다중 모드 비선형 광학 현미경을 사용한 나노 입자의 세포 흡수의 생체 분자 이미징

요약

이 기사에서는 스펙트럼 초점 모듈과 이중 출력 펄스 레이저의 통합을 제시하여 금 나노 입자와 암세포의 신속한 초분광 이미징을 가능하게 합니다. 이 작업은 표준 레이저 스캐닝 현미경에서 다중 모드 비선형 광학 기술의 세부 사항을 시연하는 것을 목표로 합니다.

초록

살아있는 시스템에서 금 나노 입자 (AuNP)를 조사하는 것은 AuNP와 생물학적 조직 간의 상호 작용을 밝히는 데 필수적입니다. 또한 자극 라만 산란(SRS), 2광자 여기 형광(TPEF) 및 과도 흡수(TA)와 같은 비선형 광 신호를 이미징 플랫폼에 통합하여 세포 구조 및 AuNP의 생체 분자 대비를 다중 모드 방식으로 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 다중 모드 비선형 광학 현미경을 제시하고 이를 적용하여 암세포에서 AuNP의 화학적으로 특이적인 이미징을 수행합니다. 이 이미징 플랫폼은 보다 효율적인 기능화된 AuNP를 개발하고 종양, 세포 주위 또는 세포 공간을 둘러싼 혈관 구조 내에 있는지 여부를 결정하기 위한 새로운 접근 방식을 제공합니다.

서문

금 나노입자(AuNP)는 다양한 생물의학 응용 분야에서 효과적인 표면 강화 라만 분광법(SERS) 기질과 같은 생체 적합성 이미징 프로브로서 큰 잠재력을 보여주었습니다. 주요 응용 분야에는 바이오 센싱, 바이오 이미징, 표면 강화 분광법 및 암 치료를위한 광열 요법과 같은 분야가 포함됩니다¹. 또한 살아있는 시스템에서 AuNP를 탐색하는 것은 AuNP와 생물학적 시스템 간의 상호 작용을 평가하고 이해하는 데 중요합니다. 조직에서 AuNP의 분포를 조사하는 데 성공적으로 사용된 푸리에 변환 적외선(FTIR) 분광법2, 레이저 절제 유도 결합 질량^분석법(LA-ICP-MS⁾³ 및 자기 공명 영상(MRI)⁴을 포함한 다양한 분석 기술이 있습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 방법은 시간이 많이 걸리고 복잡한 샘플 준비³, 긴 획득 시간 요구 또는 서브 미크론 공간 분해능 ^2,4의 부족과 같은 몇 가지 단점이 있습니다.

기존의 이미징 기술과 비교하여 비선형 광학 현미경은 살아있는 세포 및 AuNP를 프로빙하는 데 몇 가지 이점을 제공합니다. 비선형 광학 현미경은 더 깊은 이미징 깊이를 달성하고 근적외선 초고속 레이저를 사용하여 본질적인 3D 광학 절단 기능을 제공합니다. 이미징 속도와 검출 감도가 크게 향상됨에 따라 2광자 여기 형광(TPEF)^5,6,7 및 2차 고조파 생성(SHG)8,9,10 현미경이 살아있는 세포 및 조직에서 내인성 생체 분자의 비침습적 이미징을 더욱 개선하는 것으로 입증되었습니다. 또한 과도 흡수(TA)^11,12,13,14 및 자극 라만 산란(SRS)^15,16,17,18과 같은 새로운 펌프-프로브 비선형 광학 기술을 활용하여 세포 구조 및 AuNP의 표지 없는 생화학적 대비를 도출할 수 있습니다. 외부 라벨을 사용하지 않고 AuNP를 시각화하는 것은 나노 입자의 화학적 섭동이 물리적 특성을 수정하여 세포에서 흡수되기 때문에 매우 중요합니다.

이 프로토콜은 이중 파장 펄스 레이저를 위한 스펙트럼 포커싱 타이밍 및 재결합 장치(SF-TRU) 모듈의 구현을 제공하여 AuNP 및 암세포의 빠른 다중 모드 이미징을 가능하게 합니다. 이 작업은 레이저 스캐닝 현미경에서 통합 TPEF, TA 및 SRS 기술의 세부 사항을 시연하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

1. 레이저 시스템 켜기

1. 시스템을 시작하기 전에 인터록 시스템을 켜고 암 레이저를 선택하십시오.
2. 소프트웨어로 PC를 켜서 듀얼 출력 펨토초 레이저를 제어합니다.
3. 듀얼 출력 펨토초 레이저용 소프트웨어를 로드합니다. 이 소프트웨어를 사용하면 레이저의 전원을 켜고 끌 수 있으며 펌프 빔의 파장을 직접 제어할 수 있습니다.
4. 전원 아이콘을 길게 눌러 레이저 방출을 3으로 카운트합니다.
5. 레이저가 예열되고 소프트웨어에서 레이저 준비 표시등이 녹색으로 켜질 때까지 기다리십시오.
6. 펌프 빔의 파장은 소프트웨어를 통해 직접 제어됩니다. 이것은 680-1,300 nm의 범위 일 수 있습니다. C-H 라만 진동 영역의 세포 이미징의 경우 802nm를 선택합니다.
7. 조리개 이미지를 3초 동안 눌러 조정 가능한 펌프 빔과 1,045nm Stokes 빔의 셔터를 엽니다.
   주의 : 레이저 안전 안내 이중 출력 펨토초 레이저는 클래스 IV 적외선 펄스 레이저이며 시력에 영구적 인 손상을 줄 수 있습니다. 따라서이 절차를 수행하는 동안 모든 레이저 안전 현지 규칙을 따라야합니다 : (i) 레이저 안전 교육을받은 승인 된 사용자 만 절차를 수행 할 수 있습니다. (ii) 실험실 입장은 방 문에 인터록이 있는 스와이프 카드 액세스를 통해 이루어집니다. (iii) 대부분의 작업에서 레이저 빔은 완전히 밀폐되어 있습니다. (iv) 레이저 빔이 노출되면 레이저 안전 고글을 착용해야합니다 (펌프와 Stokes 빔 모두에 OD 9 + 차단을 제공하는 LG7 레이저 안전 고글 사용).

2. 스펙트럼 포커싱 타이밍 및 재결합 장치(SF-TRU) 켜기

1. SF-TRU 장치의 지연 단계와 레이저 감쇠기를 제어하는 레이저 소프트웨어를 사용하여 동일한 PC에 ATM 소프트웨어를 로드합니다.
   알림: 이 장치는 펌프와 Stokes 빔이 공간적으로 겹쳐져 있는지 확인하고, 펌프와 Stokes 빔의 분산을 제어하고, 펌프와 Stokes 빔 사이의 시간 지연을 제어합니다. 펌프와 Stokes 빔의 분극은 수직입니다. 각 빔에는 SF-TRU를 종료하기 전에 편광을 독립적으로 제어하기 위해 반파 플레이트가 장착되어 있습니다.
2. 펌프와 Stokes 레이저가 모두 <10%(펌프) 및 <15%(Stokes 빔)로 감쇠되었는지 확인합니다. 빔이 감쇠되지 않으면 레이저 출력이 시스템을 손상시키고 생물학적 샘플을 태울 수 있습니다.
3. 셀룰러 이미징의 경우 최적의 레이저 설정을 샘플에서 12mW 및 30mW에 해당하는 6%(펌프) 및 10%(Stokes)로 설정합니다.
4. SF-TRU에는 펨토초(fs) 모드와 피코초(ps) 모드의 두 가지 설정이 있습니다.
5. fs 모드의 경우 상자 양쪽에 있는 노브를 누릅니다(이렇게 하면 빔 경로에서 분산 격자가 제거됩니다).
6. ps 모드의 경우 상자 양쪽에 있는 손잡이를 당겨 빼냅니다(이렇게 하면 분산 격자가 빔 경로에 배치됩니다).
7. 초분광 이미징의 경우 ps 모드를 선택합니다.
8. 지연 단계가 펌프와 Stokes 빔이 이 시스템의 CH 이미징을 위해 일시적으로 겹칠 수 있는 올바른 위치에 있는지 확인하십시오.
9. 펌프와 Stokes 빔의 분산 설정이 올바른지 확인하십시오. 802nm 펌프의 경우 펌프 빔의 경우 5mm이고 Stokes 빔의 경우 30mm입니다.

3. SRS 이미징을 위한 스톡스 빔 변조

1. SRS 감지의 경우 스톡스 빔의 강도를 변조합니다.
2. 빔 변조를 위해 신호 발생기를 켭니다.
3. 다음과 같은 이전 설정을 불러옵니다.
   출력 1: 구형파: 주파수 = 19.5MHz, 진폭 = 1.4V.
   출력 2: 구형파: 주파수 = 19.5MHz, 진폭 = 300mV.
4. 출력 1과 2를 켭니다.
5. BNC 케이블을 통해 출력 1을 SF-TRU 박스의 EOM용 앰프에 연결합니다.
6. BNC 케이블을 통해 SRS 감지에 사용되는 잠금 증폭기에 출력 2를 연결합니다.
7. 갠트리의 앰프에 대한 전원 공급 장치를 켭니다.

4. 잠금 증폭기 켜기

1. SRS 이미징의 경우 대면적 광 다이오드와 특수 제작된 잠금 증폭기로 구성된 SRS 감지 모듈을 사용하십시오.
2. 갠트리의 잠금 증폭기에 대한 전원 공급 장치를 켭니다.
3. PC에 잠금 증폭기 "SRS 감지 모듈"용 소프트웨어를 로드합니다.
4. 소프트웨어에서 위상 = 0°, 오프셋 = -80mW, 게인 = 58dB 설정을 선택합니다.
5. 소프트웨어에서 록인 증폭기 통합 시정수를 선택하십시오: 세포 이미징의 경우 2μs의 시간 상수는 우수한 품질의 이미지를 제공합니다.

5. 레이저 스캐닝 현미경으로 작동

1. 리모컨 상자를 제외한 모든 장비의 플러그를 뽑습니다. 갠트리 상단에있는 컨트롤 박스에서 대기가 켜질 때까지 기다리십시오.
2. 갠트리의 리모컨 상자를 켜고 상자 뒷면의 스위치를 켭니다. 리모컨 표시등이 파란색으로 바뀔 때까지 기다렸다가(컨트롤 박스에서) 작업 시작을 누릅니다.
3. 레이저 스캐닝 현미경의 PC를 켭니다.
4. 컨포칼 현미경 소프트웨어를 실행합니다.
5. 컴퓨터 소프트웨어를 통해 현미경의 광 경로를 확인하십시오.
   참고: SRS 이미징에 적합하도록 현미경을 일부 수정했습니다: (i) 빔 경로에서 레이저 빔이 스캔 장치로 들어가는 필터 휠에 775nm 쇼트 패스가 추가되었으며, 이는 컴퓨터 소프트웨어의 Lightpath 탭에서 선택할 수 있습니다. (ii) 검출을 위해 컨포칼 현미경의 내장 PMT를 사용하는 대신 투과광 경로에 맞춤형 검출기가 추가되어 SRS 및 CARS 검출이 모두 가능합니다. (iii) 이러한 감지기의 출력은 갠트리의 아날로그 상자에 연결됩니다. PMT의 CARS 신호는 BNC 케이블을 통해 CD1에 연결되고 잠금 증폭기의 SRS 신호는 BNC 케이블을 통해 CD2에 연결됩니다.
6. 터치 스크린이나 리모컨 노브 또는 컴퓨터 소프트웨어를 통해 초점을 제어합니다.
7. 소프트웨어에서 원하는 이미지 설정을 선택하십시오. 여기에는 확대/축소, 픽셀 단위의 이미지 크기 및 픽셀 체류 시간이 포함됩니다.
8. 이미징 속도(픽셀 체류 시간)가 잠금 증폭기 소프트웨어에 설정된 통합 시간보다 큰지 확인합니다.
   참고: NA 1.2 수침 대물렌즈가 이미징에 사용되었습니다.

6. 현미경 스테이지에 샘플 장착

1. 다음과 같이 이미징을 위해 세포 샘플을 준비합니다.
   1. 배양 4T1 마우스 유방암 세포 RPMI-1640에 10% 태아 소 혈청(FBS)이 보충되었습니다. 2 일마다 배지를 교체하고 70 % -80 % 합류로 세포를 계대합니다.
      참고 : 구절 8-10은 여기에 설명 된 실험 과정 전반에 걸쳐 사용되었습니다.
   2. 이미징 실험을 위해, 37°C, 5%_CO2에서 24시간 동안 정사각형 커버슬립 상에서 1 x 10⁵ 세포를 배양한다. 그런 다음 예열된 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척하고 금 나노입자(세포 배양 배지에서 1:100 희석, 스톡 농도: 2.3 x 10^{10 입자}/mL, 직경: 60nm)와 함께 4시간 동안 배양합니다.
   3. 이미징하기 전에 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척하고 실온(RT)에서 15분 동안 PBS의 4% 파라포름알데히드로 고정합니다. PBS 3x로 세포를 세척한 다음 이미징을 위해 두 개의 커버슬립 사이에 장착합니다.
2. 대물렌즈와 샘플 사이의 샘플에 레이저 빔을 집중시키는 물 침지 대물렌즈 위에 증류수 방울을 놓습니다. 그런 다음 샘플을 현미경 스테이지에 놓습니다.
3. NA 1.4의 콘덴서는 순방향 전파 된 빛을 수집합니다. 이미징을 위해 응축기와 샘플 사이에 물방울을 바르십시오. 콘덴서의 높이를 샘플 위 약 1mm로 조정하여 최대량의 빛을 수집합니다.
4. SRS 검출기는 이동식 마운트에 있어 수집 광학 경로에서 밀어 넣고 뺄 수 있습니다. 백색광을 사용하여 샘플에 초점을 맞추려면 SRS 검출기를 빔 경로 밖으로 이동하십시오.
5. 감지기를 빔 경로에 다시 배치하여 SRS 이미징을 준비합니다.

7. 라만 시프트 변경 및 하이퍼스펙트럼 데이터 스택 수집

알림: 이미징이 발생하는 라만 시프트는 SF-TRU 상자의 지연 단계 위치와 레이저 시스템의 펌프 빔 파장에 따라 달라집니다.

1. 라만 시프트가 크게 변경되면 레이저 파장을 변경하십시오. 예를 들어, 2,800–3,100 cm-1 사이의 CH 진동을 이미징하려면 802nm를 선택하고, 아미드 I 피크에 대해 약 1,600cm-1을 이미징하려면 898nm에서 펌프 빔을 선택합니다. 소프트웨어를 통해 조정하십시오.
2. 라만 시프트를 약간 조정하려면 SF-TRU 장치의 지연 단계를 스캔합니다.
3. SF-TRU는 밀리미터(mm) 단위의 지연 스테이지 위치를 제공합니다. 지연 단계 위치를 mm에서 ^cm-1로 변환하려면 폴리스티렌 비드 샘플을 사용하여 보정 하이퍼 스펙트럼 스캔을 수행하고 보정 스캔에서 찾은 피크 위치를 자발적인 라만 설정에서 수행 한 피크 위치와 비교합니다. 이것은 mm 단위의 지연 단계 위치를 ^cm-1의 라만 시프트로 변환하는 선형 방정식을 제공합니다.
4. 초분광 스캔을 생성하려면 서로 다른 지연 단계 위치에서 영상의 시계열을 가져옵니다.
5. 이미지 획득과 지연 스테이지의 이동을 동기화하려면 아날로그 장치를 사용하여 SF-TRU 시스템과 TTL 신호를 송수신합니다.
   참고: 이를 위해 아날로그 박스에는 다음과 같은 연결이 있습니다: (i) TRIG OUT VD1—BNC를 통해 SF-TRU에 연결되고 TTL 신호를 보내 지연 단계에 +1 증분으로 이동하도록 지시합니다. (ii) TRIG In 1 - 여기서 지연 단계가 이동을 완료하면 BNC를 통해 신호가 수신되며, 이는 시계열의 다음 이미지를 트리거하는 데 사용됩니다.
6. 하이퍼스펙트럼 데이터 세트의 경우 컨포칼 현미경 소프트웨어에서 다음 설정을 선택합니다.
   1. 트리거 탭에서 TTL 트리거로 시작(ON) 및 트리거(모든 프레임)를 선택합니다.
   2. 계열 탭에서 시계열 ON과 z 계열 OFF를 설정합니다.
   3. ATM 소프트웨어의 단계 수와 일치하도록 시계열의 프레임 수를 설정합니다(여기서는 101단계 사용).
7. ATM 소프트웨어에서 실행 탭으로 이동합니다.
   1. 초분광 스캔의 시작 및 중지에 대한 지연 단계 위치를 밀리미터 단위로 설정합니다. CH 높은 파수 영역의 경우 시작 위치 = 90.25mm, 정지 위치 = 92.25mm를 사용합니다.
   2. 단계 수가 컨포칼 현미경 소프트웨어의 프레임 수와 일치하는지 확인합니다.
8. 올바른 설정을 확인한 후 먼저 컨포칼 현미경 소프트웨어에서 하이퍼스펙트럼 스택을 시작합니다. 획득 으로 이동하여 스캔 시작을 클릭하십시오. 그런 다음 ATM 소프트웨어에서 시작을 클릭합니다. 이렇게 하면 일련의 이미지 수집이 시작되고 선택한 시작 위치와 중지 위치 사이의 지연 단계 위치가 점진적으로 증가합니다.
9. 하이퍼스펙트럼 이미지 시리즈를 멀티프레임 .tif 파일로 내보내고 적절한 소프트웨어 패키지를 사용하여 보정을 수행합니다.
10. 교정이 완료되면 선형 교정 방정식을 사용하여 지연 스테이지 위치를 라만 시프트로 변환합니다.
11. CH 진동 영역(2,800–3,100 ^cm-1)에서 아미드 I 진동 영역 1,500–1,700 ^cm-1)로의 이미징 간에 전환하려면 다음을 수행하십시오.
    1. 레이저 소프트웨어의 펌프 파장을 802nm에서 898nm로 변경합니다.
    2. ATM 소프트웨어의 스톡스 분산 설정을 30mm에서 5mm로 변경합니다.
    3. SF-TRU 박스 내부의 펌프 빔 분산 경로에서 미러를 약간 조정합니다. 이것은 미러 마운트의 하단 손잡이를 조정하여 이루어지며, 이는 미러 각도를 점진적으로 변경합니다.
    4. amide I 영역에서 초분광 스캔을 수행할 때 ATM 소프트웨어의 시작 및 중지 위치를 각각 89mm 및 91mm로 설정합니다.
       주의 : 레이저 빔이 노출되므로 이 단계에서는 레이저 안전 고글을 착용해야 합니다.

결과

스펙트럼 포커싱 타이밍 및 재결합 장치(SF-TRU) 모듈은 이중 출력 펨토초 레이저와 수정된 레이저 스캐닝 현미경 사이에 도입되었습니다. 이 연구에 사용 된 조정 가능한 초고속 레이저 시스템에는 고정 된 1,045 nm 파장에서 하나의 빔을 전달하는 두 개의 출력 포트가 있고 다른 빔은 680-1,300 nm 범위에서 조정 가능합니다. SF-TRU 모듈과 멀티모달 이미징 플랫폼의 자세한 개략도는 그림 ...

토론

이 연구는 SF-TRU 모듈과 초고속 이중 출력 레이저 시스템의 조합이 다중 모드 미세 분광법에 대한 응용 분야를 입증했음을 제시했습니다. 암세포의 금 나노입자(AuNP) 흡수를 조사할 수 있는 능력을 갖춘 멀티모달 이미징 플랫폼은 레이저 빔이 AuNP에 흡수될 때 온열암 치료에 대한 세포 반응을 시각화할 수 있습니다.

또한 두 세트의 격자 쌍을 사용하여 각 레이저 빔의 처프를 제...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
APE SRS Detection Unit	APE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH)	APE Lock-in Module	Combined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations
Confocal Scanning Unit	Olympus	FV 3000	Confocal scanning unit used for imaging
CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µm	Invitrogen	C37483	Polystyrene microspheres
Coverslips	Thorlabs	CG15CH2	22 mm x 22 mm coverslips for seeding cells
FBS	Gibco	10500-064	Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated)
Flouview	Olympus	FV31S-SW	Laser scanning microscope control software
Function Generator	BX precision	40543	Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam
Gold Nanoparticles	Nanopartz	A11-60	Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter
Input Output Interface	Olympus	FV30 ANALOG	This unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit.
InSight X3	Newport	Spectra-Physics	Dual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz.
Microscope Frame	Olympus	IX83	Inverted microscope
Mouse 4T1 cells	ATCC	CRL-2539	Mouse breast cancer cells
NA 1.2 Water Immersion Objective	Olympus	UPLSAPO60XW/IR	The multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used.
NA 1.4 Condenser	Nikon	CSC1003	Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used.
PMT	Hamamatsu	R3896	PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy
PMT Connector	Hamamatsu	C13654-01-Y002	Connector for PMT
Power Supply	RS	RSPD-3303 C	Programmable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT
RPMI-1640	Gibco	A10491-01	Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells.
SF-TRU	Newport Spectra Physics	SF-TRU	System designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS