고고학적 유적에서 고대 DNA를 검색하기 위한 최적화된 뼈 샘플링 프로토콜

요약

이 프로토콜은 중세 개인의 5가지 다른 골격 요소(방사성 탄소, 약 1040-1400 CE, 보정된 2-시그마 범위)에 걸쳐 8개의 권장 해부학적 샘플링 위치(주어진 골격 요소의 특정 위치)에서 뼈 분말을 수집하기 위한 일련의 모범 사례 프로토콜을 제시합니다.

초록

여기에 제시된 방법은 입력 샘플 자료를 제한하면서 고대 고고학 유적에서 인간 DNA를 회수 할 수있는 기회를 극대화하려고합니다. 이것은 골격을 가로지르는 DNA 회복의 비교 분석에서 가장 많은 양의 고대 DNA(aDNA)를 산출하는 것으로 이전에 결정된 해부학적 샘플링 위치를 대상으로 수행되었습니다. 이전 연구에 따르면 이러한 프로토콜은 고고학적 유적에서 고대 인간 및 병원체 DNA를 성공적으로 회수할 수 있는 기회를 극대화합니다. DNA 수율은 이전에 Parker et al. 2020은 독일 Peißen 근처의 버려진 중세 정착지인 Krakauer Berg의 묘지에서 회수된 중세(방사성 탄소(약 1040-1400 CE, 보정된 2시그마 범위) 묘지에서 회수된 11명의 개체에서 여러 골격 요소에 대한 aDNA 보존에 대한 광범위한 조사에서 평가되었습니다. 5 개의 골격 요소 (pars petrosa, 영구 어금니, 흉추, 원위 지골 및 거골)에 걸쳐있는이 8 개의 샘플링 지점은 모든 요소와 개인에 걸쳐 전체 평균보다 훨씬 높은 고품질 고대 인간 DNA를 성공적으로 산출했습니다. 수확량은 가장 일반적인 다운스트림 인구 유전자 분석에 사용하기에 적합했습니다. 우리의 결과는 고고학 유적에서 고대 인간 DNA를 분석하는 것과 관련된 대부분의 연구에서 이러한 해부학적 샘플링 위치를 우선적으로 사용하는 것을 뒷받침합니다. 이러한 방법을 구현하면 귀중한 고고학 표본의 파괴를 최소화하는 데 도움이됩니다.

서문

DNA 회수 및 분석을 목적으로 고대 인간 유해를 샘플링하는 것은 본질적으로 파괴적입니다 1,2,3,4. 샘플 자체는 귀중한 표본이며 가능한 한 형태 학적 보존을 보존해야합니다. 따라서 대체 할 수없는 재료의 불필요한 파괴를 피하고 성공 확률을 극대화하기 위해 샘플링 관행을 최적화해야합니다. 현재의 모범 사례 기술은 법의학 조사^5,6, 최적의 샘플링 개발이 연구7의 직접적인 목표가 아닌 고대 표본에 대한 연구 또는 인간이^{아닌 유해8}를 활용하거나 매우 작은 해부학적 샘플링 위치를 대상으로 하는^{전용 연구(}여기서는 뼈 가루가 나오는 골격 요소의 특정 영역을 나타내는 데 사용됨^, 다운스트림 DNA 분석에 사용하기 위해 생성됨)^9,10. 여기에 제시된 샘플링 프로토콜은 여러 개인의 여러 골격 요소에 걸친 DNA 보존에 대한 최초의 대규모 체계적인 연구에서 최적화되었습니다¹¹. 모든 샘플은 독일 작센안할트 페이센(Peißen) 근처의 버려진 중세 정착지 크라카우어 베르크(Krakauer Berg)의 교회 묘지에서 발굴된 11명의 개인으로부터 회수된 골격 요소에서 비롯되었으며(자세한 샘플 인구 통계는 표 1 참조) 따라서 이 지리적/시간적 범위를 벗어난 샘플과 함께 사용하기 위해 수정이 필요할 수 있습니다.

개인	성	사망 예정 연령	14 C 날짜 (CE, 칼 2 시그마)
크라001	남성	25-35	1058-1219
크라002	여성	20-22	1227-1283
크라003	남성	25	1059-1223
크라004	남성	15	1284-1392
크라005	남성	10-12	1170-1258
크라006	여성	30-40	1218-1266
크라007	여성	25-30	1167-1251
크라008	남성	20	1301-1402
크라009	남성	알려지지 않은	1158-1254
크라010	남성	25	1276-1383
크라011	여성	30-45	1040-1159

표 1: 유전적으로 결정된 성별, 고고학적으로 결정된 사망 추정 연령, 샘플링된 11명 모두에 대한 방사성 탄소 연대 측정(¹⁴C Cal 2-sigma). 이 표는 Parker, C. et al. 2020¹¹.

이러한 프로토콜을 사용하면 실험실에서 유도 된 DNA 오염이 제한적으로 5 개의 골격 요소 (pars petrosa 포함)에 걸쳐 8 개의 해부학 적 샘플링 위치에서 비교적 간단하고 효율적인 뼈 분말을 생성 할 수 있습니다. 이 5 개의 골격 요소 중에서, 4 개의 골격 요소에서 발견되는 7 개의 해부학 적 샘플링 위치는 소피라미드^11,12의 파괴적인 샘플링에 대한 실행 가능한 대안으로 결정되었습니다. 여기에는 영구 어금니의 시멘트, 상아질 및 펄프 챔버가 포함됩니다. 상부 척추 노치와 흉추의 몸에서 수집 된 피질 뼈; 정점 술의 하부 표면과 원위 지골의 축에서 비롯된 피질 뼈; 그리고 탈리의 외부 부분을 따라 조밀 한 피질 뼈. pars petrosa 4,12,13,14, 상아질 및 치수 챔버 1,2,15의 샘플링을 위해 널리 적용되는 몇 가지 방법이 있지만^, 시멘트 ¹⁶으로부터 뼈 분말의 성공적인 생성을 설명하는 발표 된 방법 , 척추체, 하부 척추 노치 및 거골은 얻기 어려울 수 있습니다. 따라서 여기에서는 petrous 피라미드에 최적화 된 샘플링 프로토콜을 보여줍니다 (3.1 단계). 성인 어금니의 시멘트 (단계 3.2.1), 상아질 (단계 3.2.2) 및 치수 (단계 3.2.3); 척추체의 피질 뼈 (단계 3.3.1) 및 상 척추 아치 (단계 3.3.2); 원위 지골 (단계 3.4); 및 talus (3.5 단계)는 aDNA 및 법의학 연구 모두에 이러한 골격 요소를보다 광범위하게 사용할 수 있도록합니다.

프로토콜

여기에 제시된 모든 연구는 고대 인간 유해 작업을 위해 독일 예나에 있는 막스 플랑크 인류 역사 과학 연구소에서 제시한 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜의 단계를 수행하기 전에 과학적 연구에 대한 허가를 얻고 해당 지역의 파괴적인 샘플링을 위한 인간 유해 사용과 관련된 모든 지역/주/연방 윤리 요구 사항을 준수해야 합니다. 모든 절차/화학 물질 보관은 개별 기관 안전 지침에 따라 수행해야 합니다.

1. 시료 처리 전 고려 사항

1. 고대 유적은 복제 할 수없고 유한 한 자원이므로 샘플을주의해서 취급하십시오 (예 : 샘플링은 가능한 한 최소한의 낭비가되어야하며 가능한 경우 모든 유해가 각각의 합법적 인 공급자에게 반환되어야합니다).
2. 클린룸 환경에서, 바람직하게는 전용 고대 DNA 시설(^17,18,19)에서 모든 단계를 수행한다. 후드가 있는 멸균 미세 다공성 작업복, 멸균 장갑(2쌍), 수술용 마스크, 보호 안경, 멸균 부츠 또는 멸균 커버가 있는 미끄럼 방지 신발로 구성된 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오(재료 표 참조). 특히 샘플 사이에 장갑을 자주 교체하십시오.
3. 가능한 경우 표백제/DNA 오염 제거 용액/에탄올 및 UV 조사(파장: 254nm)(예: 드릴 비트, 드릴, 바이스/클램프 등)로 모든 장비와 표면을 철저히 청소하고 소독합니다. 마지막으로, 클린룸 환경으로 인한 과도한 피로를 방지하기 위해 정기적인 인체공학적 휴식(가능하면 2-3시간마다)을 취하는 것이 좋습니다.
   참고: 모든 유골은 샘플링 전에 적절하게 문서화(예: 사진 촬영, 무게 측정, 가능한 경우 마이크로 CT 스캔, 3D 이미지 촬영 등)해야 합니다(적절한 문서화를 위한 프로토콜은 이 원고에서 다루지 않음). 모든 샘플링 프로토콜은 샘플링 반복 사이에 일시 중지될 수 있으며 샘플은 건조하고 온도가 제어되는(25°C) 멸균 환경에 무기한 보관할 수 있습니다.

2. 전처리

1. 오염 위험을 최소화하기 위해 뼈 분말 생성 전에 모든 해부학적 샘플링 위치의 오염을 제거합니다¹⁸.
   참고 : 샘플 오염 제거를위한 표백제 및 / 또는 표면 제거 (표면 제거 단계는 3.3.2 단계의 참고 참조)의 효능은 aDNA^연구자들 사이에서 여전히 논쟁의 여지가 있습니다 8,19,20,21,22,23,24,25 둘 다 전체 DNA 수율에 영향을 미칠 수 있습니다 특히 고도로 분해 된 샘플에서. 따라서 다음 단계는 선택 사항으로 간주되며 이 문서에 제시된 대표적인 결과를 생성하기 위해 모든 샘플에서 사용되었으므로 여기에 포함됩니다. 이러한 전처리 프로토콜의 사용은 각 샘플 세트의 분자 적용, 연령, 희귀성 및 형태학적 분해 수준에 따라 사례별로 결정하는 것이 좋습니다.
   1. 공기 흐름이 꺼진 상태에서 UV 광선이 장착된 중합효소연쇄반응(PCR) 후드 또는 생물안전 캐비닛 아래의 전용 클린룸에서 모든 샘플링을 수행합니다. 멸균 알루미늄 호일을 벤치 탑에 펴서 흩어진 뼈 가루/파편을 잡습니다.
   2. 호일을 폐기하기 전에 모든 뼈 조각이 회수되었는지 확인하십시오(송환용). 각 골격 요소의 처리 사이에 호일을 변경하십시오. 사용한 호일은 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백/용기에 폐기하십시오.
   3. 보풀이 없는 마른 멸균 물티슈로 해당 부위를 부드럽게 닦아 해부학적 샘플링 위치에서 느슨한 먼지/찌꺼기를 최대한 제거하십시오( 재료 표 참조). 물티슈는 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백이나 용기에 폐기하십시오.
   4. 희석된 상업용 표백제(~0.01% v/v, 초순수 DNase/RNase 유리 물로 희석)를 적신 멸균 물티슈로 닦아 세척된 표면의 오염을 제거하고 5분 동안 배양합니다. 물티슈는 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백이나 용기에 폐기하십시오.
      주의 : 표백제는 부식성이 높고 반응성이 높은 화학 물질입니다. 따라서 사용하기 전에 적절한 안전 예방 조치를 취해야합니다.
   5. 초순수 DNase/RNase가 없는 물에 적신 멸균 물티슈로 해부학적 샘플링 위치에서 가능한 한 많은 잔류 표백제를 제거합니다. 물티슈는 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백이나 용기에 폐기하십시오.
   6. 세척된 모든 해부학적 샘플링 위치를 UV 방사선에 30분(파장: 254nm) 동안 노출시킨 다음 실온에서 완전히 건조시킵니다. 샘플링을 진행하거나 보관으로 돌아가기 전에 해부학적 샘플링 위치가 완전히 건조되었는지 확인하여 뼈 분말 생성을 더 쉽게 할 뿐만 아니라 샘플(예: 곰팡이)의 추가 분해를 방지합니다.
      주의: 자외선에 노출되면 눈에 해로울 수 있습니다.
   7. 즉시 샘플링으로 이동하거나 건조하고 온도가 제어되는(25°C) 멸균 환경에서 골격 요소를 보관하십시오.

3. 뼈 분말 생성

참고: 다음 프로토콜은 Dabney et al. 2019 프로토콜²⁶에 따라 DNA 추출에 사용하기 위한 것입니다.

1. 샘플링 pars petrosa
   참고: 이 프로토콜은 Pinhasi et al. 2019에 설명된 절차에서 채택되었습니다.⁴ 사용 편의성을 위해 여기에 표시됩니다. 이 프로토콜은 샘플링을 위한 현재의 최소 파괴 방법을 나타내지 않습니다. pars petrosa. 따라서 Sirak et al. 2017¹³ 또는 오르파누 외. 2020¹⁴ 형태학적 보존이 가장 중요한 샘플의 경우.
   1. 공기 흐름이 꺼진 상태에서 UV 조명이 장착된 PCR 후드 또는 생물안전 캐비닛(파장: 254nm) 아래의 전용 클린룸에서 모든 샘플링을 수행합니다. 멸균 알루미늄 호일을 벤치 탑에 펴서 흩어진 뼈 가루/파편을 잡습니다.
   2. 호일을 폐기하기 전에 모든 뼈 조각과 가능한 한 많은 분말이 회수(송환용)되었는지 확인하십시오. 각 샘플링 사이의 호일을 변경합니다. 사용한 호일은 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백/용기에 폐기하십시오.
   3. 멸균된 클램프 또는 바이스를 사용하여 건조하고 오염이 제거된 요소를 고정합니다.
   4. 과열을 방지하기 위해 중간 속도로 1mm 블레이드(재료 표 참조)가 장착된 표준 보석상 톱을 사용하여 우수한 고랑 페트로수스(그림 0.6 참조)를 따라 파스 페트로사를 반으로 자릅니다(3.1.6단계 아래 참고 참조).
      주의 : 파스 페트로 사는 매우 조밀하므로 자르기가 어려울 수 있습니다. 부상을 방지하기 위해 요소를 단단히 고정하십시오. 부러진 톱날은 적절한 날카로운 물건 용기에 폐기하십시오.
   5. 클램프에서 페트로 부분을 제거하십시오. 느슨하거나 과도한 재료를 회수하고 저장하십시오.
   6. 멸균 계량 보트에 계량 용지 배치
   7. 계량 용지 위에 페트루스 부분을 잡고 절단 면이 계량 트레이 쪽으로 기울어집니다. 작은 게이지 비트 (재료 표 참조)가 장착 된 치과 드릴을 사용하여 안면관과 유양 돌기 antrum (주변 재료보다 더 빛나고 그림 1 참조) 사이의 조밀 한 피질 뼈를 뚫고 중간 속도, 중간 토크로 설정하여 뼈 분말을 생성합니다.
      알림: 드릴링/절단은 뼈가 과열되고 잠재적으로 DNA를 파괴/손상시키는 것을 방지하기 위해 저속에서 중속으로 짧은 버스트로 수행해야 합니다. 일화로, petrous의 조밀 한 부분이 과열되기 시작하면 요리 베이컨으로 묘사 된 냄새가 관찰 될 수 있습니다. 드릴링/톱질을 즉시 중단하고 다시 시작하기 전에 충분히 식을 때까지 뼈를 쉬게 하십시오.
   8. 최소 0.01mg까지 정확한 밀폐형 저울을 사용하여 측정한 대로 약 50-100mg의 분말이 칭량 용지에 수집될 때까지 드릴링을 반복합니다( 재료 표 참조).
      참고: 가능한 경우 각각 50mg의 복제 DNA 추출을 허용하기 위해 100mg의 뼈 분말을 수집하는 것이 좋습니다. 그러나 이것은 해부학적 샘플링 위치 자체의 제한(예: 원위 지골, 치수 챔버) 또는 형태학적 보존의 필요성에 따라 항상 가능한 것은 아닙니다. 시멘트와 같은 다른 위치의 경우 50mg 미만의 재료를 사용할 수 있습니다. 그러나 시멘트, 치수 챔버 및 원위 지골은 추출 과정에서 뼈 분말의 초기 투입량이 낮음에도 불구하고 모두 상당한 내인성 DNA 11,27,28을 생성하는 것으로 나타났습니다.
   9. 추출 또는 보관을 위해 칭량 종이에서 2mL 라벨이 부착된 저결합, 안전 잠금 튜브로 분말을 옮깁니다. 샘플을 -20 °C에서 무기한 보관하십시오.
   10. 반환/송환이 완료될 때까지 남은 뼈/초과 분말을 건조하고 온도가 제어되는(25°C) 멸균 환경에 보관하십시오.
   11. 모든 폐기물은 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백이나 용기에 버리십시오. 표백제/DNA 오염 제거 용액/에탄올을 사용하여 모든 재사용 가능한 장비(예: 클램프, 드릴 비트, 드릴, 톱 등)를 멸균/오염 제거하고 해당되는 경우 각 샘플링 사이에 UV(파장: 254nm) 노출을 제거합니다.

그림 1: 파스 페트로사를 포함한 측두골. (A) 페트로스 피라미드와 고랑 페트로사의 위치를 보여주는 샘플 사전 절단. (B) 드릴링할 조밀한 영역을 강조하는 절단 후 페트라우스 부분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 영구 어금니 샘플링
   알림: 영구 어금니 샘플링의 경우 사전 선택 in situ 뿌리가 융합되어 있고 이상적으로는 충치, 법랑질의 균열 또는 과도한 마모가 없는 어금니가 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 치과 미적분 샘플링을 제거하고 구강 마이크로바이옴의 향후 분석을 위해 -20°C에서 보관하십시오(절차는 여기에서 다루지 않음).
   1. 시멘트의 샘플링
      1. 공기 흐름이 꺼진 상태에서 UV 조명이 장착된 PCR 후드 또는 생물안전 캐비닛(파장: 254nm) 아래의 전용 클린룸에서 모든 샘플링을 수행합니다. 멸균 알루미늄 호일을 벤치 탑에 펴서 흩어진 뼈 가루/파편을 잡습니다.
      2. 호일을 폐기하기 전에 모든 뼈 조각과 가능한 한 많은 분말이 회수(송환용)되었는지 확인하십시오. 각 샘플링 사이의 호일을 변경합니다. 사용한 호일은 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백/용기에 폐기하십시오.
      3. 계량 용지 한 장을 멸균 계량 트레이에 넣습니다.
      4. 조정 가능한 렌치와 같은 휴대용 클램프를 사용하여 계량 트레이 위에 에나멜을 잡고 뿌리를 아래로 하여 오염이 제거된 어금니를 잡거나 고정합니다( 재료 표 참조).
      5. 치과 용 드릴에 다이아몬드 가장자리 원형 커팅 휠을 장착하십시오. 드릴을 중간 속도/토크 설정으로 설정한 상태에서 비트 가장자리를 약 -20° 각도로 루트에 가볍게 터치합니다.
      6. 트레이를 아래쪽으로 긁어 뿌리(시멘트)에서 가장 바깥쪽에 있는 노란색 재료를 제거/수집합니다. 상아질의 더 밝은 (흰색) 물질이 보일 때 수집을 중지하십시오.
         알림: 분말이 에어로졸화되어 트레이를 완전히 누락하여 샘플을 낭비할 수 없도록 수집 트레이를 기준으로 절단 비트의 회전 방향을 일치시키는 것이 중요합니다. 시멘트는 특히 DNA가 풍부합니다. 그러나 재료의 일반적인 수율은 다른 해부학적 샘플링 위치(~7-20mg)11,27,28보다 훨씬 작습니다.
      7. 최소 0.01mg까지 정확한 동봉된 저울을 사용하여 계량지에 수집된 분말의 질량을 기록합니다( 재료 표 참조).
      8. 추출을 위해 칭량 종이에서 2mL의 저바인딩 안전 잠금 튜브로 분말을 옮깁니다. -20°C에서 무기한 보관하십시오.
   2. 펄프 챔버의 샘플링
      1. 시멘트를 수집 한 후 (원하는 경우) 보석상의 톱을 사용하여 시멘트-에나멜 접합부를 따라 어금니를 절단하여 크라운을 제거합니다 ( 그림 2 참조).
      2. 새 계량 용지를 새 계량 트레이에 넣습니다.
      3. 크라운 섹션을 휴대용 클램프 또는 바이스에 계량 트레이 위에 고정합니다. 절단면을 아래쪽으로 기울인 상태로 잡고 크라운 부분 내의 펄프 챔버 가장자리를 따라 작은 게이지 드릴링 비트( 재료 표 참조)가 장착된 치과용 드릴을 사용하여 첫 번째 패스로 재료를 드릴/스크랩합니다( 그림 2 참조).
         알림: 펄프 챔버 내부의 첫 번째 통과 만 수집되어 펄프 재료 (5-15mg 일반 수율)로 표시되어야하며, 치아 깊숙한 곳은 상아질로 간주됩니다.
      4. 아래쪽 부분이 아래를 향하도록 치아를 돌리고 망치로 클램프를 두드리고 유리 분말을 계량 용지에 모으십시오.
      5. 동봉된 저울을 사용하여 칭량지에 수집된 분말의 중량을 최소 0.01mg까지 정확하게 기록합니다( 재료 표 참조).
      6. 추출을 위해 칭량지에서 2mL 저결합, 안전 잠금 튜브로 분말을 옮깁니다. -20°C에서 무기한 보관하십시오.
   3. 상아질 샘플링
      1. 새 계량 용지를 새 계량 트레이에 넣습니다.
      2. 칭량 트레이 위에 크라운 섹션을 잡고(3.2.2.3단계에 따름), 추가 상아질 샘플링을 위해 동일한 방식으로 펄프 챔버 내부에서 0.01mg( 재료 표 참조)까지 정확한 밀폐형 저울을 사용하여 측정한 50-100mg의 상아질을 추가로 뚫고 수집합니다( 그림 2 참조).
      3. 추출을 위해 칭량 종이에서 2mL의 저결합, 안전 잠금 튜브로 뼈 분말을 옮깁니다. -20°C에서 무기한 보관하십시오.
      4. 남은 치아 조각/여분의 분말은 반환/송환이 완료될 때까지 건조하고 온도가 제어되는(25°C) 멸균 환경에 보관하십시오.
      5. 모든 폐기물은 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백이나 용기에 버리십시오. 표백제/DNA 오염 제거 용액/에탄올 및 해당되는 경우 UV(파장: 254nm) 노출을 사용하여 모든 재사용 가능한 장비(예: 클램프, 드릴 비트, 드릴, 톱 등)를 각 샘플링 사이에 살균/오염 제거합니다.

그림 2: 영구 어 금니 사전 샘플링. (A) 샘플링 전에 전처리 된 어금니, 크라운, 시멘트 (뿌리의 황색 층) 및 시멘트-에나멜 접합부의 절단 부위를 보여줍니다. (B) 동일한 어금니 후 시멘트 수집, 시멘트-에나멜 접합부에서 절단 부위를 보여줍니다. (C) 치수 챔버와 크라운 내의 상아질에 대한 해부학적 샘플링 위치를 보여주는 어금니 절단 후 샘플링. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 흉추의 샘플링
   1. 척추체의 샘플링
      1. 공기 흐름이 꺼진 상태에서 UV 조명이 장착된 PCR 후드 또는 생물안전 캐비닛(파장: 254nm) 아래의 전용 클린룸에서 모든 샘플링을 수행합니다. 멸균 알루미늄 호일을 벤치 탑에 펴서 흩어진 뼈 가루/파편을 잡습니다.
      2. 호일을 폐기하기 전에 모든 뼈 조각과 가능한 한 많은 분말이 회수(송환용)되었는지 확인하십시오. 각 샘플링 사이의 호일을 변경합니다. 사용한 호일은 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백/용기에 폐기하십시오.
      3. 작은 계량 용지를 표준 계량 트레이에 넣습니다.
      4. 척추체가 바깥쪽을 향하도록 클램프 또는 핸드 바이스로 척추를 고정합니다.
      5. 척추체가 아래쪽으로 기울어진 상태에서 계량 트레이 위에 척추를 잡습니다. 저속 높은 토크로 설정된 작은 게이지 드릴링 비트( 재료 표 참조)가 장착된 치과용 드릴을 사용하여 척추체의 해면체 내부 조직을 둘러싸고 있는 피질 뼈의 가장 바깥쪽 림(하부 및 상)을 따라 드릴합니다( 그림 3 참조).
      6. 0.01mg까지 정확한 동봉된 저울을 사용하여 측정한 대로 50-100mg의 재료가 수집될 때까지 표준 가중 트레이 위의 피질층에 대해 비트를 긁어냅니다( 재료 표 참조).
      7. 추출을 위해 칭량지에서 뼈 분말을 2mL 저결합, 안전 잠금 튜브로 옮깁니다. -20°C에서 무기한 보관하십시오.
   2. 상부 척추 궁의 샘플링
      참고: 이 단계는 선택 사항입니다. 표면¹⁹를 따라 긁어내어 작은 게이지 드릴링 비트(재료 표 참조)가 장착된 치과용 드릴을 사용하여 상척추궁의 피질뼈의 최외층을 제거하고 버립니다. 이것은 피질 뼈의 층이 일반적으로 매우 얇고이 과정에 의해 완전히 고갈 될 가능성이 있기 때문에 척추체에서 샘플링하는 것은 권장되지 않습니다 (섹션 2의 참고 참조).
      1. 작은 계량 용지를 표준 계량 트레이에 넣습니다.
      2. 척추 돌기가 바깥쪽으로, 상한 측면이 아래로 향하도록 핸드 클램프/바이스에 척추를 고정합니다.
      3. 척추를 잡고 우수한 측면을 아래로 향하게 한 상태에서 계량 트레이 위에 저속 및 높은 토크로 설정된 작은 게이지 비트(재료 표 참조)가 있는 치과용 드릴을 사용하여 가시돌기와 라멜라(그림 3 참조)의 융합으로 형성된 V자형 노치의 중심으로 위쪽으로 뚫습니다.
      4. 저항이 눈에 띄게 떨어지면 드릴링을 중단하십시오. 드릴링 위치를 약간 변경하고 50mg까지 정확한 밀폐형 저울을 사용하여 측정한 대로 100-0.01mg의 뼈 분말이 수집될 때까지 반복합니다( 재료 표 참조).
      5. 추출을 위해 칭량지에서 2mL 저결합 튜브로 뼈 분말을 옮깁니다. -20°C에서 무기한 보관하십시오.
      6. 남은 뼈/과잉 분말은 반환/송환될 때까지 건조하고 온도가 제어되는(25°C) 멸균 환경에 보관하십시오.
      7. 모든 폐기물은 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백이나 용기에 버리십시오. 표백제/DNA 오염 제거 용액/에탄올을 사용하여 모든 재사용 가능한 장비(예: 클램프, 드릴 비트, 드릴, 톱 등)를 멸균/오염 제거하고 해당되는 경우 각 샘플링 사이에 UV(파장: 254nm) 노출을 제거합니다.

그림 3: 흉추의 척추체 및 상척추궁 피질뼈 해부학적 샘플링 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 원위 지골의 샘플링
   참고: 이 단계는 선택 사항입니다. 샤프트 및/또는 정점 다발의 피질 뼈의 최외층을 표면(¹⁹)을 따라 긁어내어 작은 게이지 드릴링 비트가 장착된 치과용 드릴을 사용하여 제거하고 폐기한다. 이것은 지나치게 얇은 피질 뼈 또는 어린 유해가있는 샘플의 경우 가능하지 않을 수 있습니다 (섹션 2의 참고 참조).
   1. 공기 흐름이 꺼진 상태에서 UV 조명이 장착된 PCR 후드 또는 생물안전 캐비닛(UV 파장: 254nm) 아래의 전용 클린룸에서 모든 샘플링을 수행합니다. 멸균 알루미늄 호일을 벤치 탑에 펴서 흩어진 뼈 가루/파편을 잡습니다.
   2. 호일을 폐기하기 전에 모든 뼈 조각과 가능한 한 많은 분말이 회수(송환용)되었는지 확인하십시오. 각 샘플링 사이의 호일을 변경합니다. 사용한 호일은 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백/용기에 폐기하십시오.
   3. 작은 계량 용지를 표준 계량 트레이에 넣습니다.
   4. 샘플을 핸드헬드 클램프/바이스에 고정하고 위쪽이 위쪽을 향하도록 합니다.
   5. 칭량 트레이 위에 샘플을 놓고 작은 게이지 드릴링 비트가 장착된 치과용 드릴(재료 표 참조)을 사용하여 가장 바깥쪽 조밀한 층(그림 4 참조)을 뚫어 정점 술과 샤프트의 아래쪽에서 피질 뼈에서 뼈 분말을 수집합니다.
   6. 저항이 현저히 감소하면 드릴링을 중단하십시오., 이는 더 가볍고 해면체 재료를 의미하기 때문입니다. 이 과정을 반복하여 0.01mg까지 정확한 밀폐된 저울을 사용하여 측정한 대로 최소 50-100mg의 뼈 분말이 수집될 때까지 초기 드릴링에서 바깥쪽으로 방사합니다( 재료 표 참조).
   7. 추출을 위해 칭량 종이에서 2mL의 저결합, 안전 잠금 튜브로 뼈 분말을 옮깁니다. -20°C에서 무기한 보관하십시오.
   8. 남은 뼈/과잉 분말은 반환/송환될 때까지 건조하고 온도가 제어되는(25°C) 멸균 환경에 보관하십시오.
   9. 모든 폐기물은 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백이나 용기에 버리십시오. 표백제/DNA 오염 제거 용액/에탄올을 사용하여 모든 재사용 가능한 장비(예: 클램프, 드릴 비트, 드릴, 톱 등)를 멸균/오염 제거하고 해당되는 경우 각 샘플링 사이에 UV 노출을 제거합니다.
      참고 : 더 작은 샘플 (예 : 청소년 샘플)의 경우 샘플에 사용할 수있는 피질 뼈의 제안 된 50-100mg보다 상당히 적을 수 있습니다. 그러나 소량에서도 이 해부학적 샘플링 위치는 특히 DNA¹¹이 풍부한 것으로 나타났습니다.

그림 4: 정점 술의 축과 아래쪽을 따라 조밀한 피질 뼈의 위치를 보여주는 원위 지골. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 거골 샘플링
   1. 공기 흐름이 꺼진 상태에서 UV 조명이 장착된 PCR 후드 또는 생물안전 캐비닛(파장: 254nm) 아래의 전용 클린룸에서 모든 샘플링을 수행합니다. 멸균 알루미늄 호일을 벤치 탑에 펴서 흩어진 뼈 가루/파편을 잡습니다.
   2. 호일을 폐기하기 전에 모든 뼈 조각과 가능한 한 많은 분말이 회수(송환용)되었는지 확인하십시오. 각 샘플링 사이의 호일을 변경합니다. 사용한 호일은 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백/용기에 폐기하십시오.
   3. 작은 계량 용지를 표준 계량 트레이에 넣습니다.
   4. 샘플을 핸드헬드 클램프/바이스에 고정하고 위쪽으로 돔합니다.
   5. 거골, 돔을 위쪽으로, 내측 표면을 칭량 트레이 위의 집진기 쪽으로 잡습니다. 저속 및 높은 토크로 설정된 낮은 게이지 비트(재료 표 참조)가 있는 치과용 드릴을 사용하여 거골의 목에서 ~1mm(그림 5 참조)의 깊이까지 피질 뼈를 긁습니다.
   6. 드릴링 위치를 약간 변경하고 50mg까지 정확한 밀폐된 저울을 사용하여 측정한 대로 약 100-0.01mg의 뼈 분말이 수집될 때까지 반복합니다( 재료 표 참조).
   7. 추출을 위해 칭량지에서 2mL 저결합 튜브로 뼈 분말을 옮깁니다. -20°C에서 무기한 보관하십시오.
   8. 남은 뼈/과잉 분말은 반환/송환이 완료될 때까지 건조하고 온도가 제어되는(25°C) 멸균 환경에 보관하십시오.
   9. 모든 폐기물은 오토클레이브 가능한 생물학적 위험 백이나 용기에 버리십시오. 표백제/DNA 오염 제거 용액/에탄올을 사용하여 모든 재사용 가능한 장비(예: 클램프, 드릴 비트, 드릴, 톱 등)를 멸균/오염 제거하고 해당되는 경우 각 샘플링 사이에 UV(파장: 254nm) 노출을 제거합니다.

그림 5: 피질 뼈 회복을 위한 거골의 샘플링 영역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

참고: 거골에는 피질 뼈(얇은 외층)가 거의 없습니다. 재료는 표면뿐만 아니라 해면골의 밑에있는 조밀 한 층에서도 수집되어야합니다.

결과

별도의 연구 11에서, 석회화 된 조직²의 짧은 단편에 최적화 된 표준 DNA 추출 프로토콜을 사용하여¹¹ 명의 개인의 각 해부학 적 샘플링 위치에서 생성 된 뼈 분말로부터 DNA를 추출했습니다. 그런 다음 단일 가닥 라이브러리를²⁸개로 생성하고 HiSeq 4000(75bp 쌍 끝)에서 샘플당 ~20,000,000회 읽기의 깊이로 시퀀싱했습니다. 이어서, 생성된 서열 데이터를 EAGER 파이프라인²⁹(BWA 설정: 시드 길이 32, 미스매치 페널티 0.1, 매핑 품질 필터 37)를 사용하여 내인성 인간 DNA 함량에 대해 평가하였다. 모든 대표 결과는 일관성을 위해 Parker et al. 2020¹¹과 동일한 메트릭을 사용하여 보고됩니다. pars petrosa의 분말 부분의 라이브러리는 조사 된 다른 23 개의 해부학 적 샘플링 위치보다 평균적으로 더 높은 내인성 DNA를 산출했습니다 (그림 6A-B). 이 프로토콜에 제시된 7 개의 추가 해부학 적 샘플링 위치 (시멘트, 치수 챔버의 첫 번째 통과 및 영구 어금니의 상아질, 척추체의 피질 뼈 및 흉추의 상 척추 궁, 원위 지골의 정점 술의 피질 뼈 및 거골 목의 피질 뼈)는 다음으로 높은 수율을 생성했습니다 (이러한 해부학 적 샘플링 위치간에 통계적 유의성이 없음; 그림 6A-B; 보충 파일 1: 내인성 DNAPreCap). 이러한 대체 위치는 모두 미토콘드리아 분석 및 단일 염기 다형성(SNP) 분석과 같은 표준 집단 유전학 분석에 적합한 DNA 수율을 일관되게 생성했습니다. 모든 해부학적 샘플링 위치에서 비롯된 라이브러리의 중복률은 낮았습니다(클러스터 계수 < 평균 1.2, 고유한 매핑 읽기에 대한 모든 매핑 읽기의 비율로 계산됨, 표 2; 보충 파일 1: ClusterFactor)를 참조하여 스크리닝된 모든 라이브러리가 매우 복잡함을 나타냅니다. 유사하게, 평균 외인성 인간 DNA 오염 추정치는 평균 < 2%(남성의 X 염색체 오염, ANGSD³⁰ 파이프라인에 의해 보고됨)로 우월한 척추궁을 제외한 모든 해부학적 샘플링 위치(평균 추정 오염: 2.11%, 하나의 샘플이 이상치로 제거됨; KRA005: 19.52%, 표 2 참조; 보충 파일 1: X오염). 평균 단편 길이 (30 bp < 모든 판독 값을 제거하기 위해 필터링 한 후)는 치수 챔버 및 상아질에서 수집 된 재료에서 가장 낮았으며 다른 해부학 적 샘플링 위치간에 유의 한 차이가 없었습니다 (각각 55.14 bp 및 60.22 bp, 평균 중앙값 62.87, 쌍별 p- 값 < 0.019, 표 2; 보충 파일 1: AvgFragLength). 또한 치아와 흉추에는 각각 높은 내인성 DNA 회수가 관찰 된 여러 해부학 적 샘플링 위치가 포함되어있어 pars petrosa의 대안으로 특히 적합합니다.

그림 6: 스크리닝된 모든 샘플에 대한 인간 DNA 함량. 검은색 선은 전체 평균을 나타내고 빨간색 선은 중앙값을 나타냅니다(고체: 인간 DNA 비율, 점선: 생성된 백만 건의 판독당 매핑된 인간 판독 수). 평균 인간 DNA 비율이 전체 평균 (8.16 %)보다 높은 개별 해부학 적 샘플링 위치는 모든 분석에서 채색됩니다. (A) hg19 참조 게놈에 매핑되는 판독의 비율. 파란색 점선은 파이프라인의 매핑 매개변수(시뮬레이션된 손상이 있는 hg19 참조 게놈에서 5,000,000회 읽기의 무작위 분포를 시뮬레이션하기 위해 Gargammel³¹ 을 사용하여 생성됨)에 주어진 이론적 최대값을 나타냅니다. 개별 평균(검은색 X)과 중앙값(빨간색 원)은 전체 평균보다 평균 인간 DNA 비율이 높은 샘플에 대해 보고됩니다. 신뢰 구간은 통계적 특이치를 제외한 상한과 하한을 나타냅니다. (B) 시퀀싱 노력의 백만 판독 당 hg19 참조 게놈에 매핑되는 고유 판독 수 (75 bp 쌍 말단). 신뢰 구간은 통계적 특이치를 제외한 상한과 하한을 나타냅니다. 이 수치는 Parker, C. et al. 2020¹¹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 모든 해부학적 샘플링 위치에 대한 평균 복제 수준(매핑 읽기/고유 읽기), 평균 및 중앙값 단편 길이, X 염색체 오염 추정치. 평균의 표준 오류로 보고된 오류입니다. 이 표는 Parker, C. et al. 2020¹¹.

샘플링 위치	평균 중복 계수(# 매핑된 읽기/# 고유한 매핑된 읽기)	평균 조각 길이(bp)	X 염색체 오염의 평균 추정 비율
페트로스 피라미드	1.188 ± 0.006	65.40 ± 1.36	0.000 ± 0.003
시멘트	1.197 ± 0.028	67.28 ± 1.76	0.011 ± 0.003
상아질	1.188 ± 0.061	60.22 ± 2.37	0.002 ± 0.007
펄프	1.179 ± 0.024	55.14 ± 2.90	0.013 ± 0.006
원위 지골	1.191 ± 0.049	65.95 ± 1.08	0.013 ± 0.005
척추체	1.194 ± 0.037	66.14 ± 1.03	0.008 ± 0.003
우수한 척추 아치	1.19 ± 0.017	63.02 ± 1.23	0.021 ± 0.009*
거골	1.198 ± 0.010	68.20 ± 1.24	0.011 ± 0.003
*샘플 KRA005는 0.1952에서 이상치로 제거되었습니다.

코드 가용성
이 원고의 분석에 사용된 모든 분석 프로그램과 R 모듈은 해당 저자로부터 자유롭게 구할 수 있습니다. 모든 사용자 지정 R 코드는 요청에 따라 사용할 수 있습니다.

데이터 가용성
대표 결과 계산에 사용된 모든 원시 데이터는 유럽 뉴클레오티드 아카이브 ENA 데이터 저장소(수탁 번호 PRJ-EB36983) 또는 Parker, C. et ^al.11의 보충 자료에서 자유롭게 사용할 수 있습니다.

보충 파일 1. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

고대 인간 집단 유전학의 현재 관행은 가능할 때마다 pars petrosa (2.1 단계)에서 우선적으로 샘플링하는 것입니다. 그러나, pars petrosa는 무수한 골격 평가 (예 : 인구 이력 32, 사망시 태아 연령 추정³³ 및 성 결정³⁴)에 대해 매우 가치가 있기 때문에 얻기 어려운 샘플이 될 수 있으며, 역사적으로 DNA 분석을위한 파스 페트로 사의 샘플링은 매우 파괴적 일 수 있습니다^3,4 (여기에 제시된 프로토콜 포함^, 이러한 우려를 완화하기 위해 새로운 최소 침습적 프로토콜^13,14가 널리 채택되었지만). 이것은 아주 최근까지 골격을 가로지르는 인간 DNA 회복에 대한 대규모의 체계적인 연구가 시도되지 않았기 때문에 더욱 복잡해집니다.¹¹, 소피라미드를 사용할 수 없을 때 적절한 샘플링 전략을 찾는 것이 어렵습니다.

여기에 제시된 프로토콜은 pars petrosa를 포함한 고고학/법의학 골격 유적에서 DNA 샘플링을 위한 최적화된 절차 세트와 4개의 추가 골격 요소에 걸친 7개의 대체 해부학적 샘플링 위치를 제공함으로써 이러한 문제를 완화하는 데 도움이 됩니다. 포함된 중요한 단계는 모두 비효율적인 샘플링(2.1.6단계 및 3.2.1.3단계) 또는 드릴링/절단 중 샘플 과열(3.1.6단계)로 인한 DNA 손실/손상 가능성을 최소화하기 위한 것입니다. 또한 프로토콜 전반에 걸쳐 고도로 분해된 샘플에서 최상의 성능을 보장하기 위해 전처리 단계를 수정/생략해야 할 수도 있다는 점이 언급되었습니다. 또한 여기에 제시된 선택된 요소 중에도 몇 가지 가능한 대체 샘플링 기술 (특히 pars petrosa^13,14의 경우)이 남아 있으며 여기에 제시된 미개발 된 해부학 적 샘플링 위치 (즉^, 거골 : 2.5 단계 및 척추 : 2.3 단계).

또한 이러한 프로토콜은 내인성 인간 DNA 분석을 위해 고품질의 고대 청소년-성인 유골(우수한 형태학적 보존)을 사용하여 설계 및 테스트되었음을 명심하는 것이 중요합니다. 제시된 결과는 추가 맥락에서 이러한 프로토콜의 사용에 대한 더 큰 탐구가 여전히 필요하기 때문에 더 고도로 분해된 물질, 기타 보존 맥락, 유아 유해, 비인간 유해 또는 병원체 또는 미생물군집에 대한 연구로 확장되지 않을 수 있습니다. 또한 여기에 제시된 대체 골격 요소(치아, 척추, 원위 지골 및 탈리)는 혼합된 유골 중 단일 개체에 할당하기 어려울 수 있으므로 단일 기원을 보장하기 위해 여러 요소에서 샘플링해야 합니다. 이러한 한계에도 불구하고 이러한 프로토콜을 널리 사용할 수 있도록 하면 인간 유해에 대한 광범위한 미래 aDNA/법의학 연구에 사용할 수 있도록 일반화되고 정량적으로 최적화된 프레임워크를 제공함으로써 샘플 선택 및 처리를 둘러싼 일부 이질성을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
#16 Dental Drill Bit	NTI	H1-016-HP	example drilling bit
0.6 mm scroll saw blade	Fisher Scientific	50-949-097	blade for Jewellers Saw
22mm diamond cutting wheel	Kahla	SKU 806 104 358 514 220	Dremel cutting attachment
Commercial Bleach	Fisher Scientific	NC1818018
Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil	Fisher Scientific	15-078-29X
DNA LoBind Tubes (2 mL)	Eppendorf	22431048
Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment	Dremel	225-01	Dremel flexible extension
Dremel 4300 Rotary Tool	Dremel	4300	Example drill
Dremel collet and nut kit	Dremel	4485	Adapters for various Dremel tool attachments/bits
Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag	Fisher Scientific	17-988-501
Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	13-698-792
Ethanol (Molecular Biology Grade)	Millipore Sigma	1.08543
FDA approved level 2 Surgical Mask	Fisher Scientific	50-206-0397	PPE
Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves	Fisher Scientific	19-041-171X	PPE
Fisherbrand Safety Glasses	Fisher Scientific	19-130-208X	PPE
Granger Stationary Vise	Fisher Scientific	NC1336173	benchtop vise
Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water	Fisher Scientific	10-977-023
Jewellers Saw	Fisher Scientific	50-949-231
Kimwipes	Sigma-Aldritch	Z188956
Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet	Fisher Scientific	30-368-1101
LookOut DNA Erase	Millipore Sigma	L9042-1L
Medium weighing boat	Heathrow Scientific	HS120223
MSC 10pc plier/clamp set	Fisher Scientific	50-129-5352	Miscellaneous clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting
Sartorius Quintix Semi-Micro Balance	Fisher Scientific	14-560-019	enclosed balance
Tyvek coveralls with hood	Fisher Scientific	01-361-7X	PPE
Weigh paper	Heathrow Scientific	HS120116