장내 미생물군 조절을 통한 대장염에 대한 Bacillus cereus 투여의 완화 효과 조사

요약

여기에서는 대장염에 대한 Bacillus cereus 의 긍정적인 효과를 조절하는 장내 미생물총(microbiota)의 역할을 조사하기 위해 항생제 유도 pseudo-germ-free dextran sulfate 나트륨 유발 대장염 마우스 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

장내 미생물총(microbiota dysbiosis)은 대장염의 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 그러나 대장염 완화를 위한 프로바이오틱스 투여에 대한 정확한 기준은 아직 정의되지 않았습니다. 대부분의 분석 방법은 장내 미생물의 제한된 다양성과 풍부함에 의존합니다. 따라서 관찰 연구는 인과 관계를 규명할 수 없습니다. 이 연구에서는 항생제 유도 유사 무균 마우스를 적용하여 마우스의 덱스트란 황산나트륨(DSS) 유발 대장염에 대한 바실러스 세레우스(B. cereus)의 프로바이오틱스 효과를 조절하는 장내 미생물총(microbiota)의 역할을 조사했습니다. 이 과정을 통해 B. cereus 보충제가 건강에 미치는 양방향 조절 효과를 평가할 수 있으며 안정적이고 재현 가능한 결과를 제공할 수 있습니다. 여기에서는 대장염 마우스에 대한 B. cereus 배양, 위장 수술, 대변 채취 및 항생제 제거 치료에 대한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 최적화 방법은 다른 만성 염증성 관련 질환에도 적용할 수 있습니다. 그 결과, B. cereus 투여가 체중 감소, 결장 길이 단축, 질병 활동 지수, 조직병리학적 점수가 감소하는 것으로 나타났다. 그러나 항생제 치료는 대장염에 대한 B. cereus 의 긍정적인 효과를 억제했다. 이러한 결과는 대장염에 대한 B. cereus 의 완화 효과를 위해 장내 미생물총(microbiota)이 필요하다는 것을 나타냅니다. 따라서 이 연구에서 프로바이오틱스의 유익한 효과를 탐구하는 것은 만성 염증성 질환의 증상을 완화하기 위한 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 유망한 접근 방식입니다.

서문

염증성 장 질환(IBD)은 크론병(Crohn's disease) 및 궤양성 대장염(UC)을 포함한 흔한 만성 위장관 염증성 질환입니다¹. 현재 염증성 대장염에 대한 치료법은 5-아미노살리실레이트, 코르티코스테로이드, 아자티오프린, 항생제^{등이다 2}. 더욱이 이러한 약물은 상당한 부작용이 있다³. 따라서 프로바이오틱스가 대장염 치료에 미치는 영향에 더 많은 관심을 기울여야 한다.

대체 치료 접근법에는 동물 모델 및 임상 시험에 사용된 프로바이오틱스 투여가 포함됩니다. 이전 연구에서는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis)와 같은 다양한 프로바이오틱스를 투여하면 대장염을 완화할 수 있다고 밝혔습니다 ^4,5. 전임상 연구에서는 동물 모델에서 프로바이오틱스의 효과와 안전성을 조사해야 합니다.

덱스트란 설페이트 나트륨(DSS) 대장염 마우스 모델은 대장염의 메커니즘을 탐색하고 프로바이오틱스의 긍정적인 효과를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. DSS 유도는 장 점막의 미란, 장 장벽 기능 장애, 장 상피 투과성 증가를 초래한다⁶. 프로바이오틱스에 대한 대부분의 마우스 모델은 주로 생물학적 효과를 강조합니다. 그러나 이 프로바이오틱스 투여 이면의 메커니즘은 프로바이오틱스와 대장염 완화 사이의 인과 관계를 추가로 확인하는 데 한계가 있다는 점을 감안할 때 탐구하기가 어렵습니다. 따라서 프로바이오틱스의 메커니즘을 조사하기 위한 표준화된 방법을 개발할 필요가 있습니다.

전통적으로 이러한 연구에서는 무균 마우스에 특정 프로바이오틱스를 접종해야 합니다⁷. 그러나 무균 마우스를 프로바이오틱스의 수용체로 사용하는 데에는 낮은 면역 능력과 값비싼 무균 시설과 같은 몇 가지 실험실 제한 사항이 있습니다⁸. 이러한 한계를 피하기 위해, 유사 무균 마우스를 사용하여 대안적인 DSS 유발 대장염 모델을 확립하였다. pseudo-germ-free 마우스 모델은 앞서 설명한 바와 같이 항생제의 적용에 의해 확립되었습니다 ^9,10.

이 기사에서는 항생제 칵테일을 사용하여 유사 무균 마우스를 설정합니다. 또한 마우스 대장염 모델을 수립하고 평가하는 방법론을 자세히 설명하고 프로바이오틱스가 대장염 증상 완화에 미치는 영향을 조사합니다. 아래 프로토콜은 또한 간(gavage)에 의한 프로바이오틱스 전달 방법을 제공합니다.

프로토콜

모든 절차는 중국 안후이대학교의 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었으며, 모든 절차는 중국 안후이대학교 동물윤리위원회의 승인을 받았습니다(No. IACUC(AHU)-2020-014).

1. 항생제의 투여

1. 암피실린(1g/L), 네오마이신 설페이트(1g/L), 메트로니다졸(0.5g/L), 반코마이신(0.5g/L)을 식수 1L에 용해시켜 항생제 칵테일을 준비합니다⁵.
2. 완전히 용해된 후 용액을 4°C에서 보관하십시오.
3. 항생제 칵테일 용액을 물병에 넣는다. 마우스 케이지 위에 병을 놓습니다.
   알림: 항생제 용액을 빛으로부터 보호하기 위해 갈색 병을 사용하거나 알루미늄 호일로 병을 싸십시오.
4. 항생제 칵테일을 일주일에 2회 새로운 용액으로 교체하십시오.
5. 생쥐가 4주 동안 항생제 칵테일 용액을 자유롭게 마시도록 합니다.

2. DSS 식수 준비 및 대장염 유도

1. 2.5% 덱스트란 황산나트륨(DSS) 용액을 만들려면 2.5g의 DSS를 증류수 100mL에 용해시킵니다¹¹.
2. 식수를 대장염 모델 마우스 그룹의 2.5% DSS 용액으로 교체하십시오. 대장염 그룹의 쥐가 다른 식수에 접근할 수 없는지 확인하십시오. 한편, 대조군 마우스는 DSS가 없는 증류수로 처리하십시오.
3. 수컷 C57BL/6J 마우스(평균 체중, 20g ± 2g, 생후 7주)를 병원체가 없는 조건에서 표준 음식과 물을 무료로 이용할 수 있도록 합니다.
   참고: 병원균이 없는 조건에서 케이지당 총 5마리의 쥐를 수용합니다.
4. 실험적 설계
   참고: 동물 실험은 두 단계로 설계되었습니다. 각 그룹에 대해 5마리의 마우스가 포함되었습니다.
   1. 첫 번째 단계: 대장염 완화에 대한 B. cereus 의 긍정적인 효과를 평가하기 위해 마우스를 대조군(대조군), DSS 유발 대장염 모델(DSS), DSS 유발 마우스에 대한 프로바이오틱스 B. cereus 보충제(B. cereus)의 세 그룹에 무작위로 할당합니다.
   2. 2단계: DSS 유발 대장염에 대한 B. cereus 의 프로바이오틱스 효과를 조절하는 장내 미생물총(microbiota)의 역할을 조사하기 위해 마우스를 ABX(대조군), ABX(DSS) 및 ABX(B. cereus + DSS)의 세 그룹으로 무작위로 할당합니다.
      1. ABX(대조군) 그룹의 마우스를 생리식염수로 처리합니다.
      2. 4주 동안 항생제 칵테일 용액으로 처리한 후, ABX(DSS) 그룹의 마우스에게 2.5% DSS가 포함된 물을 1주일 동안 투여하고 2주 동안 일반 생리식염수를 투여합니다.
      3. 항생제 칵테일 용액과 DSS 물로 처리한 후 ABX(B. cereus + DSS) 그룹 마우스를 200μL의 생리식염수에 B . cereus (2 x 10⁸ 세포)로 매일 2주 동안 위내 캐뉼라를 사용하여 처리합니다.
5. 항생제 칵테일 투여 후 즉시 수컷 C57BL/6 마우스를 2.5% DSS 용액으로 7일 동안 음용수로 처리합니다.
6. DSS 개입 전 마우스의 체중을 기준 체중으로 기록합니다.

3. B. cereus 의 정량화

1. 900μL의 멸균 생리식염수로 채워진 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브 8개를 준비합니다.
2. 100 μL의 로그 성장 B. cereus 를 피펫으로 만들고 900 μL의 멸균 생리 식염수에 용해시킵니다.
3. 튜브를 사용하여 B. cereus 를 연속적으로 희석합니다.
4. 각 희석액 40μL를 희석 비율로 표시된 각 LB 한천 플레이트에 플레이트합니다. 각 희석 비율에 대해 3회 반복합니다.
5. 플레이트를 37°C 항온 인큐베이터에서 16시간 동안 배양합니다.
6. 계산을 위해 ~20-70개의 콜로니가 있는 플레이트를 선택합니다. 선택한 플레이트의 희석 배수에 따라 평균 박테리아 농도를 계산합니다.

4. 위장에 대한 B. cereus 의 준비

1. B. cereus를 정량화한 후 1 x 10⁹ CFU를 함유한 B. cereus 배지 1mL를 수집하고 8,000 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 8,000 x g에서 10분 동안 원심분리로 멸균수로 세균 세포를 2x 세척하고 상층액을 제거합니다.
2. 농축된 B. cereus 를 멸균 생리식염수로 최종 농도 2 x 10⁸ CFU/200 μL⁴로 희석합니다.
3. 분산된 B. cereus 현탁액을 얻기 위해 희석액을 위아래로 반복적으로 피펫팅합니다.
4. gavage 방법을 완료하기 전에 plate count 기법에 의한 B. cereus 농도의 정량화를 수행합니다.

5. gavage에 의하여 B. cereus 보충교재의 신청

1. 고정된 시간에 구강 배당을 통해 마우스에 중재제(2 x 10,⁸ CFU 프로바이오틱스, 200μL의 생리식염수)를 투여합니다.
2. B. cereus를 투여하려면 1mL 주사기에 간침(수유 바늘 크기: 20G, 38mm)을 연결합니다. 생쥐 사이에 70% 에탄올로 간침 외부를 닦고 적절한 용량 적용을 유지합니다.
3. 쥐를 제지하려면 쥐의 꼬리를 잡고 꼬리 끝을 조련사의 마지막 두 손가락 사이에 고정하여 등의 느슨한 피부를 단단히 잡습니다.
4. 마우스를 수직 위치에 두십시오. 그런 다음 입안을 통해 조심스럽게 부드럽게 식도에 개비지 바늘을 삽입합니다. 이 단계에서 저항이 없으면 바늘을 배에 부드럽게 밀어 넣습니다.
   참고: 약물을 투여하기 전에 마우스의 규칙적이고 방해받지 않는 호흡을 확인하십시오.
5. 천천히 바늘을 전진시키고 B. cereus 용액을 투여합니다. 개비지가 완료된 후 바늘을 부드럽게 빼냅니다. 마우스를 놓고 케이지로 되돌립니다.

6. 질병 활성 지수의 결정

참고: 질병 활성 지수(DAI)는 마우스의 체중 감소, 대변 잠혈 및 대변 일관성에 의해 매일 계산되었습니다.

1. 매일 쥐의 체중을 측정하십시오. 체중 감량 백분율에 따라 각 마우스에 0-4의 점수를 할당합니다.tage(0: 0%, 1: 1%-5%, 2: 6%-10%, 3: 11%-18%, 4: >18%).
2. 각 마우스에서 새로운 대변 샘플을 수집합니다. 면봉을 사용하여 항문의 수축을 자극하여 배변을 촉진합니다. 그런 다음 멸균된 원심분리기 튜브에서 배변 직후 대변 샘플을 수집합니다.
3. 대변 잠혈 검사 논문으로 대변 잠혈을 결정합니다. 어플리케이터 스틱에 10mg의 대변 샘플을 수집합니다.
4. 테스트 카드에 표본을 놓고 카드에 얇게 바르십시오. 뒤쪽 덮개를 열고 번짐 위에 현상액을 바르십시오.
5. 그런 다음 120초 이내에 대변 잠혈 검사지를 사용하여 잠혈에 대한 점수를 매깁니다.
   참고: 도말 위 또는 가장자리에 파란색의 흔적이 있으면 잠혈에 양성입니다. 대변 잠복 점수는 다음과 같았다: 0: 없음, 1: 혈설 양성, 2: 경미, 3: 대변 내 혈흔, 4: 심한 출혈.
6. 대변 샘플을 감지하여 대변 일관성을 식별합니다¹¹. 0-4점(0: 정상, 1: 묽은 변, 2: 반형성 변, 3: 액체 변, 4: 설사)의 점수를 할당합니다.

7. 조직 수집

1. 실험의 첫 번째 및 두 번째 단계가 끝날 때 10% 클로랄 수화물(10mg/kg)을 주입하여 마우스를 마취합니다. 핀치 금단 반사에 의한 마우스의 마취 깊이를 평가합니다.
2. 그런 다음 경추 탈구로 쥐를 안락사시킵니다.
3. 수술대에 누운 쥐를 고정하고 복막강을 엽니다.
4. 결장 전체를 외과적으로 분리하고 자로 길이를 측정합니다.
5. 그런 다음 미리 냉각된 PBS로 채워진 5mL 주사기로 결장을 부드럽게 세척합니다.

8. 조직학적 손상 평가

1. 결장 조직을 작은 조각으로 자르고 4% 파라포름알데히드로 고정한 다음 조직 임베딩 기계를 사용하여 파라핀에 삽입합니다.
2. 그런 다음 파라핀이 포함된 조직을 마이크로톰으로 절편하여 4μm 두께의 결장 조직 절편을 준비합니다. 결장 부분을 탈옥하고 탈수시킵니다. 그런 다음 결장 부분을 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색합니다.
   참고: 염색된 결장 샘플은 염증 세포 침투 정도(없음: 0, 경증: 1, 중등도: 2, 중증: 3), 점막 손상(없음: 0, 점막층: 1, 점막하: 2, 근육 및 혈청: 3), 소낭선 손상(없음: 0, 1/3: 1, 2/3: 2, 전체: 3, 전체 + 상피 손실: 4), 병변 범위 (%) (0 % : 0, 1 % -25 % : 1, 26 % -50 % : 2, 51 % -75 % : 3, 76 % -100 % : 4). 총 조직학적 손상 점수는 위 측정치의 각 개별 점수에 대해^{계산됩니다 5}.
3. 두 명의 독립적인 실험자가 광학 현미경으로 샘플의 조직학적 점수를 평가(맹검)하게 합니다.

결과

B. 대뇌 보충제 및 대장염
급성 실험적 대장염 모델은 식수에 대한 DSS 개입에 의해 유도되었습니다. 그림 1A는 대장염 마우스 모델에 B. cereus 투여를 위한 실험 프로토콜을 보여줍니다. DSS 유도는 분명히 체중(그림 1B)과 결장 길이를 감소시켰습니다. 구강 위장을 통한 B. cereus의 완화 효과는 대?...

토론

임상 연구에서 프로바이오틱스를 사용하기 위해서는 동물 모델에서 프로바이오틱스의 효능과 안전성을 평가해야 합니다. 제공된 프로토콜은 이전에 대장염 중증도를 평가하기 위해 최적화되었습니다. DSS로 치료받은 마우스는 궤양성 대장염의 특징적인 임상적, 조직학적 특징을 모방한 장 염증 모델이다¹². 급성 대장염 모델 마우스는 체중 감소, 설사, ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M PBS (powder, pH7.2–7.4)	Solarbio	P1010-2L
Absolute ethyl alcohol	Hushi	64-17-5
Acid alcohol fsat differentiation solution	Beyotime	No.C0163S
Agar	Sangon Biotech	9002-18-0
Ampicillin	Solarbio	69-53-4	Store at 2–8 °C
Anaerobic incubator	Long Yue	LA1-3T
Dextran sulfate sodium salt colitis grade	MP Biomedicals	160110
Electrothermal incubator	SANFA	HP-050A
General purpose tissue fixator	biosharp	BL539A
Glycerinum	Hushi	56-81-5
Hematoxylin and eosin staining kit	Beyotime	No.C0105
Kisser's Mounting Medium	Beyotime	No.C0181
Metronidazole	Solarbio	443-48-1	Store at 2–8 °C
Neomyein sulfate	Solarbio	1405-10-3	Store at 2–8 °C
Oscillating incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180S
Sodium chloride	Sangon Biotech	7647-14-5
Stool occult blood test paper	Baso	BA2020B
Tryptone	OXOID	2285856
Vancomycin	Solarbio	1404-93-9	Store at 2–8 °C
Xylene	Hushi	1330-20-7
Yeast extract	Sangon Biotech	8013-01-2