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요약

여기에서는 망막 정맥 폐색(RVO) 연구에서 형광 혈관 조영술(FA) 및 광학 간섭 단층 촬영(OCT) 이미지에 대한 세 가지 데이터 분석 프로토콜을 제시합니다.

초록

안과 영상 도구의 발전은 신경 혈관 손상의 동물 모델을 연구하는 연구자에게 전례없는 수준의 접근을 제공합니다. 이러한 더 큰 번역 가능성을 적절하게 활용하려면 이러한 이미지에서 정량적 데이터를 그리는 재현 가능한 방법을 고안할 필요가 있습니다. 광학 간섭 단층 촬영(OCT) 영상은 마이크로미터 분해능에서 망막 조직학을 해결하고 혈관 혈류의 기능적 차이를 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 망막 정맥 폐색(RVO)의 최적화된 마우스 모델에서 혈관 모욕 후 병리학적 손상을 특성화하는 데 사용하는 비침습적 혈관 판독을 설명합니다. 이러한 판독값에는 망막 형태의 라이브 이미징 분석, 모세관 허혈의 망막 내층 해체(DRIL) 측정, 망막 부종 및 혈관 밀도의 플루오레세인 혈관 조영술 측정이 포함됩니다. 이 기술은 클리닉에서 망막 질환 환자를 검사하는 데 사용되는 기술과 직접 일치합니다. 이러한 방법을 표준화하면 동물 모델을 안과 질환의 임상 표현형과 직접적이고 재현 가능한 비교가 가능하여 혈관 손상 모델의 번역 능력이 향상됩니다.

서문

신경혈관 질환은 사망률 및 이환율의 주요 원인인 허혈성 뇌졸중과시력 상실로 이어지는 망막 혈관 질환의 주요 의료 문제입니다1,2. 신경 혈관 질환을 모델링하기 위해 망막 정맥 폐색 (RVO)의 마우스 모델을 사용합니다. 이 모델은 비침습적이며 임상 환경에서 망막 혈관 질환이 있는 사람들을 검사하는 데 사용되는 것과 유사한 생체 내 이미징 기술을 활용합니다. 따라서이 모델을 사용하면이 모델을 활용하는 연구의 번역 잠재력이 증가합니다. 모든 마우스 모델과 마찬가지로 모델의 재현성을 극대화하는 것이 중요합니다.

망막 혈관 질환은 70 세 미만의 사람들의 시력 상실의 주요 원인입니다. RVO는 당뇨병성 망막병증3 다음으로 두 번째로 흔한 망막혈관 질환입니다. RVO의 특징적인 임상 특징에는 허혈성 손상, 망막 부종 및 신경 손실의 결과로 인한 시력 상실이 포함됩니다 3,4. 주요 혈관의 레이저 광응고를 사용하는 RVO의 마우스 모델은 인간 RVO 5,6,7에서 관찰된 주요 임상 병리를 복제하기 위해 개발 및 개선되었습니다. 안과 영상의 발전은 또한 인간에게 사용되는 비침습적 진단 도구, 즉 형광 혈관 조영술(FA) 및 광학 간섭 단층 촬영(OCT)의 복제를 허용합니다6. Fluorescein 혈관 조영술은 작은 형광 염료인 fluorescein의 주입을 사용하여 폐색 부위를 포함하여 망막의 혈류 역학뿐만 아니라 혈액 망막 장벽 (BRB)의 파괴로 인한 누출을 관찰 할 수 있습니다 8,9. OCT 이미징은 망막의 고해상도 단면 이미지의 획득 및 망막 층(10)의 두께 및 조직에 대한 연구를 가능하게합니다. FA 이미지의 분석은 역사적으로 대체로 질적이어서 연구 간의 직접적이고 재현 가능한 비교 가능성을 제한합니다. 최근에, OCT 이미징에서 층 두께의 정량화를 위한 많은 방법들이 개발되고 있지만, 현재 표준화된 분석 프로토콜은 없고, OCT 이미지 획득장소는 다양하다11. 이러한 도구를 적절하게 활용하려면 표준화되고 정량적이며 복제 가능한 데이터 분석 방법론이 필요합니다. 이 논문에서는 RVO- 플루오 레세인 누출, OCT 층 두께 및 망막 층의 해체에 대한 마우스 모델에서 병리학 적 손상을 평가하는 데 사용되는 세 가지 혈관 판독 값을 제시합니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 (ARVO) 성명서를 따릅니다. 설치류 실험은 컬럼비아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 모니터링되었습니다.

참고: 이미징은 무게가 약 23g인 2개월 된 C57BL/6J 수컷 마우스에서 수행되었습니다.

1. 망막 영상용 시약의 제조

  1. 주 사용 플루오레세인 용액의 제조.
    참고: 플루오레세인은 빛에 매우 민감합니다. 빛으로부터 보호하고 준비 직후에 사용하십시오.
    1. 플루오레세인을 멸균 식염수에서 1% 농도로 희석한다.
  2. 케타민/자일라진의 제조
    1. 케타민 (80-100 mg / kg) 및 자일 라진 (5-10 mg / kg)의 농도에 따라 멸균 식염수에 케타민과 자일 라진을 희석하십시오.
  3. 멸균 식염수
    1. 멸균 식염수로 26G 바늘로 5mL 주사기를 준비하십시오.

2. OCT 및 플루오레세인 이미징

  1. 망막 영상 현미경 라이트박스, OCT 기계 및 가열된 마우스 플랫폼을 켭니다.
  2. 컴퓨터를 켜고 이미징 프로그램을 엽니다.
  3. 각 눈에 페닐에 프린과 트로피 아미드 한 방울을 첨가하십시오.
  4. 150 μL의 마취제 (케타민 (80-100 mg / kg) 및 자일 라진 (5-10 mg / kg))를 복강 내 (IP)로 주사하십시오. 발가락 꼬집음으로 마취 깊이를 결정하고 동물이 반응이 없을 때까지 기다리십시오. 안과 용 연고 또는 인공 눈물을 양쪽 눈에 바르십시오.
  5. 플랫폼에 마우스를 수용하십시오.
  6. 망막 안저의 시야가 선명하고 초점이 맞춰질 때까지 플랫폼의 높이와 각도를 조정하십시오. 안저 사진을 찍습니다.
  7. 이미징 및 OCT 소프트웨어를 엽니다. OCT 프로그램에서 넛지를 5로 조정합니다.
  8. 화상에서 75μm 떨어진 곳에서 OCT 이미지를 촬영합니다. 망막의 다른 세 사분면에 대해 반복하십시오.
  9. 1% 플루오레세인 IP 100μL를 주입한다.
  10. 카메라를 488nm 필터로 전환합니다. 카메라 게인을 5로 늘립니다.
  11. 플루오레세인 주사 후 정확히 5분 후에 안저 사진을 찍습니다.
    알림: 플루오레세인은 망막 광 손상을 악화시킬 수 있으므로 최대 설정에서 카메라 조명에 눈을 장기간 노출시키지 마십시오. 5분의 대기 시간이 경과하고 마우스를 이미징할 준비가 될 때까지 광원을 끄십시오.

3. 애프터 케어

  1. 1mL의 멸균 식염수 IP를 주입합니다. 윤활제 점안액을 양쪽 눈에 바릅니다. 안과 용 연고 또는 인공 눈물을 양쪽 눈에 바르십시오.
  2. 마우스가 마취에서 회복되는 것을 관찰하십시오. 완전히 회복 된 경우에만 다른 동물과 함께 케이지로 돌아갑니다 (일반적으로 약 40 분 후).

4. 제외 기준 평가

  1. 시술 후 24시간에 촬영한 안저 이미지를 열어 제외 기준을 평가합니다. 다음 기준 중 하나라도 확인되면 눈을 제외하십시오.
  2. 이미지에 폐색이 없는지 평가
    1. 폐색된 혈관의 수에 대한 이미지를 평가합니다.
      알림: 성공적인 폐색은 일반적으로 화상 위 또는 주변에 약간의 자주색 색소 침착, 화상을 통한 매우 얇거나 불연속적인 혈관, 화상 영역 외부의 희미하거나 존재하지 않는 혈관 모양, 저산소증으로 인한 망막 변색이 있습니다. 레이저에 의해 흰색 화상을 통해 전체 혈관을 볼 수 있다면 혈관이 폐색되지 않았습니다. 때로는 혈관이 부분적으로 막힌 것처럼 보이지만 화상 외부에서 방해받지 않는 것처럼 보이면 혈관이 폐색되지 않았을 가능성이 큽니다.
    2. 모호한 경우, 동시에 FA 이미징을 사용하여 교합을 평가합니다. 이 이미지에서 폐색은 종종 주변 혈관의 테이퍼링과 함께 용기의 연속성이 끊어지는 것처럼 보입니다.
    3. 제로 폐색이 확인되면 RVO가 효과가없는 것으로 간주되므로 분석에서 눈을 제외하십시오.
      참고: 폐색은 일반적으로 RVO 후 48-72시간까지 해결되며 폐색의 존재는 더 이상 이러한 시점에서 제외 기준으로 사용되어서는 안 됩니다.
  3. 과도한 망막 박리에 대한 안저 및 OCT 이미지 평가
    알림: 망막하 유체 축적은 RVO 유도 후 흔하며 RPE에서 신경 망막이 분리됩니다. 과도한 망막 박리에 대한 제외 기준은 다음과 같이 정의됩니다 : OCT는 완전히 볼 수 없거나 일부 레이어가 엄청나게 왜곡되어 나타납니다. 이미지 품질이 좋지 않으며 외부 플렉시 폼 및 RPE 레이어의 해상도가 손실됩니다. 신경 망막과 맥락막 사이의 간격은 OCT 시야가 허용하는 것보다 큽니다. 안저 이미지에서 망막 톤은 거의 완전히 흰색이며 약간의 보라색 얼룩이 있습니다. 망막의 일부가 왜곡되어 초점이 맞지 않을 수 있습니다. 이것은 망막이 분리되어 망막의 나머지 부분과 다른 초점 거리에 있기 때문입니다.
    1. 눈에서 이미지를 평가하여 망막의 말초 또는 완전한 분리를 결정하는 경우 분석에서 눈을 제외하십시오.
  4. 각막 백내장의 증거가 있는 이미지 제외
    참고: 각막 백내장은 마우스의 각막에 불투명한 흰색 점으로 나타납니다. 백내장은 일반적으로 동물이 마취되는 동안 눈의 윤활이 충분하지 않아 발생하며 눈 연고를 넉넉하게 바르면 크게 피할 수 있습니다. 백내장은 일반적으로 동물을 검사하여 영상화 전에 확인할 수 있습니다. 백내장이 발생한 마우스는 이미징 과정을 거칠 필요없이 데이터 세트에서 제외해야합니다. 영상에서 백내장은 카메라에서 망막을 가리고 OCT가 뒤틀린 것처럼 보입니다.
  5. 과도한 출혈에 대한 이미지 평가
    참고: 과도한 출혈은 이미지에서 붉은 액체의 양으로 식별될 수 있으며 일반적으로 망막 배경, 혈관 및 화상을 가립니다. 이러한 빨간색 유체 영역은 성공적인 RVO에서 정상적인 보라색 얼룩보다 더 밝고 불투명한 빨간색입니다. 출혈은 OCT 영상에서 신경절 세포층에 나타나며 출혈 아래의 다른 망막층을 시각화하는 능력을 방해합니다.
    1. 이미지에 과도한 출혈이 있는 것으로 판단되면 분석에서 눈을 제외합니다.

5. 플루오레세인 이미지 처리

  1. 이미지 처리 소프트웨어에서 플루오레세인 이미지를 엽니다.
  2. 이미지 복제
  3. 선택 도구를 사용하여 주요 선박을주의 깊게 추적하십시오.
    1. 주요 혈관은 시신경에서 방사되는 두꺼운 정맥과 동맥입니다. 이 선박에서 분기되는 선박은 무시하십시오.
    2. 누출로 인해 용기의 윤곽이 폐색 부위 근처에서 보이지 않으면 용기의 대략적인 위치에서 누출을 추적하십시오 (두께 유지, 마지막 가시 점을 다음 가시 지점에 연결).
  4. 첫 번째 이미지에서 배경 만 남기고 선택 항목을 삭제하십시오. 이 마스크된 이미지를 저장합니다.
  5. 선택 영역을 두 번째 이미지로 이동하고 선택 영역을 반전하고 삭제하여 용기를 분리합니다. 이 마스크된 이미지를 저장합니다.
  6. ImageJ에서 두 이미지를 엽니다. 배경 이미지를 열고 통합 밀도를 측정합니다.
  7. 용기의 이미지를 열고 혈관의 윤곽을 선택한 다음 평균 강도를 측정합니다.
  8. 배경의 통합 밀도를 혈관의 평균 강도로 나누어 눈의 누출 비율을 생성합니다.
  9. 실험 코호트에서 각 눈에 대한 이 누출 비율을 기록합니다.
  10. 배경을 추가로 제어하려면 실험용 눈을 다치지 않은 대조군 눈의 평균 누출 비율로 정규화합니다.
    참고: FA 이미지에서 플루오레세인 누출의 표준화된 정량화를 생성하기 위해 이 계산은 배경 밀도(누출이 있는 위치)와 주요 용기의 밝기의 비율을 사용하여 이미지에서 이미지로의 밝기 변화를 제어하는 결과를 생성하고 안정적으로 정량화할 수 있습니다. 손상되지 않은 눈은 누출이 없으며 이론적으로 비율이 0이어야합니다. 따라서 손상되지 않은 대조군 눈에서 계산된 비율은 배경 소음을 나타내며 이 값은 실험 값을 추가로 정규화하는 데 사용됩니다.

6. 망막 층 두께

  1. 이미지 처리 소프트웨어에서 OCT 이미지를 엽니다.
  2. 신경절 세포층, 내부 플렉시 폼 층, 내부 핵층, 외부 플렉시 폼 층, 광 수용체 층 및 RPE 층의 경계를 추적하십시오. 각 층의 평균 두께를 측정합니다.
  3. 망막의 다른 세 사분면의 OCT 이미지에 대해 반복합니다. 눈에 대한 각 망막 층의 평균 두께를 얻기 위해 4 개의 사분면에 걸친 평균 층 두께를 평균화합니다.
  4. 실험 코호트의 각 눈에 대해 반복합니다.

7. 망막 내층의 무질서 (DRIL)

  1. 이미지J에서 OCT 이미지를 엽니다.
  2. 선 도구를 사용하여 외부 플렉시 폼 레이어의 상단 경계가 불분명 한 거리를 측정합니다.
    참고: DRIL과 이미징 아티팩트로 인한 레이어 가시성이 좋지 않은 영역을 구별하는 것이 중요합니다. OCT 이미지 품질이 좋지 않으면 충분한 이미지 해상도가 불가능한 경우 DRIL 분석에 대한 눈이 무효화될 수 있습니다. DRIL이 있는 이미지에는 일반적으로 명확하게 분해되고 구성된 다른 영역 또는 망막 층이 있으며, 이는 충분한 이미지 품질을 나타내는 좋은 지표가 될 수 있습니다.
    1. 무질서가 시작되는 위도에서 외부 플렉시 폼 층의 상단 경계가 다시 보이는 위도까지 수평으로 측정하십시오. 외부 플렉시 폼 층이 수직으로 위 또는 아래로 이동하더라도 완벽하게 수평으로 측정하십시오.
    2. 무질서한 영역으로 구분된 여러 무질서 영역이 있을 수 있습니다. 이를 개별적으로 측정하고 거리의 합을 계산하십시오.
  3. 무질서의 길이를 각 OCT 영상에서 볼 수 있는 망막의 전체 길이로 나누어 영상에 대한 무질서의 비율을 구합니다.
  4. 망막의 다른 세 사분면의 OCT 이미지에 대해 측정 및 계산을 반복합니다.
  5. 4개의 OCT 이미지에서 무질서 비율의 평균을 취하십시오. 이 숫자는 전체 망막의 평균 무질서를 나타냅니다. 실험 코호트의 각 눈에 대해 반복합니다.

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결과

이러한 분석 방법을 통해 FA 및 OCT 영상으로 캡처 한 망막 병리의 정량화를 가능하게합니다. 대표 데이터를 추출한 실험은 손상되지 않은 대조군 역할을 하거나 RVO 절차를 거치고 Pen1-XBir3 치료 안약 또는 Pen1-식염수 차량 안약을 받은 C57BL/6J 수컷 마우스를 사용했습니다. RVO 손상 모델은 광활성제 염료12인 로즈 벵갈의 꼬리 정맥 주사 후 마취된 마우스의 각 눈에 있는 주요 정맥의 ...

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토론

비침습적 설치류 망막 영상은 병리학을 연구하고 중재를 개발할 수 있는 방법을 제시합니다. 이전 연구에서는 RVO의 마우스 모델을 개발하고 최적화하여 가변성을 제한하고 쥐 망막 5,7,13에서 일반적인 임상 병리의 신뢰할 수있는 번역을 허용했습니다. 안과 영상 기술의 발전은 실험 동물에서 FA 및 OCT와 같은 임상 생체 내

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공개

저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램(NSF-GRFP) 보조금 DGE - 1644869(CKCO), 국립 안과 연구소(NEI) 5T32EY013933(AMP), 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(RO1 NS081333, R03 NS099920에서 CMT), 국방부 육군/공군(DURIP에서 CMT).

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AK-Fluor 10%AkornNDC: 17478-253-10light-sensitive
CarprofenRimadylNADA #141-199keep at 4 °C
GenTealAlcon00658 06401
Image JNIH
InSight 2DPhoenix Technology GroupOCT analysis software
Ketamine HydrochlorideHenry ScheinNDC: 11695-0702-1
PhenylephrineAkornNDCL174478-201-15
Phoenix Micron IVPhoenix Technology GroupRetinal imaging microscope
Phoenix Micron Meridian ModulePhoenix Technology GroupLaser photocoagulator software
Phoenix Micron Optical Coherence Tomography ModulePhoenix Technology GroupOCT imaging software
Phoenix Micron StreamPix ModulePhoenix Technology GroupFundus imaging and acquisition targeting
PhotoshopAdobe
RefreshAllergan94170
TropicamideAkornNDC: 174478-102-12
XylazineAkornNDCL 59399-110-20

참고문헌

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