromophenol blue
40 mL glycerol
in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)		For protein extraction
Transfer buffer800 mL Tris-glycine buffer
200 mL methanol		For protein transfer
Instruments
Bromophenol blueSigma-AldrichSHBL3668For 4x protein sample buffer preparation
Constant temperature incubatorNingbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.PRX-1200BFor rearing leafhoppers
ElectrophoresisTanon Science & Technology Co.,Ltd.Tanon EP300For SDS-PAGE
Electrophoretic transfer core moduleBIO-RAD1703935For SDS-PAGE
glycerolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010618For 4x protein sample buffer preparation
glycineSigma-AldrichWXBD0677VFor 5x Tris-glycine buffer preparation
goat anti-rabbit IgGSangon BiotechD110058-0001Recognization of the primary andtibody
High-pass tissue grinding instrumentShanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.JXFSIPRP-24For grinding plant tissues
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016318For 10x TBS buffer preparation
methanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10014118For transfer buffer preparation
Mini wet heat transfer troughBIO-RAD1703930For SDS-PAGE
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019318For 10x TBS buffer preparation
nitrocellulose membranePall Corporation25312915For proteins transfer
non-fat dry milkBecton.Dickinso and company252038For membrane blocking, antibodies dilution
Pierce ECL Western kitThermoFisher Scientific32209Chemiluminescent substrate
Protein color instrumentGE Healthcare bio-sciences ABAmersham lmager 600For detecting proteins
SDSSigma-AldrichSLCB4394For 5x Tris-glycine buffer preparation
Tris baseRocheD609K69032For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
Tween 20Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGYCT30111220For TBST preparation
Vertical plate electrophoresis tankBIO-RAD1658001For SDS-PAGE
Water bathShanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.XMTD-8222For boil the protein samples
β-mercaptoethanolXiya ReagentB14492For 4x protein sample buffer preparation

참고문헌

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