Drosophila의 유충에서 냄새 기반 행동의 고해상도 측정

요약

이 비디오를 문서에서, 우리는 안정적이고 제어 형상과 odorant의 그라디언트의 건설을 허용하는 새로운 방법을 설명합니다. 우리는 간단히 다음과 그라디언트가 후각 결함 (전체 및 부분 후각 상실증)의 화면으로 사용할 수있는 방법을 설명하고 chemotaxis 행동보다 미묘한 기능을 연구하기 위해 서요.

초록

Drosophila의 애벌레에 후각 응답은 전통적으로 한 주변 냄새 소스로 구성된 배양 접시에서 공부했습니다. 이 행동 패러다임에서 실험자는 일반적으로 소스에서 odorant 분자의 급속한 확산은 접시에 안정적인 그라디언트의 창출로 연결한다고 가정합니다. 감각 입력 및 행동 반응 사이의 양적 상관 관계를 확립하려면, 그것은 odorant의 자극 조건보다 철저한 특성화를 달성하기 위해 필요합니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 안정적이고 제어 형상과 odorant의 그라디언트의 건설을 허용하는 새로운 방법을 설명합니다. 우리는 간단히 다음과 그라디언트가 후각 결함 (전체 및 부분 후각 상실증)의 화면으로 사용할 수있는 방법을 설명하고 chemotaxis 행동보다 미묘한 기능을 연구하기 위해 서요.

프로토콜

1. 장비 및 시약

악취 dilutions :

• 파라핀 오일 (시그마, CAS 번호 : 8012-95-1)
• Drosophila의 애벌레 ¹ 매력을 elicits 가장 높은 순도 제공의 냄새. 이 동영상이 문서에서는 동물 isoamyl 아세트산 (123-92-2 시그마, CAS 번호)에서 테스트되었습니다.
• 테플론 캡과 1.5ml 유리 튜브 (애질런트 테크놀)
• 무게로 정확한 희석 디지털 측정 스케일

설정 분석 분야 :

• 아가로 오스 (Promega)
• 96 - 웰 Microplate (353,071 BD 팔콘, 카탈로그 번호)의 뚜껑. 우리의 행동 경기장은 세 스택 뚜껑으로 구성되어 있습니다.
• 단일 채널 1-20 μl pipetter 또는 다중 채널 pipetter 스택의 상단 뚜껑에 odorant 비말 (들)을 로드할 수 있습니다. 여러 소스 분석을 설정하기 위해, 우리는 비가 5-50 μl Pipet - Lite는 다중 채널 pipetter를 사용합니다.

행동 시험 Drosophila의 준비 애벌레 :

• 15 % (w / w) 자당 솔루션
• 일반 배양 접시 (BD 팔콘)가 애벌레를 씻어 및 저장
• 애벌레를 조작하고 전송하는 페인트 - 브러시 (4~5밀리미터 브리슬 길이)

애벌레 운동 녹음 :

• 무대에 애벌레를 전송하는 평평한 머리 작은 핀
• 포셉 또는 녹음 후에 애벌레를 제거하는 페인트
• 단일 비 가열 광원과 조명 무대는 "슬림 엣지"라이트 패드가 로건 전기 제조
• 에 내각은 행동 무대 및 제어 조명 조건을 서라운드
• 동물 운동의 녹음 영상 추적 시스템입니다. 우리는 Ethovision 소프트웨어 (Noldus, 네덜란드)를 사용하고 있습니다.
• CCD 카메라와 프레임 그래버 비디오 카드 (기본 EureCard 피콜로)는 Ethovision 소프트웨어를 구입한
• 행동 검사 (옵션) 동안 대기 상태를 모니터링하는 온도계와 습도 레코더
• 사용자 정의 데이터 분석을위한 Matlab (Mathworks) (옵션)

2. 행동 아레나

행동 경기장은 세 스택 96 - 웰 접시 뚜껑으로 구성되어 있습니다. 하단 덮개는 빛을 패드에서 시스템의 나머지 부분을 분리하고, 경기장에서 대류를 줄이기 위해 사용됩니다. 3 % 아가로 오스 겔의 25ml 덮여 두 번째 뚜껑은 걸을 수 애벌레를위한 무대로 활동하고 있습니다. 상단 뚜껑은 표면 장력에 의해 중단 남아있는 냄새 방울을 보유하고 있습니다.

악취 방울은 96 잘 접시 뚜껑의 우물에 직접 pipetted 있습니다. 하나 또는 여러 개의 냄새 소스는 별개의, 검증 프로필 ² 그라디언트를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 후각 상실증과 애벌레의 chemotaxis 결함에 대한 테스트하기 위해, 우리는 다음 두 assays를 사용하여 제안합니다.

2.1. 단일 악취 소스 분석 : 잘 # E7에서 낳은 하나의 악취 소적 (표준 96 - 웰 플레이트 참조 시스템).

• 자극 : 파라핀 오일에 희석 냄새의 10μl
• 초기 조건 : 하나의 유충은 악취 소스 (또는 가까운 이웃)의 도입입니다.
• 기본 관측 : 매력적인 자극 (예 isoamyl 아세테이트), wildtype의 애벌레는 소스 아래에 축적. 후각 결함 대상이 Anosmic 동물이나 동물 신속하게 떨어져 비말에서 방황.
• 시험 기간 : 3 분. 시험 시간이 즉시 동물 연락처 접시의 벽 경과하거나 때까지 해당 동물의 움직임이 기록됩니다.
• 행동 부량에 대한 가능성이 통계 : 악취 소스를 중심으로 작은 원형 영역에서 동물에 의해 소비 시간의 비율, 악취 소스에 거리를 의미, 악취 소스에 거리 시간 코스 등

이 분석을 효율적으로 돌연변이 애벌레의 기본 후각 상실증에 대한 테스트합니다. 또한 안정적으로 특정 냄새 ² 검출 임계값을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

2.2. 여러 악취 소스 분석

여러 냄새 방울은 상단 뚜껑의 우물에 누워있다. 현재 동영상 기사에서는, 우리는 여섯 방울 총은 (표준 96 - 웰 플레이트 참조 시스템 우물 # E2 # E4, # E6, # E8, E12 # E10와 #에서 소개한 중앙 행 E. 따라 그라디언트를 설정 ). 페트리 접시 및 단일 악취 소스 assays와 대조적으로, 여러 악취 소스 분석은 경기장의 길이와 넓이를 따라 설립된 구배 형상의 질적 제어할 수 있습니다. 이 분석은 chemotax ² Drosophila의 유충을 허용 감각 메커니즘을 특징으로 사용되었습니다.

• 자극 : 10μl 악취 방울이 행을 따라 우물을 번갈아에 누워 있습니다. 이 협정 그라디언트 선택한 행을 중심의 창조에 이르게한다. 경기장의 넓이 따라 동질적인 그라데이션을 설정하려면 여러 행이 여러 소스와 함께 로드할 수 있습니다.
• 초기 조건 : 하나의 유충은 우물 # E3와 # 사이의 악취 소스 아래에 소개E4.
• 기본 phenotypes : anosmic 애벌레가 시작 지점에서 무작위로 방황. 에 대한 매력적인 자극 (예 : isoamyl 아세테이트), 증가 악취 농도의 방향을 따라 이동 냄새를 맡을 수 있습니다 동물. 동물은 냄새의 흔적을 ascends있는 정확성은 odorant의 자극을 감지하고 처리하는 능력과 상관 있습니다. 고통스러운 경로는 종종 감각 결함에 의해 발생합니다. 일단 동물이 재판에서 높은 농도의 지점에 도달했습니다, 그것은이 위치의 주변에 남아 있습니다.
• 시험 기간 : 3 분 최대 (애벌레들이 흥미를 잃게하고 결국 그라디언트를 포기로 더 이상 추적 기간이이 노이즈를 소개하는 경향). 동물이 가장 높은 농도 소스 (물론 # E12)의 이웃에 도달하기 전까지이 동영상이 문서에 설명된 그라디언트 들어, 개인 유충의 움직임이 기록되었다. 동물이 목표 지점에 도달하거나 경기장의 장벽을 연락과 같은 기록이 즉시 중지되었습니다.
• 행동 부량에 대한 가능성이 통계 : odorant 라인 (파란색 사각형)에서 동물에 의해 소비 시간의 비율, 악취 기울기의 로컬 방향과 관련하여 제목 의미, 결합 chemotaxis 점수는 odorant를 따라 동물의 세계 경향을 측정 라인 ^2.

3. 그라데이션 프로필 확인

특히 경사도에 애벌레를 테스트하기 전에, 그것은 시간이 경과함에 따라 안정성을 결정하는 것이 중요합니다. 이 기초에서 실험자 각 재판에 대한 적절한 기간과 같은 경기장에서 순차적으로 추적할 수 있습니다 유충의 수를 확인할 수 있습니다. 그라디언트의 안정성을 테스트하기 위해, 우리는 IR 분광 ² 기반 방식을 개발했습니다. 이 방법은이 프로토콜의 범위를 벗어납니다 더욱 정교되지 않습니다.

4. 실험의 준비를 위해 프로토콜

4.1. 아가로 오스 플레이트 및 악취 dilutions의 준비 :

1. 1. 96 - 웰 접시 뚜껑의 플랫 톱에 3퍼센트 아가로 오스의 25ml를 붓고, 아가로 오스는 진정 및 응고 (~ 30 분) 수 있습니다.
   
   중요 사항 : 96 - 웰 뚜껑은 애벌레의 동작에 영향을 미칠 수있는 경화 아가로 오스 겔에 경사의 존재로 아가로 오스를 따르고 전에 평면 표면에 있는지 확인합니다. 젤 붓는 경우, 표면에 양식있는 거품을 제거합니다.
   
   
2. 2. 정확하게 각각의 희석에 파라핀 오일과 냄새의 양을 측정하는 디지털 척도를 사용하여 파라핀 오일에 원하는 농도로 희석 냄새.

참고 : 낮은 악취 농도를 사용하는 경우, 그것이 일련 dilutions에 따라 소스 농도 세트를 준비하는 것이 바람직합니다. 1.0M 솔루션과 함께, 예를 들어, 시작하고 솔루션 0.5M 얻을 수 1시 2분 희석을 수행합니다. recurrently 진행함으로써, 하나는 0.5M 기하 급수의 1.0M, 0.25M, 0.12M, 0.06M, 0.03M, 0.015M 다음 희석 시리즈를 얻습니다.

중요 사항 : 많은 유기 냄새 플라스틱과 반응 때문에, 악취 dilutions는 테플론 마개로 유리 튜브에 저장해야합니다. 각각의 실험을 실험을 통해 실제 냄새 농도의 변동을 줄이기 위해 전에 이상적으로, 냄새가 신선 준비되어야합니다. 높은 휘발성 화학 물질을 사용하는 경우 이것은 특히 사실이다.

4.2. 애벌레 준비 :

1. 1. 증류수에서 15 %의 자당 솔루션을 준비합니다.
   
   참고 : 15 % 자당 솔루션은 유충보다 밀도이며 그들이 솔루션의 표면에 용기도록합니다. 그러나, 소화 되 다만 플라이 식품 청크는 솔루션보다 큰 밀도를 가지고 빠르게 아래로 침몰. 따라서,이 자당의 솔루션을 사용하면 음식에서 애벌레를 분리의 효율적인 수단을 제공합니다. 자당 솔루션은 생물 학적 오염 물질에 대한 뛰어난 매체입니다, 솔루션은 흐린되지 않는 경우는 필터 오염을 제거하는 소독 수 있습니다.
   
   
2. 원하는 발달 단계에서 6 일 된 애벌레 또는 유충이있는 유리병을 구합니다.
   
   참고 : 모든 실험은 6 일 이전 애벌레 (3 instar 발달 단계의 중간)으로 진행되며이 발달 단계에서 애벌레는 우리 추적 소프트웨어를 검출의 용이성을 위해 충분히 큰뿐만 아니라, 매우 적극적으로.
   
   
3. 애벌레가 들어있는 식품 약병에 자당을 하거라.
4. 주걱을 사용하여, 헤어지고 그리고 애벌레를 공개 부드럽게 파리 음식을 디졸브. 출시 애벌레는 표면까지 떠 것입니다.
5. 파리 식품 덩어리 몇 분 유리병의 바닥에 싱크 허용, 다음 페트리 접시에 자당과 애벌레를 부어. 애벌레의 사전 선택이 필요한 경우, 동물은 필터를 통해 자당를 따르고 회수하실 수 있습니다. 애벌레는 다음 페인트와 선택을위한 요리로 전송하실 수 있습니다.
6. S에서 약 30 분 동안 애벌레를 남겨주세요동물 자당 솔루션에 길들 수 있도록 행동 검사하기 전에 ucrose 솔루션입니다. 유충은 자당에 피드에 나타나지 않는로서, 동물 chemotaxis 성능을 향상 굶주림의 상태를 경험하게됩니다.
7. 페트리 접시의 뚜껑은 물 (또는 자당)으로 가득하고 행동 검사 후 폐기 동물 소켓으로 사용할 수 있습니다.

5. 프로토콜 행동 레코딩을 수행하기 위해

5.1. 아레나 설정 :

1. 1. 새로운 96 - 웰 접시 뚜껑의 아래쪽 (던걸 쪽)에 악취 방울을 적용합니다.
   
   중요 : 다른 냄새와 악취 농도의 오염을 피하기 위해 새로운 뚜껑은 각 로딩 설정을 위해 사용해야합니다. 냄새 소스가 들어있는 뚜껑 아무도는 실험 후 재활용되지 않습니다. 사용되는 악취 농도 범위에 따라 odorant의 기울기는 닫힌 체계에서만 10-20분위한 안정 발견되었습니다. 그라디언트 설정과 행동 검사의 실제 시작 사이의 시간을 최소화하는 것이 중요하다.
   
   
2. 뚜껑을 반전하고 3% 아가로 오스 레이어와 코팅 두 번째 뚜껑 위에 그것을 스택.
   
   중요 사항 : 인접한 웰스에 퍼지는 악취 방울을 방지하기 위해 조심스럽게 뚜껑을 반전.
   
   
3. 아가로 오스의 표면에 상단 덮개의 역전되면 그 냄새가 유충을 도입하기 전에 30 초 동안 주워 수 있습니다.

5.2. 로딩 애벌레 :

1. 충분히 유충의 로딩 있도록 odorant의 방울이 들어있는 최고 뚜껑을 들어 봐요.
2. 자당 솔루션의 아가로 오스 층에 유충을 전송합니다. 동물의 시작 위치는 사용중인 분석에 따라 다릅니다 :
   
   단일 악취 소스 분석을 위해, 애벌레는 odorant 비말에 따라 공개됩니다.
   
   여러 악취 소스 분석을 위해, 애벌레는 우물 # E3 E4와 # 사이에 발표됩니다.
   
   중요 : 동양 일관된 방식으로 새로 도입된 동물. 우리 동양 그라디언트 방향으로 우리의 동물, 동물 몸체와 머리가 가장 높은 농도를 얼굴 있도록. 그라디언트의하는 오리 엔테이션 맞은편에 도입된 동물 검색 동작을 시작합니다. 우리의보기에서,이 초기 검색 기간은 소음의 불필요한 소스를 나타냅니다. 머리 방향을 제어하는​​ 것은 그들의 탐험 행동을하는 동안 무대 벽에 연락 동물의 수를 줄일 수 있습니다. 이 연습은 총리 동물의 움직임의 방향이나 크게 우연히 odorant 라인을 따라 chemotaxing anosmic 동물의 숫자를 증가시키지 않습니다 (냄새 테스트에서 즉 거짓 양성).
   
   
3. 상단 뚜껑을 교체하고 즉시 녹화를 시작합니다.
   
   참고 : 건강한 유충이 분야에서 도입 즉시 크롤 링을 시작하고 처음 10 초 이내에 1cm의 거리를 커버 수 있습니다. 실험자의 녹화를 시작에서 속도가 느린 경우, 초기 datapoints가 손실됩니다. 이런 이유로 우리는 실험자 잘 실험을 실행하기 전에 녹화를 시작하기 위해 소프트웨어 명령으로 알게되는 것이 좋습니다.
   
   
4. 유충의 기록 (일반적으로 3 분 소요)의 기간 동안 동작하도록 허용합니다.
   
   참고 : 애벌레, 경기장 벽에 도달할 또는 대상 지역 (예 : 그라디언트 분석에서와 같이)에 도달하면 레코딩이 3 분 끝나기 전에 종료됩니다.
   
5. 기록의 끝에, 즉시 뚜껑을 들고 포셉 또는 페인트로 유충을 제거합니다. 페트리 접시 뚜껑이 포함된 물 (또는 자당)의 추적 동물 놓습니다.
   
   중요 사항 : 기록 동물 재사용되지 않습니다. 물 접시는 단지 실험을 실행하는 동안 녹음을 취소 기록된 동물을 구분하는 편리한 소켓입니다.
   
6. 경기장에서는 여러 동물을 추적하는 설정을 경우, 즉시 다음 유충를로드 이상 그림과 같이 녹화를 시작합니다.
   
   중요 : 동일한 분야 설정에서 수행한 시험의 번호가 어떤 행동 실험 ^2를 수행하기 전에 확인되어야 그라데이션 안정성에 기초하여 결정되어야합니다.
   
7. 일단 경기장 설정 추적 및 분야에서 제거된 아래의 테스트 모든 애벌레는 상단 덮개와 아가로 오스 계층을 삭제. 중간 뚜껑이 (아가로 오스의 뚜껑 IE) 재활 용할 수 있습니다.
   
   참고 : 우리는 '배경 빼기'검출 방법을 선택할 수 Ethovision 사용자 좋습니다.

6. 비디오 문서의 증명 샘플 실험

6.1. isoamyl 아세테이트의 1.0M 단일 악취 소스 분석.

번호가 할당되었습니다 각에 돌연변이 십 야생 유형 (W1118) 애벌레 - 우리는 무조건 열 Or83b - /를 테스트했습니다. 추적 실험음 각 동물의 유전자형에 대한 정보를받지 못했습니다. 축적이 전체 시험의 소스에 따라 관찰 있었다면 smellers, 경로가 빠르게 악취 소스의 주변을 왼쪽이 아닌 smellers 경우 : 각 녹화 후 예측 표현형는 테스트를 각각의 동물에 할당되었습니다. 20 동물의 행동을 기록하는 데 후, 경로 표현형에 따라 그룹화되었습니다. 이 그룹의 결과가 다음 애벌레의 실제 유전자형과 비교되었습니​​다 만든 모든 할당은 올바른 것으로 판명되었습니다.

6.2. isoamyl 아세테이트의 지수 및 선형 그라디언트로 여러 냄새 소스 분석.

본 실험에서 우리는 선형 및 지수 기울기를 따라 chemotaxing 야생 타입 애벌레의 공연을 비교했다. Chemotactic 행동은 0.5M 같은 높은 농도로 설정이 그라디언트를 위해 기록되었다. 마찬가지로 문서에 설명된 지수 그라디언트의 악취 소스 0.015과 0.5M 사이였다. 선형 그라디언트의 소스는 0.25와 0.5M (일반적인 차이가 0.​​05M로 산술 급수) 사이였다.

선형 기울기는 농도의 지역 차이가 일정하고 상대적으로 작았로 더 도전 chemotaxis 환경을 표현하고, 좁은 농도 범위 (0.25M). 반면, 지수 그라디언트의 농도 범위는 오솔길을 따라 농도 지역의 차이를 증가와 함께 큰했다.

피프틴 애벌레는 두 그라데이션 형상의 각 하나의 그래프에 겹쳐 경로에 대해 기록했다. 두 그래프의 시각적 검사는 야생 타입 애벌레 모두 형상에 대한 경사도를 안정적으로 승천 수 있다고하지만, 민더링의 금액은 선형 그라디언트 조건에 대한 큰 것을 보여줍니다. 이것은 그라디언트의 길이를 따라 신호 현재가 더 안정적으로 선형 하나 이상의 기하 급수적인 형태에 대한 감지하는 것이 좋습니다.

6.3. "지붕"기하학에 isoamyl 아세테이트 기울기와 여러 냄새 소스 분석.

여기서 우리는 냄새 기울기 도입 애벌레 오히려 냄새의 단지 존재 또는 부재 이상의 악취 농도의 로컬 변화에 민감하고 있는지 확인합니다. 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 0.25, 0.12M : isoamyl 기울기는 다음과 같은 농도와 냄새 방울의 응용 프로그램에 의해 설립되었습니다. 다음의 기울기 기하학은 0.5M에 peaking 비대칭 '지붕'을 닮은.

애벌레는 0.06M 0.12M 악취와 방울 사이에 발표했습니다. 우리의 가설은 애벌레가 단순히 냄새의 존재를 계산한다면 그들은 농도 최대 특정 선호하지 않고 전체 그라디언트를 수행 것이라고했다. 반대로, 만약 애벌레들은 0.5M 비말 아래 모이게 집중 지역 변화에 민감합니다. 피프틴 애벌레는 기록했고, 그것은 짧은 탐험 기간 동안 다음과 같은 모든 애벌레 잘 높은 농도 아래 축적된 것을 발견했다. 이것은 냄새의 농도 로컬 변경 사항은 계산 및 Drosophila의 애벌레의 chemotactic 행동을 알려야하는 것이 좋습니다.