해면체 내 압력 기록: 해면체 신경 손상 쥐 모델

요약

이 프로토콜은 발기 부전 및 해면체 내 압력 측정과 관련된 근치적 전립선 절제술의 안정적인 양측 해면체 신경 손상 쥐 모델을 개발하는 것을 설명합니다.

초록

양측 해면상 신경(CN) 손상 쥐 모델은 임상 치료 방법의 효과를 평가하기 위해 발기 부전(ED)과 관련된 임상 해면체 신경 손상을 시뮬레이션하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 그러나 발기부전 연구 분야에서 CN 손상 모델 구축 방법은 결함이 많고 다양합니다. 최근 몇 년 동안 가장 일반적으로 사용되는 방법인 CN 압착 부상입니다. 본 연구는 양측 CN 손상 랫드 모델 구축 절차에 대한 자세한 설명과 해면내 압력(ICP) 기록 측정에 대한 자세한 설명을 제공하여 신뢰할 수 있고 재현 가능한 CN 손상 랫드 모델을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 연구는 주사기 바늘을 하드 지지대로 사용하고 고무 슬리브가 있는 지혈제를 사용하는 지혈 크러시 손상의 CN 손상 방법을 성공적으로 개발했습니다. 또한, 이 방법은 1.0V의 전압, 20Hz의 주파수 및 5ms의 펄스 폭이 양측 CN 손상 랫드 모델에서 ICP 기록을 위해 최적화된 자극 파라미터라는 결론을 내립니다.

서문

발기부전은 성인 남성에게 흔한 질병 중 하나입니다. 전 세계 발기부전 환자 수는 2025년까지 3억 2,200만 명에 이를 것으로 추정됩니다¹. 중국의 한 다기관 광범위한 표본 조사에 따르면 골반 수술 또는 외상으로 인한 발기부전의 비율은 약 ^8%2입니다. 수술 기법과 수술 기구의 지속적인 개선에도 불구하고 발기부전 발병률은 여전히 높습니다. 신경을 보존하는 근치적 전립선 절제술(RP) 후 발기부전의 발병과 진행은 해면체 평활근의 위축, 내피 세포의 자멸사 및 병리학적 리모델링을 초래하는 해면체 신경 손상에 기여하는 것으로 간주되어 왔다 ^3,4.

발기부전과 관련된 CN 손상의 혈역학 및 조직병리학적 변화의 메커니즘을 연구하기 위해 설치류, 개, 고양이, 원숭이를 포함한 여러 유형의 CN 손상 동물 모델이 개발되고 평가되었습니다 ^5,6,7. 비용 및 재현성의 장점에 의존하여, 양측 CN 손상 랫드 모델은 근치적 골반 수술 후 발기부전을 평가하는 가장 일반적인 모델이 되었다⁸. 그러나 다양한 형태의 신경 손상이 수많은 문헌에 보고되었으며, 주요 차이점은 신경 손상 접근법(압착, 동결, 절제 및 절제)입니다^[9,10,11]. 또한, 신경 손상 접근법의 다양성으로 인해 쥐 모델에서 해면체 내압(ICP) 기록 매개변수의 불일치가 발생할 수 있으며, 이는 ICP⁸의 정확성과 평가를 결정합니다. 그럼에도 불구하고 신경 손상을 유발하고 모델의 ICP를 기록하는 표준화된 방법은 아직 없습니다.

따라서 본 연구는 보다 신뢰할 수 있고 재현 가능한 양측 CN 손상 쥐 모델을 구축하는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 모델 구축 및 ICP 측정 절차에 대한 자세한 설명을 제공하며, 이는 ED의 메커니즘을 연구하고 향후 효과적인 치료법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

이 연구에는 체중이 300-350g 사이인 15마리의 성인 수컷 Sprague-Dawley 쥐(3개월)가 사용되었습니다. 모든 동물 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 따라 Sun Yat-Sen University 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 다섯 번째 부속 병원의 승인을 받아 수행되었습니다. 동물들은 온도와 빛이 조절되는 편안한 시설에 수용되었습니다.

1. 수술 절차 재료 준비

1. 메스, 조직 가위, 실 가위, 굽힘 집게, 조직 집게, 미세 수술 집게, Hartman 모기 지혈 집게, 멸균 수술 시트, 마이크로 니들 홀더, 쥐 복부 견인기, 생체 신호 수집 및 처리 시스템( 재료 표 참조)을 준비합니다.
   1. 수술 전에 모든 수술 기구를 소독하십시오. 알코올(70% 에탄올) 물티슈를 사용하여 수술 부위를 청소합니다.
      참고: 수술 기구는 밤새 알코올 침지로 소독해야 합니다.
2. 압력 기록 시스템 준비
   1. 헤파린 식염수와 피하 주사 25G 바늘이 들어 있는 10mL 주사기를 튜브(20cm 길이)가 있는 3방향 마개에 연결합니다. 멸균된 튜브를 멸균 헤파린 식염수(200U/mL)로 세척합니다.
      알림: 튜브에 헤파린 식염수를 채우면 시스템에 기포가 유입되는 것을 방지할 수 있습니다.
3. 25G 바늘을 동물 수술대 위로 20cm(튜브 길이만) 들어 올립니다. 그런 다음 플러싱 또는 탭핑으로 압력 기록 시스템의 측정 정확도를 검사합니다.

2. 동물의 준비

1. 펜토바르비탈나트륨(60mg/kg) 복강내 주사로 쥐를 마취합니다( 재료 표 참조).
   참고: 충분한 마취 깊이를 확인하기 위해 뒷 발을 꼬집 어 쥐의 자발적 호흡 리듬과 반사 신경을 평가했습니다.
2. 각막 건조를 피하기 위해 양측 눈에 연고를 바르십시오.
3. 적절한 마취를 확인한 후 전기 면도기를 사용하여 복부, 목, 회음부의 하반신을 면도합니다. 쥐를 누운 자세로 가열 패드 (37 ° C)에 놓습니다. 수술 중 멸균 상태를 유지하기 위해 의료용 장갑을 착용하십시오.

3. CN 격리 및 부상 절차

1. 메스를 사용하여 복부 아래쪽 정중선 피부를 4cm 절개합니다. 방광과 전립선을 완전히 노출시키기 위해서는 조직 가위와 조직 겸자를 사용하여 피하 근막, 근육 조직, 복막을 적당한 길이로 절개합니다.
2. 쥐 복부 견인기를 사용하여 작동 필드 맵을 확대합니다. 흡수성 면봉을 사용하여 인대와 같은 인접 조직에서 전립선을 분리합니다.
   참고: 주요 골반 신경절(MPG)과 CN은 전립선의 배외측 부위 두 곳 중 한 곳에서 발견될 수 있습니다.
3. 각진 마이크로 가위를 사용하여 MPG 원위 CN 1-6mm 위에 있는 근막을 절개합니다. 그런 다음 미세 수술 겸자를 사용하여 CN 아래로 9-0 봉합사를 밀어 넣습니다.
4. MPG 원위 25mm의 CN 아래에 주사기 바늘(5G)을 놓습니다. 그런 다음 지혈제를 "지혈 팁-주사기 바늘-신경-지혈 팁" 샌드위치 구조에 비추어 놓습니다(그림 1 및 그림 2).
   알림: 주사기 바늘은 평평하게 연마해야 합니다.
5. 신경절에서 원위 5mm에 끝이 완전히 닫힌 지혈제를 1분 동안 적용한 다음 지혈제와 주사기 바늘을 빼냅니다(그림 2).
6. 9-0 봉합사를 통해 신경을 약간 들어 올리고 MPG에서 원위 2-4mm의 CN 주위에 양극 전극의 고리( 재료 표 참조)를 놓습니다(그림 3).
   참고: 두 쌍의 MPG와 CN이 동일한 방식으로 작동되었습니다.

4. 신체 cavernosum의 카테터 삽입과 ICP 측정을 위한 CN의 자극

1. 튜브를 멸균 헤파린 식염수(200 U/mL)로 세척한 후 해면체에 주입합니다.
2. 25G 바늘을 잡고 삽입 방향을 신체 해면체의 경로와 평행하게 유지합니다(그림 3).
   참고: tunica albuginea는 삽입을 용이하게 하기 위해 늘려야 합니다.
3. 25G 바늘을 6mm 크기의 해면체로 밀어 넣습니다(그림 3). 튜브를 세척하고 신체 해면체를 가볍게 눌러 변환기의 감도를 평가합니다(그림 4). 실수로 떨어지는 것을 방지하기 위해 접착 테이프로 작업대의 파이프를 고정하십시오.
4. CN 자극을 위해 다음 매개변수를 사용하십시오: 1.0 V의 전압, 20 Hz의 주파수, 5 ms의 펄스 폭. 다음 자극 사이에 1분간 자극을 가하고 5분간 휴식을 취합니다.
   알림: 측정을 시작할 때 3방향 스톱콕을 압력 변환기 채널로 돌립니다.

5. 수술 후 관리

1. 데워진 패드(37°C)에 쥐를 놓고 마취 회복을 위해 주의 깊게 모니터링합니다.
2. 수술 후 통증 조절을 위해 쥐가 완전히 회복되면 비스테로이드성 항염증제(예: Carprofen, 0.5mg/kg, 피하 주사)를 제공하십시오( 재료 표 참조).
3. 쥐를 무균 케이지로 옮기고 2일 동안 모니터링하여 절개 상처의 영양 상태, 정신 상태 및 감염을 평가합니다.

결과

수술 절차는 권장 자극 설정과 함께 이 프로토콜을 사용하여 일반적인 ICP 반응 곡선을 생성했습니다. ICP 반응 곡선은 신경을 자극할 때 즉시 상승하고 자극이 철회되면 떨어집니다(그림 5). 증가된 ICP 값의 평가에 영향을 미치는 ICP를 측정하기 전에 해면체 내 압력 라인을 검사하는 것이 필수적입니다(그림 4).

토론

발기부전은 골반 수술 또는 외상으로 인한 심각한 합병증입니다. 신경을 보존하는 수술을 받고 있지만, 근치적 전립선 절제술(RP)에서 발기부전 발병률은 약 14-90%입니다¹². 부상 CN의 문제가 있는 재생으로 인해 임상적 치료 효과는 만족스럽지 않습니다. 따라서 발기부전 치료를 모색하기 위한 안정적인 CN 손상 동물 모델이 필수적입니다. Quinlan 등은 RP 관...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 G needle	BD Bioscience	367391
Abdominal retractor	RWD Life Science	R22009-01
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Bending forceps	RWD Life Science	F12011-10
Biological signal acquisition and processing system	Techman Software	BL-420S
Bipolar electrode	Techman Software	AC0047
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
HARTMAN mosquito hemostatic forceps	RWD Life Science	F22002-10
Heparin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	2608411
Micro needle holder	RWD Life Science	F31047-12
Microsurgery forceps	RWD Life Science	F11001-11
Scalpel	RWD Life Science	S32003-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
Thread scissors	RWD Life Science	S15001-11
Tissue forceps	RWD Life Science	F13019-12
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14