액체-연질 물질 상호 작용 관찰을 위한 광 유도 현장 투과 전자 현미경

요약

본 프로토콜은 광 조명 시스템을 사용한 투과 전자 현미경(TEM) 변형, 액체 세포의 제조 및 박테리아 세포와 감광제 간의 광 유도 상호작용에 대한 현장 TEM 관찰을 설명합니다. 샘플 준비 방법, 전자빔 손상 및 이미징에 대해서도 설명합니다.

초록

현재 프로토콜은 현장 광 유도 관찰을 위한 투과 전자 현미경(TEM) 설정의 수정을 설명합니다. 대물 렌즈 폴피스 위의 전자 기둥에 삽입된 유리 광섬유와 조정 가능한 광원인 레이저를 사용하여 장치를 제작했습니다. 외부 측정 시스템을 사용하여 조명기를 보정한 후에는 관찰된 프로세스의 필요에 맞게 조명 강도를 조정할 수 있습니다. 이 조명 시스템은 현재 집중적인 연구 대상인 항균 광역학 치료 현상을 이미지화하는 데 활용되었습니다. 샘플은 탄소, 그래핀 또는 질화규소 기판 상에 박테리아의 현탁액을 발견하고, 과잉 용액을 블롯팅하고, 광감작제 용액을 스팟팅하고, 과잉 액체를 다시 블롯팅한 다음, 액체 셀을 제2 기판 또는 그래핀 필름으로 조립함으로써 제조되었다. 이미징 실험 자체의 프로세스에는 저배율 및 최소 전자 용량을 사용하여 관찰하기에 적합한 장소를 선택한 다음 광원을 주기적으로 활성화하여 필요한 최소 전자 양으로 지정된 간격으로 후속 이미지를 캡처하는 작업이 포함됩니다. 각 노출의 전자 선량과 사용 된 조명의 시간 및 강도는 관찰 된 현상의 복잡성으로 인해 신중하게 기록해야하며, 동시에 프로세스는 빛과 전자에 의해 구동됩니다. 실제 실험이 수행 된 후에는 동일한 양의 전자가 사용되지만 추가적인 빛의 영향이없고 더 적은 양의 전자가 더 많은 양의 빛에 사용되는 추가 제어 관찰이 이루어져야합니다. 이를 통해 생명 및 재료 과학 분야에서 전자로 인한 미세 구조 효과와 광유도 미세 구조 효과를 구별 할 수 있습니다.

서문

고해상도의 광 유도 현상은 나노 공학 1,2,3, 촉매 ^{작용 4,5} 및 바이오 포토닉스⁶과 같은 많은 분야에서 흥미 롭습니다. 이러한 실험을 허용하는 일부 독창적 인 디자인은 샘플 홀더 (^1,4,7,8,9) 및 현미경 ^(10,11)에 부착 된 광섬유의 변형을 포함하여 문헌에서 찾을 수있다.

광 조명, 액체 환경 및 투과 전자 현미경(TEM)의 조합은 광 유도 프로세스에 대한 상세하고 역동적인 연구를 위한 좋은 기회를 제공합니다. 그러나 현미경 내부의 고진공 상태는 많은 액체, 특히 수용액에 다소 불리합니다. 환경으로부터 보호하는 액체 캡슐화는 주로 그래핀 12, 질화규소¹³ 또는 탄소¹⁴ 기판을 기반으로 하는 몇 가지 기술을 사용하여 달성할 수 있습니다. 재료 과학²에 대한 연구 외에도, 소위 액체 세포는 본래의 조건¹⁵ 근처에서 생물학적 표본에 대해 비전통적인 현미경 관찰을 수행할 수 있는 가능성을 제공합니다. 이러한 관찰은 특히 박테리아 세포와 같은 살아있는 미생물에 대해 매우 까다 롭습니다. 전리 방사선으로서의 전자빔은 수화 된 표본에 돌이킬 수없는 손상을 일으키므로 전자 선량을 지정해야합니다¹⁶. 이는 불리한 영향을 최소화하고 손상을 제어하며 혼란스러운 아티팩트를 피하기 위해 필요합니다. 살아있는 세포의 관찰을 허용하는 최적의 최대 전자 선량은 여전히 의심스러운 주제¹⁶이지만, 적어도 박테리아¹⁷에 대해서는 30 e⁻ / nm² 의 선량이 임계 값 인 것으로 보인다.

이러한 현미경 연구에서 관심 대상 중 일부는 항균 광역학 요법(APDT)¹⁸ 동안의 과정입니다. 요컨대, 치료는 다음과 같이 진행됩니다. 박테리아 세포는 감광제라고 하는 감광성 액체로 둘러싸여 있습니다. 특정 파장에서 광 조명이 주어지면 세포 독성 활성 산소 종 (ROS)은 여기 된 광감작 제 분자에서 용액에 자연적으로 존재하는 산소로의 에너지 또는 전하 전달로부터 생성됩니다. ROS에 노출 된 병원체는 부작용없이 매우 높은 효율로 빠르게 비활성화됩니다¹⁹. 치료에 대한 반응은 별개의 미생물에 따라 다릅니다 - 예를 들어, 동일한 광감작제의 영향은 그람 양성균 및 그람 음성 박테리아²⁰에 대해 상당히 다를 수 있습니다. 일반적으로 ROS의 주요 표적은 세포의 외부 구조이며, 손상은 세포막의 기능 장애를 초래하고 결과적으로 박테리아^21,22의 죽음으로 이어진다는 것이 확인되었습니다. 그러나, 핵산 및 단백질 스캔에 대한 손상은 또한 불활성화의 원인으로 간주될 수 있다(¹⁸), 따라서, 이 과정 동안에 어떤 세포 구조가 주요 표적인지는 아직 알려지지 않았다(¹⁹). 손상 과정에 대한 더 깊은 이해는이 결정적인 치료법을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. APDT 연구²³에 사용된 광학 현미경 방법과 비교하여, TEM 기술은 더 높은 해상도 및 배율²⁴로 APDT 메커니즘을 볼 수 있는 더 많은 가능성을 제공한다. TEM은 이미 진행중인 치료 중 세포 관찰에 성공적으로 사용되어 그람 양성균 손상을 연구하고 변화세포벽 내에서 발생하는 ^6,25를 자세히 설명 할 수있었습니다.

현재 프로토콜은 적절한 조명 시스템, 액체로 세포 캡슐화 및 엄격한 전자 선량 제어가 필요한 TEM을 사용하여 광 유도 박테리아 불활성화의 고해상도 이미징에 적합한 실험 설정을 제공합니다. 관찰에 사용 된 박테리아는 황색 포도상 구균이었고 메틸렌 블루 용액은 감광제로 사용되었습니다. 특수 조명 설정은 광 섬유를 사용하여 현미경 컬럼에 직접 연결된 조정 가능한 반도체 레이저로 구성됩니다. 이 설계는 광섬유를 현미경 축에 거의 평행하게 배치하기 때문에 샘플 전체에 균일한 조사를 제공합니다. 레이저에 의해 생성 된 고강도의 단색광은 다양한 광화학 효과를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 실험에 사용 된 빛은 가시 영역에서 메틸렌 블루가 613nm 및 664nm²⁶에서 흡수 피크를 갖기 때문에 660nm와 동일한 파장을 가졌습니다. 액체 캡슐화를 위한 프로토콜은 탄소 기질을 기반으로 하므로 절차가 빠르고 복잡하지 않습니다. 마지막으로, 액체 중 세포의 저용량 현장 TEM 관찰을 위한 방법이 제시된다. 샘플 준비에 관한 어려움, 민감한 샘플에 대한 전자 선량 효과 및 합리적인 이미지 해석에 대해 논의합니다.

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프로토콜

1. 투과 전자 현미경 수정

1. 광섬유( 재료 표 참조)를 대물 렌즈 상단의 현미경 칼럼에 연결하여 투과 전자 현미경을 수정합니다. 대물 렌즈와 콘덴서 렌즈 사이에 몇 센티미터의 공간과 액세서리를 위한 여유 슬롯을 확보하십시오.
   참고: 전용 샘플 홀더(⁴ ) 또는 역구성(¹ )에서의 음극발광 관찰을 위한 홀더가 또한 사용될 수 있다.
2. 거친 진공 펌프를 사용하여 시스템에 누출이 있는지 확인하십시오. 시스템에 진공 누출이 표시되지 않으면 고진공 상태에서 시스템을 테스트합니다.
   1. 진공 시스템의 작동이 표준 배기 현미경 시작에서 벗어나지 않는지 확인하십시오. 모듈의 실행, 조립 또는 시운전에 문제가 있는 경우 공인 서비스 담당자 또는 장치 제조업체에 문의하십시오.
      알림: 올바르게 제작되고 장착 된 조명기는 전자 빔을 가리지 않습니다. 현미경 작동 중에 빔이 연속적으로 이동하면 비전도성 광섬유가 금속 실드로 충분히 덮이지 않고 전하가 축적됩니다. 이 경우 광섬유를 전도성 재킷 깊숙이 밀어 넣으십시오.
3. 광 다이오드 파워 센서를 사용하여 광도를 측정합니다( 재료 표 참조). 대물 렌즈의 극 조각 사이의 공간이 현미경 내부에서 측정할 수 없는 경우 샘플과 조명기의 형상을 측정하고 외부 측정 설정에서 이러한 조건을 재현합니다.
4. 현미경에 전자 선량 측정 시스템이 장착되어 있지 않은 경우 패러데이 컵( 재료 표 참조)으로 빔 전류를 측정하고 표본(²⁷)에 부딪히는 전자의 밀도를 수치적으로 계산하여 보정을 수행합니다.

2. 감광제로 박테리아 캡슐화

1. 탄소 코팅면을 상단으로 향하는 두 개의 교차 핀셋 사이에 비정질 탄소로 덮인 두 개의 처리되지 않은 TEM 그리드를 놓습니다. 그리드를 가장자리에 최대한 가깝게 잡습니다.
   참고: 특정 기판, 용액 및 샘플 조합의 경우, 공장 불순물을 제거하고 최대 친수성 표면(²⁸)을 얻기 위해 하나 또는 양쪽 메쉬 상의 글로우 방전을 사용하는 것이 유리할 수 있다. S. 아우 레 우스 박테리아 및 메틸렌 블루 용액의 예를 사용하여, 추가적인 글로우 방전 또는 플라즈마 세척없이 구리 그리드 상의 새로운 비 처리 탄소에 대해 가장 재현 가능한 최상의 결과를 얻은 것으로 결정되었다⁶.
2. 그리드 중 하나에 4μL의 박테리아 용액을 놓습니다. 샘플의 광학 밀도는 5-10 범위 여야합니다.
   참고: 연구에 사용된 박테리아를 배양물에서 정제하고 PBS 완충액에 분산시켰습니다. 예를 들어 음성 염색 방법을 사용하여 29,30,31 사용 가능한 확립된 프로토콜에 따라 신선한 샘플의 박테리아 농도를 확인하는 것이 좋습니다.
3. 60초 동안 기다렸다가 여과지를 사용하여 액체를 조심스럽게 닦아냅니다. 이 과정에서 전체 그리드 표면에 액체를 퍼뜨리십시오.
4. 4 μL의 감광제를 동일한 그리드에 놓습니다.
   참고 : 2 μg / mL 농도의 메틸렌 블루가 본 연구의 감광제로 사용되었습니다.
5. 5 초 후 액체를 닦아냅니다. 기판에 매우 얇은 액체 층을 남겨 둡니다.
6. 액체로 덮인 그리드 위에 마른 그리드를 빠르게 놓습니다.
7. 상단 그리드를 두 번째 그리드의 가장자리로 부드럽게 이동하고 핀셋을 사용하여 가장자리에서 기판을 짜냅니다.
   알림: 이 단계에서 일부 액체가 샘플에서 흘러나올 수 있으며, 이는 충분히 배출되지 않았음을 의미합니다. 그러나 이것이 반드시 액체 셀의 형성이 실패한다는 것을 의미하지는 않습니다.
8. 조심스럽게 짜기를 반복하십시오.
   알림: 핀셋을 90° 회전하여 핀셋이 테이블에 수직이 되도록 하고 두 핀셋의 끝이 열림/닫기 위치에 의존하지 않고 동일한 높이를 유지하도록 하여 이 단계를 수행하는 것이 더 쉽습니다.
9. 액체 셀을 핀셋 사이에 1분 동안 그대로 두십시오.
10. 준비가 완료된 직후 샘플을 TEM 홀더에 삽입하십시오.
    알림: 홀더 장착 플레이트/링의 장력은 기판이 액체를 내부에 부착하고 유지하는 데 도움이 됩니다.
    1. 가능하면 시편 홀더를 외부 펌핑 스테이션으로 펌핑하여 액체를 증발시켜 현미경의 오염을 줄입니다.

3. 액체-전자 선량 효과에서 박테리아 세포의 현장 TEM 관찰

1. 샘플을 현미경에 삽입합니다.
2. 저배율 모드에서 관찰을 시작하여 적절한 관찰 영역을 찾습니다.
   알림: 어두운 영역은 전자빔 산란으로 인해 액체일 가능성이 가장 높습니다.
   1. 관찰하는 동안 전자 선량을 가능한 한 낮게 유지하십시오. 노출 시간을 확장합니다(가속 전압 150kV 및 배율 5,000x의 경우 최대 2초). 하단 장착 카메라의 경우 5,000x 배율(대략적인 시야는 10μm)은 직경이 ~1μm인 박테리아를 이미지화하기에 충분합니다.
      참고 : 때로는 액체를 구별하기가 쉽지 않으므로 관찰을 시작할 때 액체 일 가능성이있는 곳에 전자빔을 집중시키는 것이 도움이됩니다. 액체는 집중된 전자빔 위로 움직여야 하며 기포가 나타납니다. 이 확인 후 추가 관찰을 위해 다른 영역을 찾아야합니다.
3. 노출 시간이 길어진 적절한 배율로 액체로 둘러싸인 세포를 찾아 첫 번째 이미지를 즉시 캡처합니다. 전자 선량을 일정하게 유지하고 30초마다 이미지를 수집하여 변화를 관찰합니다.
4. 이미지를주의 깊게 검사하고 세포의 첫 번째 가시적 변화에 해당하는 총 전자 선량²⁷ 을 계산하십시오.

4. 박테리아 세포와 감광제 사이의 광 유도 과정에 대한 현장 TEM 관찰

1. 실험을 시작하기 전에 현재 값을 조정하여 레이저 광 강도를 설정하십시오. 감광제의 흡수 스펙트럼에 따라 적절한 파장을 선택하십시오. 이전 보정 플롯(단계 1.4)에 따라 가장 낮은 광도에 해당하는 현재 값을 선택합니다.
   참고: 이 연구에 사용된 광 파장은 660nm였습니다.
2. 샘플을 현미경에 삽입하고 3.2단계에 따라 관찰 영역을 찾습니다. 이전 섹션에서.
3. 샘플의 조명을 시작하기 전에 셀의 첫 번째 이미지를 캡처하고 빔 블랭커를 사용하여 전자 빔을 꺼서 전자 조사의 영향을 피하십시오.
4. 레이저를 켭니다. 레이저 광의 강도가 상대적으로 높기 때문에 짧은 조명 시간(여기서는 30초)으로 시작하십시오. 그 시간이 지나면 광원을 끕니다.
5. 빔 블랭커를 끄고 즉시 이미지를 캡처하십시오. 가능하면 자동 알고리즘을 사용하여 이미지를 촬영하는 데 필요한 시간 동안만 샘플을 노출합니다. 전자 조사 시간을 조심스럽게 측정하여 영상화에 사용되는 전자 선량⁽²⁷ )을 계산한다.
6. 4.4단계를 반복합니다. 및 단계 4.5. 예상 조명 조명 시간을 얻습니다.

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결과

실험 설정은 고해상도로 액체에서 발생하는 광 유도 과정을 관찰하도록 설계되었습니다. 이미지의 경쟁 분석을 통해 전자빔으로 인한 손상과 광화학 반응과 관련된 변화를 구별 할 수있었습니다. 민감한 표본 (이 경우 액체로 캡슐화 된 세포)에 대한 전자빔의 효과는 전자가 균일하게 침투함에 따라 조사 된 영역 전체에서 볼 수있었습니다. 물론 효과는 전자 선량에 따라 다르므로 더 집중된 빔을...

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토론

조명기의 설치 및 시운전에는 기본적인 서비스 지식이 필요하며 현미경이 손상될 수 있습니다. 현미경에 빛을 도입하는 가장 간단한 방법은 일반적으로 TEM 편향 코일과 추가 검출기를 위한 공간이 있는 대물 렌즈 상단에서 광섬유를 연결하는 것입니다. 동일한 위치에 샘플 진공 잠금 장치와 샘플 설치 메커니즘이 있는 구형 상단 입력 장치에서도 더 많은 여유 공간을 기대할 수 있습니다. 이러한 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon film on 200 mesh copper grid	Agar Scientific	AGS160	The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover Tweezers	Dumont	N5	The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power Sensor	ThorLabs	S130C	The sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode Fiber	Thorlabs	FG400UEP	Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron Microscope	Hitachi	H-800	Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode Laser	CNI	MRL-III-660D	The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum