색색세포 기반 분석법을 사용하여 AAV에 대한 항체 중화를 검출하는 단계별 방법

요약

포괄적인 실험실 프로토콜 및 분석 워크플로우는 AAV6에 대한 중화 요소를 감지하기 위해 신속하고 비용 효율적이며 간단한 색채 세포 기반 분석법을 위해 설명됩니다.

초록

재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)는 실험실과 클리닉 모두에서 다양한 건강 상태를 치료하기 위해 유전 물질을 옮기는 안전하고 성공적인 벡터로 입증되었습니다. 그러나, AAV capsids에 대하여 기존의 중화 항체 (NAbs)는 큰 동물 실험 모형 및 인간 인구 둘 다에 있는 유전자 치료의 성공적인 행정을 위한 지속적인 도전을 제기합니다. AAV에 대한 숙주 면역을 위한 예비 스크리닝은 연구 도구와 임상적으로 실행 가능한 치료제로서 AAV 기반 유전자 치료의 효능을 보장하기 위해 필요하다. 이 프로토콜은 AAV 혈청형 6(AAV6)에 대한 중화 요인을 감지하기 위해 체외 분석에서 착색을 설명합니다. 분석은 알칼리성 인산화(AP) 리포터 유전자와 그 기판 NBT/BCIP 사이의 반응을 활용하여 조합시 불용성 정량화 가능한 보라색 얼룩을 생성한다.

이 프로토콜에서 혈청 샘플은 AP를 표현하는 AAV와 결합되어 잠재적 중화 활동이 발생할 수 있도록 배양됩니다. 바이러스 혈청 혼합물은 이후에 중화되지 않은 모든 AAV의 바이러스 성 변환을 허용하기 위해 세포에 첨가됩니다. NBT/BCIP 기판이 첨가되고 바이러스 성 트랜스듀션 및 중화 활동에 대응하는 염색체 반응을 겪는다. 영역 색상의 비율은 자유 소프트웨어 도구를 사용하여 양으로 양화되어 중화 티터를 생성합니다. 이 분석은 착색과 바이러스 성 농도 사이의 강한 긍정적 인 상관 관계를 표시합니다. 재조합 AAV6의 투여 전후 양으로부터의 혈청 샘플의 평가는 중화 활성의 극적인 증가로 이어졌다 (125 받는 >10,000 배 증가). 분석은 >1:32,000 혈청 희석제에서 중화 활동을 감지하는 적절한 감도를 나타냈다. 이 분석법은 AAV에 대한 NAbs를 감지하는 간단하고 빠르며 비용 효율적인 방법을 제공합니다.

서문

아데노 관련 바이러스(AAV)는 심혈관, 폐, 순환, 안구 및 중추 신경계에 영향을 미치는 다양한 건강 상태에 대한 임상 시험 치료에 유전자 요법을 전달하기 위한 벡터로 점점 더 많이 사용되고 있다^1,2,3,4,5. 선도적인 유전자 치료 플랫폼으로서 AAV 벡터의 인기는 양성 안전 성, 장기 간 질유전자 발현 및 광범위한 조직 별 트로피즘^1,6에서 비롯됩니다. 동물 연구에서 성공적인 결과는 성공적으로 그들의 효험 끝점에 도달한 50 개 이상의 AAV 유전자 치료 임상 시험을 위한 도로를 포장했습니다⁷, 미국 식품 의약국^에 의해 승인된 첫번째 상업적으로 유효한 AAV 유전자 치료 약의 방출8. 초기 성공에 이어, AAV는 선택의 벡터로서 기본 및 임상 연구 분야에서 견인력을 계속 얻고 있으며 현재 미국과 유럽에서 임상 사용을 위해 승인 된 유일한 생체 유전자 치료법입니다⁹. 그럼에도 불구하고, AAV 벡터 캡시드에 대한 기존의 중화 항체(NAbs)의 존재는 임상 전 연구와 임상 시험의 효능 모두에 방해가 되고 있다. NAbs는 순진한 인간과 동물 집단 모두에서 존재하며 AAV 벡터¹의 생체 투여에 따른 유전자 전이를 억제한다. AAV 혈청화는 대부분의 유전자 치료 예심을 위한 제외 기준이고, 그러므로 호스트 면제를 위한 예비 검열은 실험실과 진료소 둘 다에서 중요합니다. AAV에 대한 NAbs의 존재를 감지할 수 있는 분석서를 확립하는 것은 모든 AAV 유전자 치료 기반 연구 프로젝트의 파이프라인에 필수적인 단계입니다. 이 보고서는 AAV6에 초점을 맞추고 있다 그 효율적이 고 선택적 변환 으로 인해 연구자에 게 관심 있다 (심장과 골격 근육)^1,10,11,12. 유전자 치료는 침략적인 개방 심장 절차 없이 심혼을 구체적으로 표적으로 하기 어렵기 때문에 심혼을 표적으로 하기 위한 유망한 전략으로 여겨됩니다.

중화 활성은 일반적으로 세포 기반 의 체외 또는 생체 내 트랜스포션 억제 분석체를 사용하여 결정된다. 생체 내 NAb assays는 일반적으로 시험 대상자(예를 들어, 인간 또는 큰 동물)로부터 혈청을 마우스로 투여하고, 리포터 유전자를 가진 AAV가 그 뒤를 잇고, 이어서 리포터 유전자 또는 해당 항원의 발현을 위한 테스트를 포함한다. 시험관 내 실험은 리포터 유전자를 표현하는 재조합 AAV(rAAV)를 사용하여 인간 또는 대형 동물로부터 혈청 또는 플라즈마를 배양하여 NAb 티터를 결정합니다. 세포는 혈청/바이러스 혼합물에 감염되고, 리포터 유전자 발현이 억제되는 정도는 대조군과 비교하여 평가된다. 시험관 내 소는 상대적으로 낮은 비용, 테스트의 급속성 및 생체 내 에세이^{에 비해 표준화 및 유효성 검사}에 대한 더 큰 용량으로 인해 NAb 스크리닝에 널리 사용됩니다. 생체 내 아세약은 종종 더 큰 감도^{가보고15,16}, 하지만 같은 주장은 체외 애사^14,17에 관한 만들어졌다.

현재까지, 시험관 내 NAb 아세약은 주로 발광(luciferase)을 중화를 검출하기 위해 기자 유전자로서 사용하였다. 빛 기반 방법은 많은 맥락에서 장점이 있지만, 색색/염색체 NAb 분석법은 어떤 상황에서도 유리할 수 있다. 중화를 평가하기 위한 색인 분석법에서는 인플루엔자 및 아데노바이러스^18,19와 같은 다른 바이러스에 성공적으로 사용되었습니다. 그들의 매력은 단순함, 저렴한 비용 및 일상적인 실험실 장치 및 ^tools20에 대한 요구 사항에서 비롯됩니다. 발광 기반 리포터 유전자를 사용하는 NAb 분석은 분석²¹에 비용이 많이 드는 기판 키트, 광미계 및 해당 소프트웨어가 필요합니다. 이 색분석 분석은 가벼운 현미경과 매우 저렴한 기판을 필요로하는 장점이 있습니다. 색인과 발광 분석의 민감도에 대한 보고는 상충하는 결과를 낳았습니다. 한 연구는 발광 기반 ELISA 분석 이 더 큰 감도 및 색상 분석에 비교 재현성을 표시 제안 ²², 다른 발견 된 색인식 기반 ELISA 분석 더 큰 감도²³. 여기서, 알칼리인스파타제(AP) 리포터 유전자와 니트로 블루 테트라졸륨/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 인산염(NBT/BCIP) 기산염(NBT/BCIP) 기산염을 인코딩하는 AAV 사이의 염색체 반응을 활용하는 AAV에 대한 시험관 NAb 분석에 대한 상세한 프로토콜이 제공된다. 이러한 단계별 프로토콜은 ^AAV24에 대한 중화 활성을 검출하기 위해 hPLAP(인간 태반 알칼리인스파라스) 리포터 유전자(AAV6-hPLAP)를 활용한 이전 보고서에 기초하여 개발되었다. 이 분석법은 비용 효율적이고 시간 효율적이며 설치가 용이하며 최소한의 기술 기술, 실험실 장비 및 시약이 필요합니다. 더욱이, 이 분석의 단순성은 세포, 조직, 또는 바이러스성 혈청형의 다른 모형에 걸쳐 광범위한 응용에 최적화될 가능성을 제공합니다.

프로토콜

동물 관리 및 실험의 모든 측면은 신경 과학 및 정신 건강 지침의 플로리 연구소와 참조 ²⁵ 다음 과학적 목적을 위한 동물의 관리 및 사용에 대 한 호주 코드에 따라 실시 되었다. 1.5-3세 메리노 에베가 연구에 사용되었습니다. 분석 프로토콜에 대한 회로도 개요는 그림 1에 제공됩니다.

그림 1: NAb 분석 프로토콜의 회로도 도표. (A) 3일 프로토콜과 관련된 기본 단계를 설명하는 NAb 분석기의 시각적 표현. 간략하게, 세포는 하룻밤 성장하고 도금됩니다. 다음 날, 혈청의 연쇄 희석이 준비되고 AAV로 배양한 다음 하룻밤 동안 세포로 배양됩니다. 다음 날, 세포는 고정, 세척, 배양, 기판과 결합하고 다시 배양하고, 이미징 및 수량에 선행됩니다. (B) 최소 신호 제어(완전한 AAV 억제), 최대 신호 제어(억제 없음), 및 ~50% 신호 억제를 갖춘 오바인 혈청 샘플의 대표적인 이미지. 배율 막대 = 0.5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 초기 준비

1. 양에서의 평가: 8mL 세럼 분리기 응고 활성제 튜브( 재료 표 참조)에서 혈액을 채취하고, 실온(RT)에서 20-30분 동안 혈액 샘플을 두고, 그 후 15분 동안 2,100x g 로 스핀다운합니다. 튜브 의 상단에 형성 명확한 상신은 혈청입니다. 미세 원심 분리기 튜브로 명확한 수성 단계를 알리쿼트하고 -80 °C에 저장합니다.
   참고 : -80 °C의 혈청은 ~ 5 년 동안 안정적으로 유지됩니다. 혈액은 의식이 있는 동물로부터 16G 바늘(팁 컷오프)과 주사기를 사용하여 경동맥 정맥에서 채취하였다.
2. 열은 30 분 동안 56 °C의 수조에 배치하여 태아 소 혈청 (FBS)을 비활성화하고 간헐적으로 소용돌이. 정밀도를 위해, 동등한 양의 물을 포함하는 두 번째 병에 온도계를 놓고 FBS 병과 동시에 열 목욕에 추가하십시오. 온도계가 56°C에 도달하면 타이밍을 시작합니다.
3. 세포 배양 후드^26,27에서 수행되는 모든 후속 단계에 적합한 무균 기법과 세포 배양 실습을 채용한다. 사용하기 전에 모든 물체와 후드에 70% 에탄올을 뿌리고 완료 시 1% 하이포염소산 나트륨으로 청소하십시오.
4. 고혈당(4.5g/L) DMEM(89%)과 열활성화 FBS(10%) 및 페니실린 연쇄절제술(1%)을 결합하여 DMEM의 수정이 본조 매체(DMEM)를 완성합니다. 멸균 진공 여과 시스템(0.22 μm 모공 크기, 폴레셔술폰 멤브레인)을 사용하여 결합하고 필터링합니다( 재료표 참조). 4 °C에서 호일에 싸여 전체 DMEM을 저장합니다.
5. 참조²⁸에 설명된 바와 같이 HT1080 셀(재료 표 참조) 및 75cm2 제곱 플라스크로 통로를 설정합니다. 셀의 여러 고정 된 주식을 만듭니다. 추가 패시징이 분석 결과에 영향을 줄 수 있기 때문에 20 개의 구절 후에 세포를 사용하지 마십시오.

2. 1 일 - 세포 도금

1. 그들은 ~ 80 % 합류에 도달 할 때 통과 HT1080 세포.
2. 사전 웜 완전 DMEM (단계 1.4에서 제조), 0.05% 트립신-EDTA, 1x 인산 완충식식염(PBS) ~ 37°C의 수조. 포부 시스템을 사용하여 통로 세포에서 성장 배지를 제거합니다.
   참고: 이 프로토콜의 모든 포부는 멸균 5mL 세로지컬 파이펫에 튜브가 부착된 진공 시스템을 사용합니다.
3. 전침(37°C) 10mL로 세포를 세척하고 3-4분 동안 전동된 0.05% 트립신-EDTA의 4mL에서 3-4분 동안 세포를 플라이스크에서 분리한다.
4. 사전 따뜻하게 된 완전한 DMEM의 6 mL을 추가하고 50 mL 튜브에 세포를 파이펫하여 트립신을 비활성화합니다. 혈변계 및 트라이판 블루 배제 방법을 사용하여 실행 가능한 세포의 수와 농도를 계산^합니다29.
5. 세포를 1 x ¹⁰⁵ 셀/mL의 농도로 희석하여 사전 따뜻하게 된 완전한 DMEM에서 희석합니다. 명확한 96 웰 평평한 바닥 플레이트 (잘 당 1 x ¹⁰⁴ 세포)로 셀 / 잘 의 씨앗 100 μL. 플레이트를 37°C, 16-22h에 대해 밤새 이산화탄소(_CO2)를 5% 배양한다.

3. 2 일 - 세포 감염

1. 인큐베이터에서 플레이트/s를 제거하고 가벼운 현미경을 사용하여 세포가 우물 내에 균등하게 분산되고 합류가 ~50%임을 확인합니다. 세포가 45%-55%의 수렴 범위 내에 있지 않으면 '1일' 프로토콜을 반복하고 이에 따라 초기 세포 농도를 조정합니다.
2. 사전 따뜻하게 된 완전한 DMEM을 희석제로 사용하여 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에 관심있는 혈청 샘플의 직렬 희석을 생성합니다. 표 1 은 트리탈리케이트 샘플에 대한 희석 캐스케이드의 생성을 보여 줍니다.
   1. 삼중에서 분석법을 수행하려면, 1x PBS에서 바이러스 스톡 솔루션을 희석하여 AAV6-hPLAP의 작동 용액의 7.5 x ¹⁰⁶ 벡터 게놈(vg)/μL을 준비한다.
   2. 7.5 x ¹⁰⁶ vg/μL 바이러스 작동 솔루션의 66 μL을 혈청/미디어 희석 264 μL을 포함하는 각 튜브에 추가합니다(총 부피/희석의 330 μL, 표 1 참조).
      참고: 완벽한 문화 조건이 필요하지 않은 강력한 분석입니다. 그러나, 각 분석실행이 신뢰할 수 있도록 정확하게 양과 확인하려면, 다음과 같은 다음을 포함할 필요가 있다: (1) 바이러스 및 미디어 전용 제어, (2) 미디어 전용 제어, (3) 동일한 실험 조건 하에서 모든 플레이트에 NAb 양성 제어 샘플. 설명된 부피(330 μL)는 혈청 및 바이러스 혼합물의 트리플리케이트 샘플 +10%를 차지합니다. 복제를 수행하는 것은 활동을 중화하는 정확한 결정에 매우 권장됩니다.
3. 바이러스/혈청 희석제는 피펫팅에 의한 바이러스/혈청 희석제와 바이러스/혈청 혼합물을 함유한 튜브를 37°C에서 인큐베이터에 넣고, 30분 동안 5% _CO2 를 배치하여 잠재적 중화가 발생할 수 있도록 한다.
4. 96웰 플레이트에 각각 1 x ¹⁰⁴ 셀/웰을 함유한 바이러스/혈청 혼합물의 파이펫 100 μL...
   참고: 이것은 각 우물에서 감염 (MOI)의 15k 바이러스/세포 복합성의 최종 바이러스 농도를 생성합니다. 표 2 는 1/512 희석시 샘플을 평가하기 위한 예제 96웰 샘플 플레이트 레이아웃을 제공합니다.
5. 세포, 혈청 및 AAV-hPLAP를 포함하는 96웰 플레이트를 호일에 싸서 37°C에서 인큐베이터에 넣고, 16-24h에 대해 16-24h의 5% _CO2 를 세포로 입력할 수 있도록 한다.

희석 캐스케이드 라벨	희석	3 x 샘플 (240 μL) + 10 % 완충부 (24 μL)	혈청 비율:미디어
희석 1 (D1)	1/2	264 μL 혈청 264 μL 미디어	50:50
희석 2 (D2)	1/4	264 μL D1 + 264 μL 미디어	25:75
희석 3 (D3)	1/8	264 μL D2 +264μL 미디어	12.5:87.5
희석 4 (D4)	1/16	264 μL D3 +264 μL 미디어	6.25:93.75
희석 5 (D5)	1/32	264 μL D4 +264 μL 미디어	3.13:96.87
희석 6 (D6)	1/64	264 μL D5 +264 μL 미디어	1.56:98.44
희석 7 (D7)	1/128	264 μL D5 +264 μL 미디어	0.78:99.22
희석 8 (D8)	1/256	264 μL D5 +264 μL 미디어	0.39:99.61
희석 9 (D9)	1/512	264 μL D7 + 264 μL 미디어	0.2:99.8
희석 10 (D10)	1/2048	132 μL D8 + 396 μL 미디어	0.05:99.95
희석 11 (D11)	1/8192	132 μL D9 + 396 μL 미디어	0.01:99.99
희석 12 (D12)	1/32768	132 μL D10 + 396 μL 미디어	0.003:99.997

표 1: 삼중음부에서 혈청의 직렬 희석을 생성하는 데 필요한 혈청 및 희석제의 볼륨.

세럼 샘플 #1

세럼 샘플 #2

세럼 샘플 #3

모노 AB(mAB), 컨트롤 및 추가 샘플

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

1/2

50 ng MAb

50 ng MAb

50 ng MAb

B

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

1/4

5 ng MAb

5 ng MAb

5 ng MAb

C

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

1/8

0.5 ng MAb

0.5 ng MAb

0.5 ng MAb

D

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

1/16

MO (-C)

MO (-C)

MO (-C)

E

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

1/32

VO (+C)

VO (+C)

VO (+C)

F

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

1/64

샘플 #1 1/512

샘플 #1 1/512

샘플 #1 1/512

G

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

1/256

샘플 #2 1/512

샘플 #2 1/512

샘플 #2 1/512

H

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

1/512

샘플 #3 1/512

샘플 #3 1/512

샘플 #3 1/512

표 2: 1/2에서 1/512에 이르는 희석제의 순진한 혈청 샘플을 평가하기 위한 예제 96웰 플레이트 레이아웃. AAV NAbs(투여 후 샘플)에 대해 양성으로 알려진 샘플을 평가하거나 더 높은 티터가 필요한 경우 더 높은 희석이 분석에 통합됩니다. MO(-C): 미디어 전용 제어. VO (+C): 바이러스 및 미디어만 제어합니다. mAb: AAV에 대한 단일 클론 항체 (NAb 양성 대조군).

4. 3 일 - 세포에 기판을 고정하고 추가하십시오.

1. 37°C(~25mL/96웰 플레이트)로 1배 PBS의 알리쿼트를 미리 데우습니다. PBS (~25mL/96웰 플레이트)와 이중 증류 _H2O(DDW, ~25mL/96웰 플레이트)의 4°C를 식히세요. 소용돌이에 의해 50 mL 원심 분리기 튜브에 DDW의 10 mL에 BCIP / NBT의 펠릿 ( 재료의 표 참조)를 용해 (10 mL은 2 x 96 웰 플레이트에 충분하다).
2. 흡입 기반 포부 시스템 또는 연기 후드 진공에 부착 된 세로지학적 파이펫 또는 이와 유사한 것을 사용하여 96 웰 플레이트의 우물에서 미디어를 흡인. 세로지학적 파이펫 끝을 부드럽게 우물에 넣고 부착된 세포를 방해하지 않도록 주의를 기울이십시오.
   1. 파이펫을 사용하여 각 웰에 RT 4% PFA의 50 μL을 추가합니다. 호일에 접시를 감싸고 10 분 동안 RT에 두고 세포를 고정하십시오.
      주의: Paraformaldehyde (PFA)는 가능한 발암 물질이며 피부 또는 눈 접촉 또는 흡입에서 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비와 얼굴 마스크로 연기 후드를 처리하십시오. PBS에서 4% PFA를 희석시 만듭니다(96웰 플레이트당 7mL).
3. RT 1x PBS의 200 μL로 세포를 세척하고 흡인합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
   참고: 멀티채널 파이펫은 파이펫팅 단계에 효율적인 옵션입니다.
4. 파이펫 200 μL 각각의 우물로 미리 따뜻워진 PBS, 호일로 플레이트를 감싸고 65°C에서 내성 알칼리성 인산포아아제 활성³⁰을 90분 동안 배양한다.
5. 흡입 우물과 세척 셀 200 μL의 감기 (4 °C) PBS. 다시 흡인, 차가운 DDW의 200 μl에 세척하고 다시 흡입.
6. 각 우물에 용해 된 BCIP/NBT(4.1단계에서 준비)의 파이펫 50 μL.
7. 접시를 호일로 감싸고 RT에서 2-24 h로 배양합니다.
   참고: 실행 사이의 인큐베이션 시간과 일치하십시오. 시간 유연성을 통해 사용자는 3일째 또는 다음 날 우물을 촬영할 수 있습니다.
8. 가벼운 현미경 카메라를 사용하여 4배 의 객관적인 렌즈를 사용하여 각 우물의 사진을 찍어 동일한 노출, 흰색 밸런싱 및 조명 설정을 수행한 모든 곡에 일관되게 사용됩니다.
   1. 각각을 동일하게 배치하고 우물의 가장자리가 사진에 표시되지 않도록 합니다. 사진을 TIF 형식으로 저장하거나 이와 유사한 것으로 저장합니다.
      참고: 특정 설정은 현미경마다 다르지만, 배경 조명이 우물 전체에서 높고 일관된 경우 수량이 가장 효과적입니다(그림 1B).

5. ImageJ를 사용하여 중화 활동을 결정하는 수량

1. 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어 "ImageJ"를 다운로드하고 설치 합니다(자료표 참조).
2. 파일 > 열기(그림 2)를 선택하여 ImageJ에서 분석할 이미지를 엽니다.
3. 컬러 이미지를 사용하는 경우 이미지 > 유형 > 8비트를 선택하여 회색 으로 변환합니다.
4. > 임계값을 조정하기 > 이미지를 클릭합니다. 모든 색깔영역이 빨간색으로 칠해지 않고 배경이 지정되지 않을 때까지 임계값을 조정합니다. NBT/BCIP를 추가하면, 유색 제품은 hPLAP를 표현하는 세포 주변 지역에 입금됩니다.
   참고: 동일한 플레이트에서 캡처한 모든 이미지에 대해 동일한 임계값 설정을 사용하는 것이 좋습니다.
5. 측정 을 > 분석한 다음 영역을 체크하고 임계값으로 제한, 영역 분수 및 레이블 표시 확인란을 클릭하고 확인을 클릭합니다.
6. 주어진 우물의 신호 판독값(색채 백분율)을 확인하려면 > 측정 분석분석을 클릭합니다. 팝업 창의 '% 영역' 열에는 신호 판독값이 표시됩니다.
7. 모든 샘플 복제에 대해 수량을 수행합니다. 오염된 우물, 고르지 않은 세포 분포를 보여주는 우물 또는 세포 밀도 또는 조명에 따라 다양한 우물을 제외하십시오.
   참고: 제외로 고려해야 할 우물의 예는 보충 그림 1 을 참조하십시오. 일반적으로 3-4 우물은 96웰 플레이트에서 제외해야 할 수 있습니다. 도 2 는 ImageJ를 사용하여 수량 프로세스의 시각적 표현을 제공합니다.

그림 2: ImageJ 소프트웨어를 사용하여 백분율 색을 결정하는 단계입니다. (A) ImageJ 소프트웨어로 분석할 이미지를 엽니다. (B) 이미지를 8비트 그레이스케일로 변환합니다. (C) 임계값 창을 엽니다. (D) 모든 색깔영역이 덮여 있도록 최대 임계값을 조정하지만 배경 영역은 그렇지 않습니다(이 임계값은 전체 플레이트에 걸쳐 일치해야 합니다). (E) '분석' 드롭박스를 선택하고'측정 설정', '영역', '영역 분수', '제한 임계값', '표시 레이블'을 클릭하고 'OK'를 클릭합니다. (F) '측정'을 클릭하여 덮여 영역을 측정합니다. % 영역은 색칠된 이미지의 비율을 나타냅니다. 그런 다음 제어 샘플과 함께 _TI50 티터를 확인할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 트랜스듀션 억제(_TI50) 타이터 의 결단

1. 다음에 대해 복제(5단계에서 설명된 단계를 사용하여)에서 평균 판독값을 결정합니다. (2) 바이러스 + 미디어 만 제어 (최대 신호 판독). (3) 관심있는 바이러스 + 혈청 샘플.
2. 다음 수식을 사용하여 억제비율을 계산합니다.
   100 - [(테스트 샘플 신호 판독(바이러스 + 세럼 샘플 관심) - 기준신호 판독(미디어 전용 제어)) / (최대 신호 판독(미디어 및 바이러스만) - 기준신호 판독(미디어 및 바이러스만) x 100] = % 경전 억제¹³.
3. 6.2의 수식을 사용하여 모든 샘플에 대해 각 희석의 모든 복제에서 % 변환 억제를 계산합니다. 모든 샘플 및 컨트롤에 대한 각 희석에 대한 기술적 복제 사이의 평균 변환 억제를 결정합니다.
4. hPLAP 활성의 50% 이상의 트랜스듀션 억제를 산출하는 시료의 가장 낮은 희석을 결정하여 관심 있는 시료의 50% 트랜스유도 억제 티터(_TI50 titer)를 계산한다. 예를 들어, 시료의 1/8 희석이 6.2(및 1/4 희석하지 않음)에서 수행된 계산에 기초하여 50% 이상의 변환 억제를 가지는 경우 _TI50 티터를 1/8로 보고합니다.

7. 중화 된 AAV 입자의 측정

1. 다음 공식을 사용하여 지정된 샘플에 대한 μL 당 중화 된 AAV 입자수를 계산합니다.
   ((MOI x 셀 카운트/웰) / (_TI50 티터의 혈청/희석계수)) / 2 = 중화 AAV 입자/혈청⁹의 μL.
   참고: 중화 입자의 50%를 측정하는 _TI50을 2로 나누면 됩니다. _TI50 티터를 1/4(25% 혈청)의 시료의 경우, 75% 희석제) 분석이 1 x ¹⁰⁴ 세포에 도금된 15k의 80 μL 및 15k의 MOI를 사용한 경우, 다음과 같은 계산이 사용될 것이다: ((15000 x 10000) / (80/4)) / 2 = 3.75x106 중화 μL/μL 입자.

결과

플레이트 커버리지를 위한 최적의 바이러스 성 복용량을 확립 하는 Trans유도 분석
HT1080 세포, 잘 확립 된 섬유 육종 세포주, 이 분석에 대 한 선택 되었다. 1 x ¹⁰⁴ HT1080 셀/웰의 농도는 96웰 플레이트의 각 웰에 ~50%의 세포 결합을 제공한다. 분석에 대한 최적의 바이러스 농도를 결정하기 위해, hPLAP(인간 태반 알칼리인포스파사제) 기자 유전자(AAV6-hPLAP)³¹은 세?...

토론

이 보고서는 체외 바이러스 성 트랜스듀션의 정도에 해당하는 염색체 반응을 평가하여 주어진 혈청 샘플에서 AAV 중화의 정도를 평가하는 색법 분석법을 설명합니다. 프로토콜의 개발은 면역 조직화학과 같은 응용 분야에서 단백질 표적의 검출을 위한 스테닝 도구로 널리 활용되고 있는 효소 알칼리인인포스파아제와 NBT/BCIP 사이의 공지된 염색체 반응에 기초하여, 바이러스 성 전도를 평가...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin/EDTA	Gibco	25300-054
50 mL conical centrifuge tube	Falcon	14-432-22	Or equivalent
75 cm2 square flasks	Falcon	353136	Or equivalent
96 well flat bottomed plate	Falcon	353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector			Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.
Aluminium foil
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6)	PROGEN	610159	Positive control monoclonal antibody
BCIP/NBT	SIGMAFAST	B5655
Cell and tissue culture safety cabinet
Electronic Pipette			5 & 10 mL stripette inserts
Fetal Bovine Serum	Gibco	10099-141
Haemocytometer
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965118
HT1080 cells	ATCC
ImageJ Software			Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator			37 °C, 5% CO2
Light microscope with camera			Capable of taking photos with a 4x objective lens
Oven			For a 65 °C incubation
Paraformaldehyde	MERCK	30525-89-4
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122
Phosphate buffered saline
Pipettes and tips			20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette
Stericup quick release filter	Millipore	S2GPU10RE	Used for combining media reagents
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator	Greiner BIO-ONE	455071	Used for serum collection & processing from sheep
Water bath