초음파 유도 주사에 의한 췌장암 세포의 동종 이종이의 생성

요약

우리는 인간 췌장암 세포의 초음파 유도 주사와 초음파 영상에 의한 생체 내 종양 성장의 후속 모니터링에 의해 최소 침습 동종 췌장암 모델을 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

췌장암(PCa)은 전 세계적으로 가장 치명적인 암 유형 중 하나입니다. PCa 악성 종양의 원인은 주로 내재적 인 악성 행동과 치료 치료에 대한 높은 내성에 의존합니다. 실제로 많은 노력에도 불구하고 표준 화학 요법과 혁신적인 표적 요법은 전임상 평가에서 임상 환경으로 옮겨 졌을 때 실질적으로 실패했습니다. 이 시나리오에서, 새로 개발된 약물을 시험하기 위해서는 PCa의 생체 내 특성을 더 잘 모방한 전임상 마우스 모델의 개발이 절실히 필요하다. 본 프로토콜은 인간 췌장 종양 세포의 초음파 유도 주사에 의해 수득된 동소성 이종이식으로 대표되는 PCa의 마우스 모델을 생성하는 방법을 기술한다. 이러한 신뢰할 수 있고 최소 침습적 프로토콜을 사용하여 초음파(미국) 영상으로 모니터링할 수 있는 종양 덩어리의 생체 내 생착 및 발달에 대한 증거도 제공합니다. 여기에 설명 된 PCa 모델의 주목할만한 측면은 시간이 지남에 따라 종양 덩어리의 느린 발달이며, 이는 약리학 적 치료의 시작점을 정확하게 식별하고 치료 적 개입의 효과를보다 잘 모니터링 할 수 있습니다. 또한 여기에 설명 된 기술은 고통과 고통을 최소화하고 연구에서 동물의 복지를 직접적으로 향상시키기 때문에 3R 원칙을 구현 한 예입니다.

서문

PCa와 가장 흔한 형태인 췌장 유관 아데노암종(PDAC)은 ^1,2단계에^{관계없이 1년} 생존율이 20% 미만이고 5년 생존율이 8%인 암 관련 사망의 가장 흔한 원인 중 하나입니다. 이 질병은 거의 항상 치명적이며, 발병률이 감소하는 다른 암 유형과 달리 발병률은 향후 몇 년 동안 지속적으로 증가 할 것으로 예상됩니다³. 늦은 암 발견, 빠른 진행 경향 및 특정 요법의 부족과 같은 요인은 PCa⁴의 나쁜 예후를 초래합니다. 보다 정확한 전임상 마우스 모델의 개발 덕분에 암 연구에서 큰 발전을 이루었습니다. 이 모델은 암의 기저에 있는 분자 메커니즘의 이해와^{새로운 치료법 개발에} 적절한 통찰력을 제공했습니다5. 이러한 발전은 최근의 큰 노력에도 불구하고 현재의 화학 요법¹에 내성을 유지하는 PCa에 제대로 적용되지 않습니다. 이러한 이유로 환자의 전망을 개선하기 위한 새로운 접근 방식의 개발이 필수적입니다.

수년에 걸쳐 오늘날 가장 널리 사용되는 모델 인 이종 이식편을 포함하여 많은 PCa 마우스 모델이 개발되었습니다⁵. 이종 이식 모델은 이식 된 종양 세포의 위치에 따라 피하 이종 및 동교로 분류됩니다. 피하 이종 이종 이식편은 달성하기가 더 쉽고 저렴하지만 PCa의 특정 특징 (즉, 섬유 성 조직의 축적, 저산소증, 산도 및 혈관 신생을 특징으로하는 특이한 종양 미세 환경)을 놓치고 있습니다 ^6,7. 이것은 피하 이종 이식편이 종종 치료 적 치료를위한 강력한 데이터를 제공하지 못하여 임상 환경으로 번역 될 때 실패로 이어지는 이유를 설명합니다⁸. 반면에, 동종 이종 이식편은 종양 미세 환경과 더 유사하여 질병의 자연적 발달을 더 잘 모방합니다. 또한, 동종 이종 이식편은 전이 과정 및 피하 모델에서 거의 발생하지 않는 PCa의 침습적 특징을 연구하는 데 더 적합합니다⁹. 전반적으로, 동종 이종이식 마우스 모델은 오늘날 전임상 약물 시험 ^9,10을 수행하는 것이 바람직하다. 동종 이종 이식편은 일반적으로 세포 또는 매우 작은 종양 조직 조각을 췌장에 이식하기 위해 수술 절차에 의존합니다. 실제로, PCa의 수술 모델에 기초한 여러 논문이 지난 수십 년 동안 발표되었다¹¹. 그러나 동종 종양 모델을 수립하기위한 수술 절차의 품질과 결과는 작업자의 기술적 기술에 크게 좌우됩니다. 번역 임상 접근법을위한 성공적인 동종 포토픽 PCa 이종 이식을위한 또 다른 핵심 포인트는 예측 가능한 성장 동역학으로 국소 질환을 확립 할 수있는 가능성입니다.

이러한 문제를 해결하기 위해 여기에서는 면역 결핍 마우스의 췌장 꼬리에 인간 PCa 세포를 초음파(미국) 유도 주사하여 동종 PCa 이종 이식편을 생산하는 혁신적인 절차를 설명합니다. 이 절차에서는 신뢰할 수 있는 PCa 마우스 모델을 생성합니다. 종양 성장은 미국 영상 에 의해 생체 내에서 이어집니다.

프로토콜

현재 프로토콜은 승인 번호 843/2020-PR로 이탈리아 보건부의 승인을 받았습니다. 무균 상태를 보장하기 위해, 동물들은 플로렌스 대학의 연구 동물 사육장(Ce.S.A.L.)의 장벽실 내에서 유지되었다. 모든 절차는 마우스가 플로렌스 대학 (이탈리아)의 LIGeMA 시설에 수용된 동일한 공간에서 수행되었다.

1. 세포 준비

1. 2% L-글루타민과 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)가 포함된 100mm 페트리 접시에서 PCa 세포주의 PCa 세포를 배양합니다.
2. 세포를 5%_CO2로 37°C에서 노르옥시아에서 인큐베이션한다.
3. 트립신으로 세포를 분리하십시오. 계수하고, 접종 1시간 전에 20 μL의 PBS 중 1 x 10⁶ 세포를 재현탁시켰다.

2. 초음파 유도 주사 (US-GI)를위한 마우스 준비

참고: 다음 단계는 멸균 조건에서 수행되었습니다. 마취 시작부터 마우스 플랫폼에서 마우스를 제거 할 때까지 미국 유도 주사의 전체 절차는 완전한 마우스 회복을 위해 약 10-12 분에 5 분이 걸립니다.

1. 개입 직전에 카르프로펜(NSAID)을 최종 용량 5mg/kg으로 피하(sc) 투여하거나 트라마돌을 27G 바늘이 있는 투베르쿨린 주사기를 사용하여 최종 용량 5mg/kg으로 투여합니다.
   참고: 본 프로토콜을 위해, 20마리의 무흉선 누드-Foxn^1nu 암컷 마우스를 사용하였다. 마우스는 8 주령이었고 무게는 20-22g이었습니다.
2. 이미저를 켜고 변환기 패널의 응용 프로그램 메뉴에서 마우스(소형) 복부 를 선택합니다. B-모드(밝기 모드) 이미징 창이 나타나고 시스템이 B-모드 데이터를 수집할 준비가 되었는지 확인합니다.
   주: B 모드는 시스템의 기본 이미징 모드입니다. 시스템은 에코 신호 진폭을 기반으로 밝기 수준을 할당하여 2차원(2D) 보기로 에코를 표시합니다. B-모드는 해부학적 구조를 찾는 데 가장 효과적인 모드입니다.
   1. 스터디 브라우저로 이동합니다.
   2. 새 스터디를 선택하고 스터디 이름과 정보(예: 스터디 날짜 등)를 입력합니다.
   3. 시리즈 이름에 필요한 모든 정보(예: 동물 균주, ID, 생년월일 등)를 입력합니다.
   4. 완료를 누릅니다. 이 프로그램은 B 모드 이미징을 위한 준비가 되었습니다.
3. 2 L/min의 O₂ 가스 유동을 갖는 4% 이소플루란을 사용하여 마취 유도 챔버에서 마우스를 마취시킨다.
   알림: 적절한 마취에는 약 4분이면 충분합니다(분당 약 50-60회 호흡).
4. 마우스가 마취되면 마취기의 연결을 변경하여 이소플루란이 마우스 취급 테이블 쪽으로 향하도록 합니다.
5. 마취된 마우스를 오른쪽 옆구리에 놓고 코뿔에 주둥이를 대고 취급 테이블(37°C에서 가열)에 올려 마우스가 0.8L/min의 O₂ 가스 흐름을 갖는 2% 이소플루란을 사용하여 마취되도록 합니다(그림 1A).
6. 마취 중 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 인공 눈물 한 방울을 바르십시오.
7. 오른손, 오른발, 꼬리를 접착 거즈로 동물 플랫폼의 전극 패드에 단단히 테이프로 붙입니다.
   참고: 마우스의 호흡수와 심전도(ECG)는 전극 패드를 통해 기록됩니다.

3. US-GI 방법에 의한 췌장에 PANC1 세포 주입

1. 70 % 에탄올로 마우스 피부를 살균하고 접착 거즈를 사용하여 왼쪽 옆구리의 피부를 펴십시오.
   알림: 피부를 늘린 상태로 유지하는 것은 바늘 삽입에 대한 저항을 줄이고 바늘 변형을 방지하는 데 중요합니다.
2. 20mL 주사기 (바늘없이)를 사용하여 마우스의 복부와 왼쪽 옆구리에 초음파 젤을 바르십시오.
3. US 변환기의 높이 조절 손잡이를 사용하여 변환기를 내려 마우스의 왼쪽 측면을 터치하고 동물의 몸에 가로로 놓습니다.
4. 변환기를 움직여 B-Mode 이미징을 사용하여 변환기 디스플레이의 췌장을 시각화합니다(그림 1B).
5. 30mm 28G 바늘을 사용하여 20μL의 PBS에 현탁된 1 x 10⁶ 개의 PANC1 세포를 포함하는 50μL Hamilton 주사기를 준비하고 적절한 홀더에 주사기를 놓습니다(그림 1C).
   알림: 사용하기 전에 주사기 바늘을 70 % 에탄올로 5-10 분 동안 소독하십시오.
6. 홀더 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘 경사가 위를 향하고 초음파 변환기와 동일한 평면에 있는 상태에서 주사기를 마우스 피부로 내리고 변환기와 45° 각도를 형성합니다(그림 1D).
   참고: 이 단계부터 디스플레이에서 미국 이미지를 모니터링하여 진행합니다.
7. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피부에 구멍을 뚫고 주사기 바늘을 췌장에 삽입하고 디스플레이에서 미국 이미지를 관찰하여 궤적을 따릅니다(그림 1E).
   알림: 주사하기 전에 췌장의 꼬리를 비장 뒤에 있고 왼쪽 신장에 가까운 기준으로 삼으십시오.
8. 바늘이 췌장에 삽입되면 주사기 플런저에 일정한 압력을 가하여 세포가 포함된 20μL 볼루스를 췌장에 직접 주입합니다(그림 1F).
   알림: 올바른 주사 절차는 췌장에 작은 거품이 있고 바늘 끝에서 거의 보이지 않는 저 에코 생성 유체의 흐름에 의해 확인됩니다.
9. 전체 볼 루스를 주입 한 후 바늘을 5-10 초 동안 그대로 둔 다음 천천히 수축시킵니다.
10. US 변환기를 제거하고 측면에서 젤을 청소한 다음 마우스를 새 케이지에 넣습니다. 동물이 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 관찰하십시오.

4.3D 마우스의 췌장 종양 모니터링을 위한 미국 영상

참고: 종양 발달 평가는 미국 유도 주사에 사용된 것과 동일한 도구를 사용하여 세포 주입 후 8일부터 수행되었습니다( 재료 표에 나열됨). 따라서 시스템 점화 (단계 2.2.), 마취 (단계 2.3-2.6) 및 동물 플랫폼상의 마우스 배치 (단계 2.7)와 같은 일부 절차는 프로토콜에서 위에서 설명한 것과 완전히 일치합니다.

1. 미국 이미징을 시작하기 전에 그림 2A와 같이 워크스테이션을 설정합니다.
2. 변환기를 3D 모터 시스템에 고정합니다(그림 2A).
3. 이미저를 켜고 스터디 브라우저에서 새 스터디를 선택합니다.
4. 마우스를 마취 유도 챔버 (4 % 이소 플루 란)에 놓습니다.
5. 마취된 마우스를 마취 튜브에 주둥이로 37°C에서 가열된 취급 테이블에 오른쪽 옆구리에 놓고 이소플루란을 2%로 줄입니다(그림 2B).
   참고: 동일한 해부학적 참조를 유지하기 위해 마우스를 미국 유도 주사와 동일한 위치에 배치하는 것이 중요합니다.
6. 마우스의 눈에 수의사 연고 한 방울을 바르십시오.
7. 마우스의 복부와 왼쪽 옆구리에 초음파 젤 층을 바르십시오.
8. 55MHz 변환기를 가로 방향으로 배치하여 췌장이 대략 중앙에 오도록 왼쪽 측면 피부를 터치합니다(그림 2C).
9. 3D 모터를 사용하여 횡 방향으로 전체 췌장의 이미지를 획득하고 획득 당 90-100 프레임을 수집하는 것이 이상적입니다 (프레임 수는 개인 선택에 따라 다를 수 있음).
   1. 이미저 터치패드에서 3D 모터 위치를 선택합니다.
   2. 양쪽 사지에서 전체 췌장의 이미지를 획득하기 위해 커서를 움직여 스캔 거리를 나타냅니다.
   3. 프레임 스캔을 선택하고 3D 획득을 시작합니다.
10. 3D 이미징이 완료되면 변환기를 제거하고 피부에서 젤을 닦은 다음 마우스를 새 케이지에 넣어 복구합니다. 동물이 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 관찰하십시오.

결과

상기 기재된 프로토콜에 따라, 마우스를 먼저 이소플루란 챔버에서 마취시키고, 동물 플랫폼 상에 놓았다(도 1A). 췌장은 초음파 영상으로 시각화되었습니다 (그림 1B). 50μL 해밀턴 주사기에 20μL의 PBS에 현탁된 1 x 10⁶ PANC1 세포를 로딩하고 바늘 홀더에 놓았습니다(그림 1C). 주사기와 미국 변환기 사이의 최적 각도는 45°였습...

토론

미국 영상화의 사용이 클리닉에서 널리 퍼져 있지만, 많은 전임상 마우스 모델에서의 종양 발달은 일반적으로 생체발광 영상화¹¹을 사용하여 기술된다. 후자는 종양 생착 및 확장을 평가하는 간접적인 방법이며 신뢰할 수 있는 종양 성장 동역학을 제공하지 않습니다. 본 연구에서는 세포 주입을 수행하고 종양 발달을 모니터링하기 위해 US 이미징을 적용했습니다. 우리가 설명한...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Sarstedt, Germany	P5856
3D-Mode package	Visualsonics Fujifilm, Italy		Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel	PARKER LABORATORIES, INC.	150	Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)	ENVIGO, Italy	69	20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line	Heraeus Instruments, Germany	BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature	Visualsonics Fujifilm, Italy	11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Euroclone Spa, Italy	ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)	Euroclone Spa, Italy	ECB4004L
Eppendorf (1.5mL)	Sarstedt, Germany	72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone Spa, Italy	ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge	Permax S.r.l., Italy	7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL	Permax S.r.l., Italy	7637-01
Isoflo (250 mL)	Ecuphar	7081219
L-glutamine 100X	Euroclone Spa, Italy	ECB3000D
Mouse Handling table II	Visualsonics Fujifilm, Italy	50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer	Visualsonics Fujifilm, Italy	51069	Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer	Angelo Franceschini S.r.l.	LFY-I-5A
PANC1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), USA	CRL-1469
Rimadyl (carprofen)	Pfizer	11319	20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Euroclone Spa, Italy	ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime	Alcon	509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-12055	complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-11983	Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20034	Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20054	Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure	Visualsonics Fujifilm, Italy	53157