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요약

이 프로토콜은 형질전환 제브라피쉬 모델을 사용하여 망막 색소 상피(RPE)를 유전적으로 제거하는 방법론을 기술한다. 약리학적 화합물을 이용한 신호전달 경로 조절을 통합하도록 프로토콜을 적응시키는 것은 광범위하게 상세하다. 색소침착을 기반으로 RPE 재생을 정량화하기 위한 MATLAB 플랫폼이 개발되어 발표되고 논의됩니다.

초록

망막 색소 상피 (RPE)는 눈 뒤쪽에 상주하며 인접한 망막 및 혈관 조직의 건강과 무결성을 유지하는 데 필수적인 기능을 수행합니다. 현재, 작은 부상으로 제한되는 포유류 RPE의 제한된 회복 능력은 생체 내 RPE 재생 과정을 이해하는 데 진전을 방해했습니다. 여기에서, 강력한 조직 재생이 가능한 척추동물 모델인 제브라피쉬를 활용한 생체내 RPE 복구의 연구를 용이하게 하기 위한 상세한 방법론이 제공된다. 이 프로토콜은 트랜스제닉 니트로환원효소/메트로니다졸(NTR/MTZ) 매개 손상 패러다임(rpe65a:nfsB-eGFP)을 기술하며, 이는 MTZ로 24시간 치료 후 RPE의 중앙 2분의 2를 절제하고 후속 조직 회복을 초래합니다. 유충 제브라 피쉬의 RPE 절제술에 중점을두고 RPE 재생에 대한 약리학 적 화합물의 효과를 테스트하는 방법도 요약되어 있습니다. 색소침착을 기반으로 RPE 재생의 정량화를 자동화하기 위해 만들어진 MATLAB 스크립트인 RpEGEN의 생성 및 검증도 논의됩니다. 활성 RPE 복구 메카니즘을 넘어, 이 프로토콜은 RPE 변성 및 손상 반응에 대한 연구뿐만 아니라 다른 세포 및 분자 과정 중에서도 인접한 망막 및 혈관 조직에 대한 RPE 손상의 영향으로 확장될 수 있다. 이 제브라피쉬 시스템은 RPE 재생 및 RPE 질병 관련 메커니즘을 유도하는 유전자, 네트워크 및 프로세스를 식별하는 데 중요한 약속을 가지고 있으며,이 지식을 포유류 시스템에 적용하고 궁극적으로 치료 개발에 적용하는 장기적인 목표를 가지고 있습니다.

서문

본원에 기재된 방법론은 유충 제브라피쉬를 이용하는 망막 색소 상피(RPE)를 유전적으로 절제하기 위한 프로토콜을 상세히 기술한다. RPE는 눈 뒤쪽으로 확장되어 신경 망막의 층층과 맥락막을 구성하는 혈관 구조 층 사이에 있습니다. 영양 지원, 광독성 광의 흡수 및 시각 주기 단백질의 유지는 RPE가 수행하는 중요한 기능 중 일부에 불과하며, 이는 이러한 인접한 조직의 건강 및 완전성을 유지하는 데 필수적인1. 포유동물 RPE에 대한 손상은 병변이 작을 때 회복가능하다2; 그러나 더 큰 부상이나 진행성 퇴행성 질환으로 인한 손상은 돌이킬 수 없습니다. 인간에서 RPE 퇴행성 질환 (예를 들어, 연령 관련 황반 변성 (AMD) 및 Stargardt 질환)은 영구적 인 시력 상실을 초래하고 사용 가능한 치료 옵션이 거의 없기 때문에 환자의 삶의 질을 떨어 뜨립니다. 포유류 RPE가 자체 복구 할 수있는 제한된 능력은 RPE 재생 프로세스 분야에서 지식 격차를 창출했습니다. 다양한 조직 유형에 걸쳐 제브라피쉬의 강력한 재생 능력을 감안할 때,이 프로토콜은 본질적으로 재생 RPE에 대한 연구를 용이하게하고 그 반응을 유도하는 메커니즘을 밝히기 위해 생체 내 척추 동물 시스템을 구축하기 위해 개발되었습니다. 여기에 요약된 절제 패러다임을 사용하여, 정준 Wnt 신호전달 경로(3), mTOR 경로(4), 및 면역-관련 반응(5 )이 RPE 재생의 중요한 매개체로서 확인되었으며, 아마도 중첩된 기능을 갖는다.

이 유전자 절제 패러다임에서, Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 제브라피쉬는 RPE 인핸서 요소인 rpe65a7의 제어하에 eGFP에 융합된 박테리아 유래 니트로리덕타제(NTR/nfsB) 유전자 6을 발현한다. 절제술은 전구 약물 인 메트로니다졸 (MTZ)을 시스템 수거용 제브라 피쉬에 첨가함으로써 달성됩니다. 니트로리덕타제에 의한 MTZ의 세포내 활성화는 NTR/nfsB 발현 세포 8,9에서 DNA 가교결합 및 아폽토시스를 초래한다. 이 기술은 망막10,11,12,13 및 기타 조직8의 세포를 제거하기 위해 제브라 피쉬에서 널리 사용되었습니다. 함께, 이들 요소들은 유도성 세포 절제 방법론(NTR/MTZ)8,9 및 시각화를 위한 형광 마커(eGFP)의 표적화된 발현(rpe65a)을 가능하게 한다.

RPE14의 재생 잠재력을 연구하는데 사용될 수 있는 다른 흥미로운 생체내 모델도 존재한다. 이들은 광범위하며 양서류에서 RPE-망막으로의 전분화 후 망막 절제술을 포함하며, 여기서 망막 재성장으로 손실된 RPE 세포는15,16으로 대체된다; RPE 회복 후 부상 후 "슈퍼 치유" MRL/MpJ 마우스17; 및 자발적 RPE 및 망막 변성의 래트 모델에서 RPE 증식의 외인성 자극및 18, 그 중에서도. 성체 인간 RPE 줄기 세포 (RPESCs)19와 같은 시험관내 모델도 또한 개발되었다. 이러한 모델은 RPE 재생과 관련된 세포 과정(예를 들어, 증식, 분화 등)을 밝히기 위해 작용하는 모든 유용한 도구이다; 그러나 제브라 피쉬는 절제 후 고유 한 RPE 수리 용량이 독특합니다.

여기의 방법론은 RPE 재생을 유도하는 메커니즘을 이해하는 데 초점을 맞추기 위해 작성되었지만 Tg (rpe65a : nfsB-eGFP) 라인과이 유전 적 절제 프로토콜은 RPE 아폽토시스, RPE 변성 및 인접한 망막 및 혈관 조직에 대한 RPE 손상의 효과와 같은 다른 세포 과정을 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 절제 프로토콜은 또한 약리학적 조작을 포함하도록 변형될 수 있으며, 이는 관심 있는 신호전달 경로를 스크리닝하기 위한 편리한 예비 전략이다. 예를 들어, Wnt Response-1 (IWR-1)20의 억제제를 사용하여 정준 Wnt 경로를 차단하면, RPE 재생3을 손상시키는 것으로 나타났다. 이것은 약리학 적 조작 실험을 통해 사용자를 안내하고 색소 침착의 회복을 기반으로 RPE 재생을 정량화하기 위해 생성 된 MATLAB 스크립트 (RpEGEN)를 검증하기위한 개념 증명 역할을하기 위해 여기에서 반복되었습니다. 트랜스제닉 라인 및 절제 프로토콜과 마찬가지로 RpEGEN 스크립트는 적응이 가능하며 RPE 내의 다른 마커/세포 프로세스를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법론은 피츠버그 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)를 준수합니다.

1. 제브라피쉬 배아 채취 전의 제조

  1. 배아 배양기를 28.5°C로 설정합니다.
  2. 멜라닌 생성 억제제인 N-페닐티오우레아(PTU)21,22의 25x 원액을 제조하였다. 이 원액은 일반적인 레시피22로부터 스케일링되고, 1x는 부피당 0.003% 중량%(% w/v)와 같다(예를 들어, 100mL의 액체 용매 내로 PTU 분말 0.003g).
    1. 큰 25x PTU 원액을 만들기 위해, 정제된 탈이온수 1 L(이하, dH2O라고 함)에 PTU 분말 0.75 g을 첨가하고, 교반 막대 및 교반 플레이트를 사용하여 실온(~25°C)에서 충분히 혼합한다. 4°C에서 최대 3개월 동안 보관하여 빛으로부터 보호하십시오.
      참고 : PTU를 수용액으로 들어가는 것은 어렵고 하룻밤 사이에 연장 된 교반이 필요할 수 있습니다.
      주의: PTU는 위험하므로 섭취, 흡입 및/또는 피부나 눈과의 접촉을 방지하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 본원에 기재된 PTU 분말 및 모든 PTU 액체 유도체는 주 및 기관 규정에 따라 화학 폐기물로서 폐기될 필요가 있을 수 있다. 적절한 PTU 폐기물 처리 방법(있는 경우)을 사용하기 전에 확인하는 것이 좋습니다.
    2. 1.5x PTU 작업 용액(이하 1.5x PTU라고 함)을 만들려면 60mL의 25x PTU 원액을 940mL의 제브라피쉬 하우징 시설 물(이하 시스템 물)에 첨가합니다. 제브라피쉬에 대한 최적의 수질 파라미터는23 기술되었으며 수생 시설에는 표준 수질 모니터링 절차가 마련되어 있어야합니다. 1.5x PTU를 28.5°C에서 1-2주 동안 보관하여 빛으로부터 보호하십시오.
      참고: 이 프로토콜은 단계 1.2에서 설명한 PTU 농도, 용매 및 저장 매개 변수를 사용하여 일상적으로 수행됩니다. 예방 조치로, 배아 / 유충은 효능을 검증하고 지속적인 탈색을 확인하기 위해 PTU에있는 동안 1-2 일마다 관찰되어야합니다. 용해 및/또는 저장 조건은 PTU 용해도/효능의 감소가 의심되는 경우 최적화되어야 한다.
  3. 진균 성장 억제제인 메틸렌 블루 분말 0.05g을dH2O. 100mL에 첨가하여 0.05% w/v 메틸렌 블루의 원액을 준비하고, 교반 막대와 교반 플레이트를 사용하여 완전히 혼합한다. 4°C에서 보관하십시오.
  4. 다이아몬드 팁 스크라이빙 펜을 사용하여 유리 파스퇴르 피펫의 테이퍼 끝을 절단하여 배아 / 유충 조작 (예 : 페트리 접시 사이에 배아 / 애벌레 이동, 형광 스크리닝 중 유충 분리, 고정을 위해 안락사 된 유충을 마이크로 원심 분리기 튜브로 수집 등)을위한 피펫을 준비하십시오. 다이아몬드 펜으로 피펫 둘레를 에칭하고 끝을 부드럽게 당기거나 스냅하여 깨끗하게 휴식을 취하십시오.
    참고 : 피펫의 입은 전단없이 chorion 내부에 남아있는 배아를 쉽게 차지할 수있을만큼 부드럽고 넓어야합니다. 전구 드로우 전송 피펫을 대안으로 사용하십시오. 준비된 피펫은 배아 / 유충 손실을 최소화하기 위해 물 변화 (쏟아지는 것이 아닌) 동안 액체를 제거하는 데에도 사용할 수 있습니다.
  5. 1x 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 중의 4% 파라포름알데히드 (PFA) 용액을 제조하였다 (예를 들어, 10 mL의 10x PBS 및 26 mL의dH2O에 4 mL의 16% PFA를 첨가함). 빛으로부터 보호되는 최대 4주 동안 4°C에서 보관하십시오.
    주의: 파라포름알데히드는 위험한 화학 물질이므로 화학 흄 후드에서 취급하고 적절하게 폐기해야 합니다. 섭취, 흡입 및 / 또는 피부 나 눈과의 접촉을 방지하기 위해 개인 보호 장비 (PPE)를 착용해야합니다.

2. 유전자 절제 전 제브라피쉬 배아 수집 및 유지 보수 (수정 후 0-5 일)

  1. 앞서 설명한바와 같이 성인 제브라피쉬를 유지 3,4,5. 배아 수집 전 오후 / 저녁에는 성인 제브라 피쉬를 산란을 위해 번식 탱크로 분리하십시오.
  2. 다음날 아침 (수정 후 0 일 (dpf)), 배아를 시스템 물에 직경 10cm 페트리 접시로 모으고 불투명 해 보이거나 불규칙한 세포질과 실패한 절단24를 나타내는 모든 생존 불가능하거나 수정되지 않은 난자를 제거합니다.
    참고: 정상적인 절단 및 발달 스테이징 사건은25에 기술된 바와 같이 건강한 배아에서 명백할 것이다. 페트리 요리는 프로토콜 전반에 걸쳐 3-네 번째 전체 (직경 10cm 접시의 경우 ~ 30mL)로 보관해야합니다.
    1. 각 페트리 접시에 0.05 % w / v 메틸렌 블루 두 방울을 넣고 부드럽게 섞은 다음 나머지 프로토콜을 위해 28.5 ° C에서 배아를 보관하십시오.
  3. 수정 후 약 6 시간 (hpf) 4,5,26, 배아 페트리 접시의 시스템 물을 1.5x PTU (1.2.2 단계에서 만든 작업 용액)로 교체하고 메틸렌 블루를 보충하십시오.
    참고: PTU는 색소침착이 시작되기 전(즉, 24hpf 이전)25 배아에 첨가되어야 하는데, 이미 색소화된 조직은 PTU21을 첨가할 때 탈색되지 않기 때문이다. 그러나 안구 크기 감소, 안구 및 두개골 안면 결핍 및 일부 신호 전달 경로의 붕괴 (예 : 갑상선 신호 전달)가 PTU 처리 된 제브라 피쉬27,28,29에서보고되었다는 점에 유의해야합니다. PTU의 발달 독성은 PTU 첨가27,29의 농도 및 타이밍에 의존하는 것으로 보인다. PTU 효능을 검증하기 위해 위에서 언급 한 바와 같이 (1.2 단계), PTU 독성의 징후도주의 깊게 모니터링해야하며 의심되는 경우 PTU 첨가의 작동 농도 및 / 또는 시간을 최적화해야합니다.
  4. 2-3 dpf에서, 갓 만든 pronase 용액을 사용하여 배아를 데코리오네이트하십시오.
    1. 볼텍싱을 통해 1.5x PTU에 프로나제를 2mg/mL의 농도로 녹입니다.
      주의: 프로나제는 매우 미세한 분말로 포장되어 있으며 자극제입니다. 흡입 및 / 또는 피부, 눈 등과의 접촉을 피하기위한 조치를 취하십시오.
    2. 부화되지 않은 배아와 부화 된 배아를 분리하고 부화되지 않은 배아 만 pronase로 치료하십시오.
    3. 1.5x PTU를 2.4.1 단계에서 만든 2mg/mL 프로나제 용액으로 교체하고 부드러운 교반(예: 탁상 회전기/쉐이커 또는 수동 소용돌이)으로 4-5분 동안 부화되지 않은 배아에 둡니다.
    4. 프로나제 용액을 붓고 즉시 신선한 1.5x PTU로 헹구십시오. 전구 그리기 전달 피펫으로 배아 위에 1.5x PTU를 부드럽게 헹구십시오.
    5. 두 번째 1.5x PTU 헹굼을 반복하여 모든 chorion 파편을 버린 다음 유지 보수를 위해 1.5x PTU를 보충하십시오.
      참고 : 배아는 미세 팁이 달린 포셉을 사용하여 수동으로 데코리온화 할 수도 있습니다. 이 경우 chorion 파편을 제거하고 수동 dechorionation을 한 후에 1.5x PTU를 보충해야합니다.
  5. 배아 / 애벌레 건강을 모니터링하고 1-2 일마다 1.5x PTU를 보충하십시오. 배아 / 유충은 5 dpf에서 절제 될 때까지 1.5x PTU에 보관됩니다.
    참고: 2.3단계와 2.4단계의 중요성은 토론 섹션에서 자세히 설명합니다.

3. rpe65a에 대한 제브라 피쉬 유충 스크리닝 : nfsB-eGFP 및 망막 색소 상피의 유전 적 절제 (수정 후 5-6 일)

  1. 신선한 10 mM 메트로니다졸 (MTZ) 용액을 5 dpf (절제 당일)에 만드십시오. 이 프로세스를 완료하는 데 2시간이 걸립니다.
    1. MTZ 분말을 PTU가 없는 시스템 물에 첨가하고, 37°C에서 1시간 동안 격렬한 진탕(예를 들어, 분당 250회 회전)에 의해 완전히 혼합한다.
    2. 10mM MTZ 용액을 탁상 회전기/쉐이커에서 실온에서 추가로 1시간 동안 식히고 유충이 있는 페트리 접시에 첨가하기 전에 완전한 용해를 보장합니다.
      참고: eGFP+ 유충의 형광 스크리닝 및 분리(단계 3.2)는 37°C 및 실온 인큐베이션 동안 수행될 수 있다.
      주의: MTZ는 위험하므로 섭취, 흡입 및/또는 피부나 눈과의 접촉을 방지하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 본원에 기재된 MTZ 분말 및 모든 액체 유도체는 주 및 기관 규정에 따라 화학 폐기물로서 폐기될 필요가 있을 수 있다. 사용 전에 적절한 MTZ 폐기물 처리 방법(있는 경우)을 확인하는 것이 좋습니다.
  2. rpe65a:nfsB-eGFP 전이유전자에 대한 제브라피쉬 유충을 선별한다.
    1. 0.168 g/L의 트리카인(MS-222)과 488nm 여기 레이저/필터가 있는 형광 스테레오 현미경을 사용하여 비형질전환(eGFP-) 유충으로부터 분리된 트랜스제닉 (eGFP+) 유충(그림 1)을 가진 유충을 마취시킨다.
      참고 : 트리카인은 1.5x PTU 및 / 또는 약리학 적 화합물 용액에 첨가되어야하며, 유충은 eGFP를 검사하는 동안 치료에 잠겨 있어야합니다. 유충을 스크리닝 기간 동안만 트리카인에서 인큐베이션한다(예를 들어, 50마리의 유충을 함유하는 단일 10cm 페트리 접시에 대해 ≤10분).
    2. 트리카인이없는 신선한 1.5x PTU가있는 페트리 접시에 직접 피펫팅하여 즉시 선별 된 유충을 깨우십시오.
    3. 스크리닝이 완료되면 eGFP+ 유충을 페트리 접시의 두 그룹으로 더 분리한다: 한 그룹은 MTZ 처리(절제/MTZ+)를 받고 한 그룹은 미제거(MTZ-) 대조군이 될 것이다.
  3. 망막 색소 상피를 절제하십시오.
    1. 절제되지 않은 (MTZ-) 제어 접시에서 1.5x PTU를 제거하고 PTU없이 신선한 시스템 물을 넣으십시오.
    2. 절제된(MTZ+) 처리 접시에서 1.5x PTU를 제거하고 새로 만든 10mM MTZ 용액을 첨가한다(단계 3.1).
    3. 정확히 24시간 후에 10mM MTZ 용액(부상 후 1일(dpi)으로 지정됨)을 제거하고 PTU가 없는 담수액을 첨가하십시오. MTZ- 접시에 PTU가없는 신선한 시스템 물을 교체하십시오. 유충은 프로토콜의 나머지 부분 동안 PTU에 다시 노출되지 않습니다.
      참고: 동물이 활발히 헤엄치고 있기 때문에 유충 손실 없이 용액 교환 사이에 모든 1.5x PTU(단계 3.3.1 및 3.3.2단계) 또는 10mM MTZ(3.3.3단계)를 피펫으로 붓거나 붓는 것은 어려울 수 있습니다. 이 경우 PTU가 없는 시스템 물의 세척을 추가하여 성공적인 용액 교환을 보장할 수 있습니다.

4. 유전 적 절제 후 유충 유지 (수정 후 6 일 이상)

  1. 안락사 (5.6 단계)까지 유충을 확인하고 PTU없이 매일 시스템 물을 보충하거나 제브라 피쉬 주거 시설로 돌아갑니다.
  2. 스테레오 현미경으로 전송된 조명 조명을 사용하여 2dpi(7dpf) 에서 생체 내 절제의 성공 여부와 정도를 모니터링합니다(그림 2).

5. 제브라피쉬 망막 색소 상피 절제 프로토콜에 약리학적 치료 통합

참고: 이전에 수행된바와 같이, 4dpf에서 시작하는 15 μM IWR-1 또는 부피 정합된 디메틸설폭사이드(DMSO) 비히클 제어에 의한 처리는 RpEGEN을 시험하기 위한 예시적인 실험으로서 여기에 요약되어 있다. 농도 및 일정은 약리학적 화합물에 따라 다를 수 있으며, 용량-반응 검증, 치료 기간, 스크리닝 및 약리학적 조작 연구를 위한 실험 설계의 다른 측면에 대한 권장 사항은 토론 섹션에서 다루어집니다. 이미지 분석이 필요한 경우 6단계와 7단계를 수행합니다.

  1. 단계 2에 기재된 바와 같이 배아를 수집하고 유지한다. 2 dpf에 배아를 데코리오네이트하십시오.
  2. 단계 3.2에 기재된 바와 같이 4 dpf 상에서 eGFP+ 유충을 스크린한다. 페트리 접시 대신 eGFP + 유충을 약리학 적 치료를 위해 6 웰 당 n ≤ 10 마리의 유충의 밀도로 6 웰 플레이트에 넣으십시오. 절제되지 않을 유충 (MTZ-)과 절제 될 유충 (MTZ +)에 대해 별도의 6 웰 플레이트를 지정하십시오.
    참고: eGFP 신호는 4dpf에서 볼 수 있지만 5dpf의 신호 강도보다 더 어둡게 나타납니다.
  3. 4 dpf eGFP+ 유충을 15 μM IWR-1 또는 부피 매칭 DMSO 비히클 대조군으로 10 mM MTZ 용액으로 유전자 절제 전에 정확히 24시간 동안 전처리한다.
    참고 : 종종 약리학 적 치료 실험에 거의 화합물이 필요하지 않습니다. 소량의 IWR-1 분말을 칭량하는 것을 피하기 위해이 약리학 적 화합물은 이미 DMSO 용액에서 25mM의 농도로 구입하고 반복적 인 동결 - 해동 사이클을 피하기 위해 도착시 더 작은 부피로 분취됩니다.
    1. 필요한 약리학 적 및 비히클 제어 치료의 부피를 결정하고 그에 따라 원뿔형 튜브에 1.5x PTU를 분취하십시오. 6웰 플레이트의 부피는 5mL/웰인 것이 좋습니다.
    2. IWR-1 스톡을 15 μM IWR-1의 최종 농도에 대해 1.5x PTU에 첨가한다 (예를 들어, 1.5x PTU의 5 mL 당 25 mM IWR-1의 3 μL). 매칭된 부피의 DMSO 스톡을 1.5x PTU (예를 들어, 3 μL ≥ 1.5x PTU의 5 mL 당 99.7% DMSO)에 첨가한다. 여기서, 이것은 결국 0.06% 부피/부피(% v/v) DMSO의 최종 농도를 산출할 것이다. 볼텍싱으로 잘 섞어서 화합물의 용해를 육안으로 확인하십시오.
      주의: DMSO, IWR-1 및 기타 약리학적 화합물 및 용매는 주 및 기관 규정에 따라 화학 폐기물로 처리해야 할 수 있습니다. 이러한 화합물에 대한 위험 수준 확인 및 적절한 폐기물 처리 방법(있는 경우)은 사용 전에 권장됩니다.
    3. 6웰 플레이트의 eGFP+ 유충에서 1.5x PTU를 제거하고 5.3.2단계에서 갓 만든 0.06% v/v DMSO 또는 15μM IWR-1 처리 5mL/웰을 추가합니다.
  4. 5dpf에서 RPE를 제거합니다. 24시간 전처리 (단계 5.3) 이외에, 유충은 10 mM MTZ로 유전자 절제술의 24 h 동안 및 절제 후 회복 동안, 고정될 때까지(예를 들어, 4-9 dpf로부터) 약리학적 및 비히클 대조 치료에 침지된 채로 남아있을 것이다.
    1. 유전자 절제를 수행하기 2시간 전에 10mM MTZ 용액을 만든다(단계 3.1).
    2. 비하블레이션(MTZ-) 및 절제(MTZ+) 6-웰 플레이트 모두에 필요한 약리학적 및 비히클 제어 처리의 부피를 결정하고 PTU(MTZ-) 또는 10mM MTZ 용액(MTZ+)이 없는 담체계 물을 원뿔형 튜브에 적절한 부피로 분취합니다. 이것은 네 가지 처리 조건을 산출할 것이다: 1) 0.06% v/v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0.06% v/v DMSO, MTZ+; 및 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. IWR-1 및 DMSO 스톡 솔루션을 5.3.2단계에서 수행한 대로 각 원뿔형 튜브에 추가합니다. 볼텍싱으로 잘 섞어서 화합물의 용해를 육안으로 확인하십시오.
    4. 지정된 비절제(MTZ-) 및 절제(MTZ+) 6-웰 플레이트에서 1.5x PTU(단계 5.3.2)에서 0.06% v/v DMSO 및 15μM IWR-1 처리를 제거하고 5.4.3단계에서 만들어진 적절한 처리로 보충하십시오.
    5. 정확히 24시간 후에 10mM MTZ 용액에서 0.06% v/v DMSO 및 15μM IWR-1 처리를 제거하고 PTU가 없는 담수에서 처리하여 보충하십시오. 0.06% v/v DMSO 및 15μM IWR-1 처리를 PTU가 없는 담체계 물에 보충하여 절제되지 않은(MTZ-) 6웰 플레이트에 보충하십시오.
  5. 4 단계에 설명 된대로 절제 후 유충 유지 보수를 따르고 PTU가없는 시스템 물에 매일 0.06 % v / v DMSO 또는 15 μM IWR-1 처리를 보충하십시오.
  6. 9 dpf (연령 일치 MTZ 처리 형제의 경우 4dpi)에서 유충을 안락사시켜 동물을 0.3 g / L 트리카인 용액 (치명적인 과다 복용)에 담그고 빠른 냉각과 함께 (예 : 페트리 접시를 얼음 위에 놓으십시오) 적어도 20 분 동안30 분 동안 안락사시킵니다. 유충이 실온에서 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 4 % PFA (1.5 단계)에서 3 시간 동안 만지고 고정되는 것에 반응하지 않는지 확인하십시오.
  7. Z-스택 이미지 획득을 위한 고정 후 애벌레 조직을 공초점 현미경 상에서 이전에 기술된 바와 같이 5,31 및 여기에 대표적인 결과 섹션에서 처리한다. 단계 6 및 7에서의 분석은 최소한 핵 마커(예를 들어, DAPI) 및 브라이트필드 z-스택 이미지의 획득을 필요로 할 것이다.

6. FIJI의 공초점 현미경 z 스택 이미지 전처리 (ImageJ)

  1. FIJI32를 사용하여 공초점 현미경 z-스택 이미지를 가져오고 포맷합니다.
    1. 스택 보기로 설정된 Bio-Formats 가져오기 옵션을 사용하여 현미경 이미지를 엽니다: 하이퍼스택 및 색상 모드: 회색조.
    2. 이미지 |을 선택하여 가져온 현미경 이미지의 최대 강도 투영을 생성합니다. 스택 | Z 프로젝트. ZProjection 창에서 슬라이스 시작 및 슬라이스 중지를 설정하여 해당 이미지의 모든 슬라이스를 포함합니다. 예를 들어, 총 18개의 슬라이스가 있는 z-스택에 대해 시작 슬라이스: 1 및 슬라이스 중지: 18을 설정합니다. 투영 유형: 최대 강도를 선택하고 확인을 클릭합니다.
    3. 이미지 |를 선택하여 최대 강도 프로젝션 파일을 8비트 이미지(아직 없는 경우)로 변환 유형 | 8비트.
    4. 이미지 |를 선택하여 등쪽 측면이 위쪽이고 원위 (즉, 렌즈)가 남도록 이미지의 방향을 바꿉 | 변환 가로로 대칭 이동(마지막 명령의 경우 해당 이미지에 필요한 방향성에 가장 적합한 옵션을 선택). 다중 채널 이미지의 경우 프로세스 스택 에서 예를 클릭하십시오. 모든 채널의 방향을 바꾸는 창입니다.
      참고: 이 단계는 중요하지만 이미지가 이미 등쪽 위쪽, 원위 왼쪽 방향에 있는 경우에는 필요하지 않습니다. 처리를 위해 올바른 방향성으로 눈이 있는 이미지에 대해서는 그림 3A-D 및 그림 4를 참조하십시오.
    5. 파일 연결을 선택하여 8비트 최대 강도 프로젝션을 태그가 지정된 TIF(이미지 파일 형식) 파일로 저장 | |한 이름으로 저장 티프....
  2. FIJI를 사용하여 RPE 관심 영역(ROI)을 생성합니다.
    1. 6.1단계에서 설명한 대로 생성된 8비트 TIF 이미지를 엽니다. | 분석을 선택하여 ROI 관리자를 시작하십시오 . 도구 | ROI 관리자.
    2. 이미지 | 사용 DAPI와 브라이트필드 채널 사이를 확대 및 토글하여 RPE의 정점 측면이 외부 제한 멤브레인(OLM)의 팁에 인접한 지점을 식별합니다(그림 3B', B", D', D"; 파란색 화살표 헤드). 이 해부학적 랜드마크를 ROI 시작점으로 사용하십시오.
    3. DAPI 및 브라이트필드 이미지 채널과 줌 기능을 모두 사용하여 다각형 선택 도구(FIJI 도구 모음)를 사용하여 RPE ROI를 생성합| Zoom)을 사용하여 정점 및 기본 RPE 경계를 식별합니다. ROI의 등쪽 및 복부 끝(즉, ROI가 RPE의 정점에서 기저면으로 전환되는 경우)을 둔화하거나 반올림하는 대신 날카로운 지점으로 가져옵니다(그림 3B', B", D', D"; 마젠타 선).
      참고: 뾰족한 ROI 끝을 만드는 것은 RpEGEN을 사용하여 끝점 검색을 최적화하는 데 중요한 단계이며 토론 섹션에서 설명합니다.
    4. ROI 관리자에서 추가를 클릭하여 ROI 를 추가합니다 . 필요에 따라 ROI를 조정하고 ROI 관리자에서 업데이트를 클릭하십시오.
    5. 더보기를 선택하여 ROI 파일을 저장합 >> | 구해내다... ROI 관리자 내에서. 일치하는 ROI 및 TIF 이미지 파일(예: [파일 이름].tif 및 [파일 이름].roi)에 대해 동일한 이름을 사용합니다.
  3. 각 조건에 대한 8비트 TIF 및 ROI 파일을 단일 폴더로 결합합니다. 예를 들어, 폴더DMSO_9dpf는 9dpf 비절제(MTZ-) 0.06% v/v DMSO 처리 유충 그룹에 대해 일치하는 모든 TIF 및 ROI 파일을 포함합니다.

7. RpEGEN 스크립트를 사용한 RPE 재생성의 정량화 및 시각화

  1. RpEGEN 스크립트를 설치하고 준비합니다.
    1. 코드 https://github.com/burchfisher/RpEGEN 을 클릭하여 GitHub 리포지토리(|)에서 최신 RpEGEN 스크립트를 다운로드합니다 . ZIP을 다운로드하십시오.
    2. 폴더의 압축을 풀고 원하는 작업 공간 위치(예: 데스크톱)에 배치합니다.
    3. MATLAB을 엽니다.
    4. 현재 폴더 창에서 RpEGEN 폴더 로 이동합니다(일반적으로 왼쪽).
    5. RpEGEN 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 경로에 추가 | 선택한 폴더 및 하위 폴더. 이렇게 하면 폴더가 MATLAB 경로에 추가되므로 폴더의 스크립트를 자동으로 찾아 실행할 수 있습니다.
    6. 현재 폴더 창에서 RpEGEN 폴더를 두 번 클릭하여 모든 하위 폴더와 M 파일을 표시합니다.
    7. RpEGEN.m 파일을 두 번 클릭하여 편집기 창에서 엽니다.
    8. RpEGEN.m 파일의 사용자 정의 변수 섹션 아래에 ROI 파일(.roi), 이미지 파일(.tif)이 포함된 폴더의 디렉토리 위치 및 출력 파일을 저장해야 하는 위치를 입력합니다. 내보낼 .mat 파일의 그룹 이름(예: DMSO_9dpf, DMSO_4dpi 등)과 TIF 이미지 스택에서 brightfield 채널의 위치(예: brightfield가 이미지 스택의 세 번째 채널인 경우 3)를 입력합니다. 이미지 파일에 brightfield 이미지만 포함된 경우 이 값은 1과 같아야 합니다.
  2. RpEGEN.m 스크립트를 실행하고 결과의 유효성을 검사합니다.
    참고: RpEGEN을 실행하려면 이미지 처리 도구 상자, 곡선 피팅 도구 상자, 통계 및 기계 학습 도구 상자를 사용자 MATLAB 라이선스에서 활성화해야 합니다. 또한, 자유롭게 이용가능한 ReadImageJROI 툴박스(33 )는 FIJI ROI들을 MATLAB으로 임포트하기 위해 요구된다; 그러나 활성화가 필요하지 않은 다른 함수 M 파일과 함께 RpEGEN 폴더에 제공됩니다.
    1. MATLAB의 맨 위에 있는 편집기 메뉴에서 실행 단추를 클릭하여 스크립트를 실행합니다.
      참고: 일단 시작되면 명령 창은 스크립트의 진행률을 나타내는 자세한 출력을 제공합니다. 추출 된 데이터가 포함 된 MAT 파일을 저장하면 세 개의 패널 그림이 나타나고 각 이미지 실행의 출력 디렉토리에 PDF로 저장됩니다. 이들은 모든 것이 제대로 실행되었는지 확인하기 위한 품질 관리(QC) 수치이며, 여기에는 1) ROI에 의해 오버레이된 브라이트필드 이미지(그림 4A)가 포함됩니다. 2) 중심선 및 관련 각도 거리 (도)가있는 ROI (그림 4G); 3) 중심선 중앙값 강도 값(0-255, 8비트 색상 척도)을 사용한 ROI(그림 4H). 다음 단계로 진행하기 전에 QC PDF가 출력 폴더에 저장되고 마지막 그림이 사라질 때까지 기다리십시오.
    2. 모든 PDF 뷰어의 출력 폴더로 내보낸 개별 PDF를 열고 모든 ROI가 밝은 필드 이미지와 일치하는지, 중심선 값이 ROI 중심의 합리적인 근사치인지, 중간 강도 값이 데이터로 적절하게 채워져 있는지 확인합니다(즉, 전체 중심선에서 모두 동일한 값은 아님).
      참고: RpEGEN.m에 의해 MAT 파일에 저장된 각 변수에 대한 자세한 설명과 구조는 표 1에서 찾을 수 있습니다.
  3. RpEGEN_PermPlot.m 스크립트를 실행합니다.
    참고: RpEGEN_PermPlot.m 스크립트는 RpEGEN.m의 출력을 사용하여 두 그룹의 중앙값에 대한 순열 시뮬레이션을 사용하여 통계적 비교를 실행하며, 또한 RpEGEN 폴더에도 포함된 자유롭게 사용 가능한 GRAMM 도구 상자(34)를 사용하여 이 백서의 플롯을 재생하기 위한 코드를 제공합니다.
    1. RpEGEN_PermPlot.m 파일을 두 번 클릭하여 새 편집기 탭에서 엽니다.
    2. RpEGEN_PermPlot.m 파일의 섹션 1 - 사용자 정의 변수 아래에 실행 중인 MAT 파일이 포함된 출력 폴더의 디렉토리 위치를 입력하고 로드할 각 MAT 파일 이름(예: DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat)을 입력합니다.
    3. MATLAB의 맨 위에 있는 편집기 메뉴에서 섹션 실행 단추를 클릭하여 스크립트의 이 섹션을 실행합니다.
    4. 섹션 2에서 data_A과 data_B 변수에 통계적 비교를 위해 두 그룹의 이름을 입력합니다(이들은 순열 시뮬레이션을 사용하여 중앙값이 파생될 그룹입니다). bin_sz 변수에 데이터 세트의 중간 강도 값을 통합할 각도 수를 입력합니다(기본값은 1도 빈임).
      참고: reps 변수는 확률 분포를 작성하는 데 사용할 순열 수를 나타내며 임의의 숫자로 설정할 수 있습니다(기본값은 20,000임). 일반적으로 반복 횟수가 많을수록 통계적으로 더 강력하지만 처리 시간이 늘어납니다.
    5. MATLAB의 맨 위에 있는 편집기 메뉴에서 섹션 실행 단추를 클릭하여 스크립트의 이 섹션을 실행합니다. 이 섹션은 지정된 반복 횟수에 따라 완료하는 데 다소 시간이 걸릴 수 있지만 명령 창에 지속적인 상태 업데이트를 제공합니다.
    6. 히트 맵 그림 및 그룹 결과 및 P-값 섹션을 실행 섹션 단추를 사용하여 독립적으로 실행합니다. "여기에 데이터 입력"이 주석이 달린 모든 섹션의 데이터 변수를 편집하십시오. 이 그림의 PDF는 각각에 대해 자동으로 저장되며 모든 벡터 소프트웨어 사후 처리에서 쉽게 수정할 수 있습니다.
      참고: RpEGEN_PermPlot.m 파일에서 생성된 플롯은 임시 파일이며 각 사용자의 특정 데이터 및 시각화 요구 사항에 따라 수정해야 할 수 있습니다. 그러나 수치는 MATLAB 및 GRAMM 웹 사이트를 모두 사용하여 쉽게 개별화 할 수있는 견고한 기반을 제공합니다.

결과

정준 Wnt 신호전달 경로를 억제하는 것은 프로토콜3에 기재된 유전자 절제 패러다임(rpe65a:nfsB-eGFP) 및 약리학적 조작 방법론(IWR-1)을 사용하여 제브라피쉬 RPE 재생을 유의하게 손상시키는 것으로 알려져 있다. 이 실험은 색소침착에 기초한 제브라피쉬 RPE 재생을 정량화하는 자동화된 방법을 검증하기 위해 여기에서 반복되었다. 아래에 요약 된 결과는 수정 일 (0dpf)부터 RpEGEN...

토론

이 프로토콜은 RPE를 유전적으로 완화시키는 방법론을 설명하고 유충 노화 제브라 피쉬에서 퇴행 및 재생 메커니즘을 연구합니다. 이 프로토콜은 또한 성인 제브라 피쉬3에서 성공적으로 수행되었지만 덜 광범위한 특성화로 인해 애벌레가 여기에 초점을 맞추고 있습니다. 프로토콜의이 부분의 중요한 측면 (단계 1-4)은 1) 멜라닌 생성의 발병 전에 배아에 1.5x PTU를 추가, 2) 2-3 dpf ?...

공개

L.L.L.은 인간 다능성 줄기 세포로부터 망막 색소 상피를 유도하는 신속한 방법을 기술하는 미국 특허 #9,458,428에 대한 공동 발명가이다; 이는 본 명세서의 내용과 무관하다. J.M.G.와 G.B.F.는 공개할 것이 없습니다.

감사의 말

본원에 기재된 작업은 국립 보건원 (RO1-EY29410 내지 J.M.G, 및 NIH CORE 그랜트 P30-EY08098 내지 안과)에 의해 지원되었다; UPMC 면역 이식 및 치료 센터 (L.L.L. 및 J.M.G.); 안과 연구의 E. Ronald Salvitti Chair (J.M.G.). 안과 Wiegand Fellowship in Ophthalmology (L.L.L), 피츠버그의 Eye & Ear Foundation, 그리고 실명 방지를위한 연구, 뉴욕, 뉴욕의 무제한 보조금으로부터 추가 지원이 접수되었습니다. 저자는 또한 기술 지원에 대한 아만다 플랫과 휴 해머 박사와 우수한 동물 관리 지원에 대한 수생 스태프에게 감사하고 싶습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)Millipore SigmaD9542
6-well platesFisher Scientific07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge TubesFisher Scientific05-539-13Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing penFisher Scientific50-254-51Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 %Fisher ScientificBP231Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large)Fisher Scientific3720A
Embryo incubator (mini/tabletop)LabnetI5110A
Fluorescence stereo microscopeZeissAxio Zoom.V16Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipetteFisher Scientific13-678-4Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endoMillipore Sigma5.04462Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder)Fisher ScientificBP117-100Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ)Millipore SigmaM3761Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU)Millipore SigmaP7629Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol freeFisher ScientificAA433689MChemical waste, proper disposal required
Petri dishesFisher ScientificFB087571210 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets)Millipore SigmaP3813Used to make 10 X PBS stock
PronaseMillipore SigmaPRON-RO
Shaking incubatorBenchmarkH2010Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscopeLeicaS9iOr similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forcepsFine Science Tools91150-20Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shakerScilogexSK-D1807-E
Transfer pipetteMillipore SigmaZ1350033.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222)PentairTRS1, TRS2, TRS5Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ)FIJI (Fiji is Just ImageJ)https://imagej.net/software/fiji/Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tosMathWorkshttps://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlToolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB supportMathWorkshttps://www.mathworks.com/support.html

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