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요약

본 프로토콜은 7일령 신생아 마우스에서 좌심실 형태, 기능, 및 관상동맥 혈류의 심초음파학적 평가를 기술한다.

초록

심 초음파는 심혈관 질환의 동물 모델에서 구조적 및 기능적 매개 변수를 평가할 수있는 비 침습적 절차이며 전임상 연구에서 잠재적 인 치료의 영향을 평가하는 데 사용됩니다. 심 초음파 연구는 일반적으로 젊은 성인 마우스 (즉, 4-6 주령)에서 수행됩니다. 초기 신생아 심혈관 기능의 평가는 일반적으로 마우스 새끼의 크기가 작고 관련 기술적 어려움으로 인해 수행되지 않습니다. 가장 중요한 문제 중 하나는 새끼의 팔다리의 길이가 짧기 때문에 심 초음파 플랫폼의 전극에 도달하지 못한다는 것입니다. 강아지는 온도 변화에 매우 민감하기 때문에 체온은 또 다른 문제입니다. 따라서 연구자가 초기 병리학 적 변화를 감지하고 시간이 지남에 따라 심혈관 질환의 진행을 연구 할 수 있도록 작은 마우스 새끼에서 심 초음파 연구를 수행하기위한 실용적인 가이드를 수립하는 것이 중요합니다. 현재 연구는 생후 7 일의 어린 나이에 마우스 새끼에서 심 초음파를 수행하는 프로토콜을 설명합니다. 신생아 마우스에서 심장 형태, 기능 및 관상 동맥 흐름의 심 초음파 특성화가 또한 설명된다.

서문

이 프로토콜의 전반적인 목표는 심 초음파를 사용하여 7 일 된 신생아 마우스 새끼의 심장 형태, 기능 및 관상 동맥 흐름을 검사하는 것입니다. 이 기술의 개발의 근거는 심장 질환1의 마우스 모델에서 관상 동맥 흐름 및 심장 기능의 초기 변화를 결정하는 것입니다. 심 초음파의 비 침습적 특성은 연구자가 생리적 조건에서 심혈관 기능을 평가할 수 있고 연구자에게 심혈관 질환 치료를위한 표적 요법 연구를위한 스크리닝 도구를 제공하기 때문에 유리합니다 2,3. 전통적으로 심 초음파 연구는 젊은 성인 마우스 (4-6 주)로 수행됩니다. 그러나 일부 마우스 모델 (즉, 유전자 변형 모델)은 이미이 나이에 병리학 적 변화 및 심장 기능 장애를 나타냅니다. 따라서, 동물 모델을 이용한 심장 연구는 주로 심장 기능장애를 개선하거나 치료하는 치료제에 초점을 맞추고 있다. 대조적으로, 최근에는 연구 노력이 심장 질환의 예방 조치 및 조기 개입에 초점을 맞추도록 방향을 바꿨습니다4.

이전 연구에서는 신생아 마우스의 심근 경색 모델에서 심장 기능을 측정하기 위해 심 초음파를 사용하는 것에 대해 설명했습니다 5,6; 그러나 이러한 연구는 관상 동맥 흐름을 측정하지 못했고, 가장 중요한 것은 시술 중 심전도 (ECG) 및 심박수 (HR) 데이터를 기록하지 못했는데, 이는 전극 패드에 도달 할 수없는 새끼 팔다리의 크기가 작기 때문일 가능성이 큽니다. 우리는 이 프로토콜에서 알루미늄 호일을 팔다리에 부착하여 전극 패드에 도달하고 ECG 회로를 생성할 수 있도록 함으로써 이 문제를 극복합니다. 또한, 이 프로토콜은 신생아 마우스의 관상동맥 흐름을 설명하고 특성화한다.

이 연구는 구조적 및 기능적 매개 변수 2,3을 측정하기 위해 흉골 장축 및 단축보기에서 B 모드 및 M 모드 이미지를 얻었습니다. 형태학적 매개변수에는 좌심방 치수, 좌심실(LV) 치수, LV 벽 두께, LV 질량 및 상대 벽 두께(RWT)가 포함되었습니다. 기능적 매개 변수에는 박출률 (EF), 분수 단축 (FS), 심 박출량 (CO) 및 원주 섬유 단축 속도 (Vcf)가 포함되었습니다. 맥파 (PW) 도플러는 흉골 단축 (PSAX)보기에서 대동맥 흐름을 측정하고 정점 4 챔버보기에서 승모판 혈류를 측정하는 데 사용되었습니다. 정점 4 챔버보기는 또한 승모판 고리의 중격 부분에서 조직 도플러를 수행하는 데 사용되었습니다. 좌측 전방 하행 (LAD) 관상 동맥에서의 관상 동맥 흐름은 또한 변형 된 흉골 장축 (PLAX) 뷰를 사용하여 검사되었다. 관상 동맥 유동 예비력 (CFR)은 증가 된 이소 플루 란 농도에 의해 유도 된 스트레스 도전 후에 계산되었다.

본 프로토콜은 심 초음파 연구가 신생아 마우스에서 매우 어린 나이에 수행 될 수 있음을 입증하여 심장 병리의 조기 인식 및 다른 마우스 모델에서 LV 혈류 역학 및 관상 동맥 유동 매개 변수의 종단 추적 연구를 허용합니다. 이 기술은 출생 후 초기 연령의 심장 기능에 대한 유전 적 변화 또는 약리학 적 개입의 역할을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한이 프로토콜은 심장 질환의 발병 초기를 결정하는 데 유용한 도구를 제공하므로 연구자는 다양한 마우스 모델에서 심장 질환의 초기 단계의 기초가되는 분자 메커니즘을 풀 수 있습니다.

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프로토콜

모든 실험은 시카고 일리노이 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 실험을 위해, 7일령의 FVB/N 마우스를 사용하였다. 프로토콜은 마우스 준비, 심 초음파 이미지 획득 및 이미징 후 동물 관리로 나뉩니다.

1. 마우스 준비

  1. 번식 케이지에서 7 일 된 마우스를 얻으십시오.
    참고 :이 어린 나이에 신체 검사로 동물의 성별을 결정하는 것은 어렵습니다.
  2. ECG 젤( 재료 표 참조)을 예열된 플랫폼 전극 패드에 놓습니다. 전극 패드 위에 알루미늄 호일 스트립(~1.5인치 x 0.25인치)을 놓아 전극 범위를 확장하고 테이프로 고정합니다(그림 1A). 그런 다음 ECG 젤을 알루미늄 호일 스트립 위에 놓습니다.
    알림: 알루미늄 호일 스트립 아래의 젤이 절차 중에 마르지 않도록하십시오. 그런 일이 발생하면 전도성을 유지하기 위해 젤을 더 첨가하십시오.
  3. 니트릴 장갑에서 손가락을 잘라내어 한쪽의 이소플루란/산소 노즈 콘과 다른 쪽의 마우스 코를 모두 덮도록 맞춥니다(그림 1B).
  4. 마우스 강아지를 이소플루란 유도 챔버에 넣고 2.5% 산소에 의해 구동되는 100% 농도에서 이소플루란 전달을 시작합니다(그림 1C).
  5. 마취된 강아지를 알루미늄 호일 패드 위에 발을 얹고 이미징 플랫폼의 앙와위 위치에 놓고 테이프로 고정합니다. 전기 회로가 완전하고 ECG가 기록되고 있는지 확인하십시오.
  6. 이소플루란 전달을 100% 산소에 의해 구동되는 1.5%로 줄입니다. 테이프로 강아지의 코 주위의 장갑에서 잘라낸 손가락을 고정합니다. 강아지의 발을 꼬집어 마취 깊이를 확인하십시오.
  7. 강아지의 상체 위에 예열 된 초음파 젤의 두꺼운 층을 놓습니다. 두 개의 거즈 롤을 사용하여 초음파 젤을 제자리에 유지합니다(그림 1D).
  8. 가열 램프를 사용하여 강아지의 정상 체온을 유지하십시오 (그림 1E).
    알림: 직장 프로브는 강아지의 크기가 작기 때문에 현재 연구에서 체온을 모니터링하는 데 사용되지 않았습니다.

2. 심 초음파 영상 획득 및 분석

  1. 성인 마우스 심 초음파 프로토콜 7,8,9에 따라 B 모드의 경우 40MHz, 도플러의 경우 32MHz (프레임 속도 233) (재료 표 참조)의 선형 어레이 변환기가 장착 된 심 초음파 기기를 사용하여 경 흉부 심 초음파를 수행합니다.
  2. 심 초음파 이미지 획득 중에 에코 변환기를 배치 할 때 강아지의 흉강에 과도한 압력을 가하지 마십시오.
    알림: 강아지의 크기가 작기 때문에 변환기 자체의 무게로 인해 심장 기능이 변경되거나 사망 할 수 있습니다.
  3. 좌심실 유출관과 좌심방의 PLAX 보기를 캡처합니다.
    1. 변환기를 홀더에 놓고 인덱스 표시가 강아지의 오른쪽 어깨를 향하도록 합니다.
    2. 트랜스듀서가 젤과 접촉할 때까지 트랜스듀서를 내리고 B-모드에서 좌심실 유출로를 시각화합니다(그림 2A).
    3. 대동맥 전단지에서 M 모드를 사용하여 수축기 말단에서 좌심방(LA) 최대 직경을 측정합니다(그림 2B, 표 1). 씨네 스토어 버튼을 눌러 데이터를 기록합니다.
  4. 좌심실의 PSAX 보기를 캡처하여 챔버 치수, 벽 두께, 대동맥 흐름 및 폐 흐름을 측정합니다.
    1. 변환기를 PLAX의 시계 방향으로 ~90° 회전하여 PSAX 보기를 얻습니다.
    2. 프로브를 유두 근육 수준에 놓고 M 모드를 사용하여 수축기 및 이완기 동안 좌심실 내경(LVID), 심실 중격 두께(IVS) 및 PW를 측정합니다(그림 3A, 표 1). 씨네 스토어 버튼을 눌러 데이터를 기록합니다.
    3. 다음과 같이 이완기 챔버 치수를 사용하여 비대 지수인 RWT를 계산합니다. 3,10:
      (이완기 말기의 PW + IVS) / (이완기 말기의 LVID)
    4. 변환기를 심장 기저부쪽으로 이동하고 컬러 도플러를 사용하여 폐동맥을 시각화합니다. PW 도플러를 눌러 폐 피크 유속, 폐 유량 프로파일, 폐 박출 시간(PET) 및 폐 가속 시간(PAT)11,12를 정량화합니다(그림 3B). 씨네 스토어 버튼을 눌러 데이터를 기록합니다.
    5. 변환기를 베이스쪽으로 더 이동하고 컬러 도플러를 사용하여 대동맥 흐름을 시각화합니다(그림 3C). PW 도플러를 사용하여 혈류를 시각화하고 대동맥 박출 시간(AET)을 측정합니다. 씨네 스토어 버튼을 눌러 데이터를 기록합니다.
    6. LVID 이완기 말기(LVIDd), LVID 수축기(LVID) 및 AET를 사용하여 심근 성능 지표인 Vcf(circ/sec)13,14를 다음과 같이 계산합니다(표 1).
      (LVIDd - LVIDs) / (LVIDd x AET)
  5. 정점 4 챔버보기를 캡처하십시오.
    1. 플랫폼을 Trendelenburg 위치에 놓고 왼쪽으로 기울인 다음 프로브를 조정하여 4개의 챔버를 시각화합니다(그림 4A).
    2. 컬러 도플러를 사용하여 혈류를 시각화하고 승모판 오리피스 중앙의 승모판 소엽 끝에있는 PW 도플러를 사용하여 승모판 흐름을 기록합니다. 씨네 스토어 를 눌러 데이터를 기록합니다.
    3. 이 보기에서 다음 매개변수 2,3,10을 계산합니다(그림 4B 및 표 1).
      1. 이완기 초기(E)의 최대 혈류 속도인 E/A 비율을 이완기 후기(A)의 최대 혈류 속도에 대해 계산합니다.
      2. 피크 E에서 초기 이완기 종료까지의 시간인 E 파 감속 시간(DT)을 결정합니다.
      3. 대동맥 판막 폐쇄에서 승모판 막 개방까지의 시간인 LV 등부피량 이완 시간(IVRT)을 계산합니다.
      4. 승모판 폐쇄에서 대동맥 판막 개방까지의 시간인 LV 등부피 수축 시간(IVCT)을 계산합니다.
    4. 4개의 챔버 보기에서 승모판 고리의 중격 쪽에 있는 조직 도플러를 사용하여 초기 이완기 충전(e') 및 후기 이완기 충전(a')의 최대 심근 이완 속도와 최대 수축기 심근 수축 속도(s')를 측정합니다(그림 4C 및 표 1). 씨네 스토어 버튼을 눌러 데이터를 기록합니다.
  6. 수정된 PLAX 보기를 캡처하여 왼쪽 전방 하행 관상동맥을 검사합니다.
    1. 변형된 PLAX 보기(15)를 사용하여, 트랜스듀서를 측면으로 이동시키고 빔을 전방으로 기울인다(도 5A).
    2. 프로브를 이동하고 컬러 도플러를 사용하여 대동맥에서 생성되는 왼쪽 주 관상 동맥 (LCA)의 기원을 시각화합니다. LCA로부터 생성되고 좌심실 전벽과 우심실 유출로 사이를 달리는 LAD 동맥을 확인한다16,17. 이 위치에서 PW 도플러를 적용하여 LAD 흐름을 측정합니다(그림 5B). 씨네 스토어 버튼을 눌러 데이터를 기록합니다.
    3. 다음 LAD 관상 동맥 흐름 매개 변수를 계산하십시오 (그림 5C 및 표 2) : 피크 관상 동맥 유속 (CFV), 평균 CFV 및 속도-시간 적분 (VTI).
      참고: 이러한 모든 매개변수는 1.5%(기준선)의 기저 이소플루란 농도에서 측정됩니다.
    4. 이소플루란 농도를 2.5%로 높이고 최대 유량을 얻을 때까지 5분 동안 기다립니다(그림 5C). 씨네 스토어 버튼을 눌러 데이터를 기록합니다. CFR을 기준선18,19,20에서 이완기 피크 CFV에 대한 최대 흐름에서의 이완기 피크 CFV의 비율로 계산합니다(표 2).
      CFR = 이완기 피크 CFV (2.5%) / 이완기 피크 CFV (1.5%)

3. 사후 동물 모니터링 및 관리

  1. 심 초음파 영상을 완료 한 후 강아지를 조심스럽게 청소하고 약 2 분 동안 마취에서 회복되도록합니다.
  2. 강아지를 새장으로 돌려 보내기 전에 거부 또는 식인을 방지하기 위해 새장 어머니의 침구로 강아지를 칠하십시오.
  3. 시술 후 약 30 분 동안 어머니의 행동을 관찰하십시오. 공격적인 행동이 관찰되면 동물 절차 지침에 따라 강아지를 안락사시킵니다.

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결과

이 연구는 7 일 된 마우스 새끼를 사용하여 심장 형태, 기능 및 관상 동맥 흐름을 특성화했습니다. 마우스 취급은 주의해서 수행해야 하며 마우스 플랫폼은 그림 1에 설명된 대로 작은 크기의 새끼에 맞게 조정되어야 합니다. PLAX 보기의 대표 이미지는 그림 2A 및 보충 비디오 1에 나와 있습니다. 이 보기에서, M-모드는 좌심방(LA) 직경을 측정?...

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토론

예방 의학 시대에는 질병의 발병을 확립하고 적절한 중재 요법을 설계하기 위해 심혈관 기능의 변화에 대한 조기 평가가 필요합니다. 마우스는 심장 연구에서 전임상 모델로 점점 더 많이 사용되고 있으며, 심 초음파 연구는 일반적으로 젊은 성인 마우스로 수행됩니다. 그러나 심장 질환의 초기 단계에서 유전 적 변화 또는 약리학 적 개입의 역할을 연구하려면 심 초음파 영상을 조기에 시작해야?...

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공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

저자는 이 원고를 편집해 준 Chad M. Warren, MS(시카고 일리노이 대학교)에게 감사를 표합니다. 이 연구는 PCR에 대한 NIH/NHLBI K01HL155241 및 AHA CDA849387 보조금의 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Depilating agentNair Hair Remover
Electrode gelParker Laboratories15-60
High Frequency UltrasoundFUJIFILM VisualSonics, Inc.Vevo 2100
IsofluraneMedVetRXISO-250
Linear array high frequency transducerFUJIFILM VisualSonics, Inc.MS550D
Mice breeding pairCharles River LaboratoriesFVB/NStrain Code 207
Ultrasound GelParker Laboratories11-08
Vevo Lab SoftwareFUJIFILM VisualSonics, Inc.Verison 5.5.1

참고문헌

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