갓 분리된 일차 마우스 간세포로의 Cas9 리보뉴클레오단백질 및 mRNA의 전기천공-매개 전달

요약

이 프로토콜은 간으로부터 원발성 마우스 간세포를 단리하고 리보뉴클레오단백질 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9를 전기천공하여 간장의 유전된 대사성 질환과 관련된 치료적 표적 유전자를 교란시키는 기술을 기술한다. 기술된 방법은 전기천공 후 높은 생존력과 높은 수준의 유전자 변형을 초래한다.

초록

이 프로토콜은 원발성 마우스 간세포를 단리하기 위한 빠르고 효과적인 방법에 이어 리보뉴클레오단백질(RNPs) 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9의 전기천공 매개 전달을 기술한다. 일차 마우스 간세포는 3단계 역행 관류 방법을 사용하여 분리하여 간 당 최대 50 × 10,6 세포의 높은 수율과 >85%의 세포 생존율을 초래하였다. 이 프로토콜은 간세포를 플레이팅, 염색 및 배양하기 위한 상세한 지침을 제공합니다. 결과는 전기천공이 녹색 형광 단백질(GFP) 양성 세포의 백분율로 측정되는 89%의 높은 형질감염 효율과 마우스 간세포에서 >35%의 겸손한 세포 생존율을 제공한다는 것을 나타낸다.

이러한 접근법의 유용성을 입증하기 위해, 하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 유전자를 표적화하는 CRISPR-Cas9를 원발성 마우스 간세포 내로 전기천공하여 간장의 유전된 대사성 질환(IMD)과 관련된 치료 유전자를 교란시키는 원리 증명 유전자 편집으로서 하였다. mRNA를 사용한 47% 편집 효율에 비해 RNP에 대해 78%의 더 높은 온-타겟 편집이 관찰되었다. 간세포의 기능성은 RNP 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9를 전달하는 것이 원발성 마우스 간세포에서 필적할만한 세포 생존율을 초래한다는 것을 나타내는 알부민 검정을 사용하여 시험관내에서 평가되었다. 이 프로토콜에 대한 유망한 응용 프로그램은 간에 영향을 미치는 인간 유전 질환에 대한 마우스 모델의 생성입니다.

서문

간장의 IMD는 독성 대사 산물의 축적으로 이어지는 신진 대사에 관여하는 중요한 간 효소의 결핍을 특징으로하는 유전 질환입니다. 치료를받지 않으면 간 IMD가 장기 부전 또는 조기 사망 ^1,2를 초래합니다. 간장의 IMD 환자를위한 유일한 치료 옵션은 동종 외과 간 이식이며, 이는 기증자 장기의 낮은 가용성과 절차 ^3,4 이후의 면역 억제 요법으로 인한 합병증으로 인해 제한됩니다. 장기 조달 및 이식 네트워크에 의해 수집 된 최근 데이터에 따르면, 간 이식 대기자 명단에있는 성인 환자의 40 % -46 %만이 장기를 받고,이 환자의 12.3 %는 대기자 명단⁵에있는 동안 사망합니다. 또한, 모든 희귀 간 질환 중 5 %만이 FDA가 승인 한 치료법을 가지고 있습니다⁶. 간 IMD에 대한 새로운 치료법이 절실히 필요하다는 것은 분명합니다. 그러나 새로운 치료 옵션을 개발하기 위해서는 적절한 질병 모델이 필요합니다.

시험관 내 및 생체 내 시스템을 사용하여 인간 질병을 모델링하는 것은 효과적인 치료법을 개발하고 간 IMD의 병리학을 연구하는 데 장애물로 남아 있습니다. 희귀 간 질환 환자의 간세포는⁷을 얻기가 어렵습니다. 동물 모델은 질병 병리학에 대한 이해를 개발하고 치료 전략을 테스트하는 데 중요합니다. 그러나 한 가지 장애물은 치명적인 돌연변이를 가진 배아에서 모델을 생성하는 것입니다. 예를 들어, Jag1 유전자의 5'-말단 근처에서 5 kb 서열의 동형접합성 결실을 포함하는 배아를 갖는 알라길 증후군 (ALGS)의 마우스 모델을 생성하려는 시도는 배아⁸의 조기 사망을 초래하였다. 또한, 배아 줄기 세포에서 유전자 편집에 의해 마우스 모델을 생성하는 것은 시간-집약적 및 자원-집약적일 수 있다⁹. 마지막으로, 돌연변이는 표적 조직 외부에 나타나 질병의 연구를 방해 할 수있는 혼란스러운 변수로 이어질 것입니다⁹. 체세포 유전자 편집은 간 조직에서 더 쉽게 편집 할 수있게하고 배아 줄기 세포를 사용하여 모델을 생성하는 것과 관련된 문제를 우회합니다.

전기천공은 세포막에 침투하기 위해 고전압 전류를 인가함으로써 CRISPR-Cas9를 핵으로 직접 전달할 수 있게 해주며, 인간 배아줄기세포, 다능성 줄기세포 및 뉴런 10,11,12와 같은 형질감염 기술에 비타협적인 것을 포함한 많은 세포 유형과 양립할 수 있다^10,11,12 . 그러나, 낮은 생존력은 전기천공의 잠재적인 단점이다; 절차를 최적화하면 독성을 제한하면서 높은 수준의 전달을 얻을 수 있습니다¹³. 최근의 연구는 CRISPR-Cas9 성분을 일차 마우스 및 인간 간세포로 전기천공하는 것이 매우 효율적인 접근법으로서 실현 가능성을 입증한다¹⁴. 간세포에서의 생체외 전기천공은 간세포의 인간 IMDs에 대한 새로운 마우스 모델을 생성하는데 적용될 수 있는 잠재력을 갖는다.

이 프로토콜은 마우스 간세포를 간세포로부터 단리하고 이어서 Cas9 단백질 및 합성 단일 가이드 RNA (sgRNA) 또는 sgRNA와 결합 된 Cas9 mRNA로 구성된 RNP 복합체로서 CRISPR-Cas9를 전기천공하여 높은 수준의 표적 유전자 편집을 얻기 위한 상세한 단계별 절차를 제공합니다. 또한, 이 프로토콜은 갓 분리된 마우스 간세포로의 CRISPR-Cas9의 전기천공에 따른 유전자 편집 효율, 생존력 및 기능성을 정량화하는 방법을 제공한다.

프로토콜

동물 실험은 모두 Clemson University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 지침 및 승인 된 프로토콜을 준수하여 수행되었습니다. 수술 절차는 8 주에서 10 주 사이에 마취 된 야생형 C57BL / 6J 마우스에서 수행되었습니다.

1. 동물 수술

1. 솔루션 및 장비 준비
   참고 : 관류 용액 및 마취 칵테일 조리법은 재료 표에 나와 있습니다.
   1. 관류 용액 1(HEPES, EGTA 및 EBSS), 관류 용액 2(HEPES, EGTA, EBSS,_CaCl2 및 MgSO4) 및 관류 용액 3(용액 2 및 리베라제)을 준비한다. 솔루션이 잘 혼합되어 있는지 확인하십시오.
   2. 수조를 42°C로 설정하고 절차를 시작하기 전에 최소 30분 동안 관류 용액 1, 2 및 3을 예열하고 수조에 보관하십시오.
      참고 : 관류 솔루션 1과 2는 칼슘을 킬레이트하고 간에서 혈액을 씻어냅니다. 관류 용액 3은 세포외 매트릭스를 해리시키는 소화 효소 리베라제를 함유한다.
   3. DMEM 150 mL + 10% 소 태아 혈청(FBS)을 원뿔형 튜브에 넣고 얼음 위에 보관하십시오.
      참고: 이 배지는 간 캡슐로부터 세포를 방출하고 각각 단계 2.1 및 2.2에서 분리된 간세포를 세척하는데 사용될 것이다.
   4. 원심분리기를 4°C로 설정한다.
   5. 튜빙의 양단을 70% 에탄올로 채워진 플라스크에 놓고 에탄올을 세 번 사이클링하여 펌프 튜빙을 멸균한다.
   6. 튜브를 증류수로 씻고 비우십시오.
   7. 튜브를 미리 예열된 30 mL의 관류 용액 1로 채운 다음, 8 mL의 관류 용액 2로 채운다. 튜브에 여전히 더 많은 유체를 위한 공간이 있는 경우, 튜브의 나머지 부분을 관류 용액 3으로 채웁니다. 튜브에 기포가 유입되지 않도록 다른 관류 용액으로 전환 할 때 펌프를 중지하십시오.
   8. 과량의 튜빙을 42°C 수조에 넣어 관류 용액을 따뜻하게 유지한다.
   9. 펌프 튜빙의 끝단을 관류 용액 3을 함유하는 원뿔형 튜브에 넣고, 수조에 보관한다.
      참고: 이 단계는 관류 중에 펌프가 관류 용액 3으로 지속적으로 충전되도록 하기 위해 필요합니다.
2. 동물 준비
   1. 마취 칵테일을 10-11.7 μL / g 체중의 용량으로 복강 내로 주사하여 마우스를 마취하십시오. 마취 칵테일은 7.5 mg / mL 케타민, 0.25 mg / mL 아세프로 마진 및 1.5 mg / mL 자일라진의 최종 농도를 가지고 있습니다.
   2. 마우스 호흡을 모니터링하고 마우스가 통증에 반응하지 않는지 확인하십시오. 마우스가 분당 ~ 55-65 호흡의 호흡 속도를 가지며, 발가락을 꼬집는 것에 반응하지 않으며, 꼬리가 벗겨 질 때까지 기다리십시오. 또한, 닫힌 눈의 내측에있는 피부를 가볍게 만져서 palpebral (깜박임) 반사를 확인하십시오. 마우스가 깜박이거나 눈 근육이 경련을 일으키면 마취 칵테일 전체의 복용량을 5-10 μL만큼 늘리십시오.
   3. 마우스를 등 뒤쪽에 수핀 위치에 놓고 핀이나 테이프를 사용하여 팔다리를 표면에 고정시킵니다 (보충 그림 S1).
   4. 복부에 70 % 에탄올을 뿌리고 면봉을 사용하여 말리십시오.
3. 간 관류
   1. 가위를 사용하여 복부 피부에 U 자형 측면 절개를 만들고 측면을 통해 구멍을 확장하십시오.
   2. 흉곽에 피부를 계속 엽니 다.
   3. 가위를 사용하여 복막을 통해 복강을 흉곽까지 노출시키고 장기에 닉닉하지 않도록주의하십시오. 포셉의 뒷면이나 가위의 무딘 표면을 사용하여 창자를 오른쪽으로 이동하십시오. 열등한 정맥 카바와 포털 정맥을 식별하십시오 (보충 그림 S1).
   4. 카테터를 통해 예열 된 관류 용액을 플러시하기 위해 펌프를 시작하십시오.
   5. 펌프를 멈추고 모든 공기가 시스템을 통해 플러시되면 카테터를 제거하십시오. 카테터에 연결된 바늘의 끝을 정맥에 10 ° -20 ° 각도로 열등한 정맥 카바에 삽입하십시오. 카테터에서 바늘을 제거하고 카테터를 정맥에 평행한 움직임으로 정맥으로 부드럽게 밀어 넣습니다.
      참고 : 사용자는 정맥에서 적절한 cannulation을 확인하기 위해 카테터에서 혈액의 플래시백을 관찰해야합니다.
   6. 카테터를 정맥으로 더 이동시키지 않고 튜브를 카테터에 연결하십시오.
   7. 2 mL/min 유량으로 펌프를 시작하십시오. 관류가 성공했다는 신호로 즉시 창백하게 변하는 간을 찾으십시오.
   8. 가위를 사용하여 포털 정맥을 자릅니다.
   9. 점차적으로 유속을 5 mL / min으로 증가시킵니다.
   10. 배수를 막고 좋은 관류를 촉진하기 위해 포셉 또는 면봉을 사용하여 대략적인 절단 부위의 포털 정맥에 주기적으로 압력을 가하십시오.
   11. 관류 용액 3이 흐르면 간장의 탄력성을주의 깊게 모니터링하십시오. 간이 부드러워 졌는지 확인하려면 면봉이나 포셉으로 간을 부드럽게 누르고 간에서 들여 쓰기가 형성되는지 확인하십시오. 세포 생존력의 손실을 피하기 위해 과용하지 않도록주의하십시오.
   12. 간이 부드러워지면 (관류 용액 3의 30-50 mL가 흐른 후에 발생), 펌프를 멈추고 카테터를 제거하고 조심스럽게 간을 해부하십시오. 간을 얼음처럼 차가운 DMEM + 10% FBS 배지가 들어있는 100mm 페트리 접시에 넣습니다. 담낭을 소비하고 내용물이 유출되지 않도록주의하십시오. 페트리 접시를 소용돌이 치며 가능한 혈전을 부드럽게 제거하십시오.
   13. 간을 얼음처럼 차가운 DMEM + 10% FBS 배지가 들어있는 새로운 페트리 접시로 옮깁니다.

2. 간세포 분리

1. 간 캡슐에서 세포를 방출하십시오.
   1. 페트리 접시를 얼음 위에 놓고 두 쌍의 멸균 포셉을 사용하여 모든 엽의 간 캡슐을 부드럽게 찢어 버립니다. 간세포를 방출하기 위해 세포 리프터 또는 포셉을 사용하여 배지 주위에서 간을 부드럽게 소용돌이치십시오. 간이 매우 작아지고 서스펜션이 갈색과 불투명해질 때까지이 동작을 계속하십시오.
   2. 플레이트로부터 간 조직의 잔해를 제거하고, 저속으로 설정된 25 mL 혈청학적 피펫을 사용하여, 세포 현탁액을 100 μm 세포 스트레이너가 장착된 50 mL 원뿔형 튜브(얼음 위에 미리 냉장)로 조심스럽게 옮긴다.
   3. 신선하고 얼음처럼 차가운 DMEM + 10% FBS 배지를 페트리 접시에 넣어 씻어내고 표면에서 남은 세포를 모아 50 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 모든 셀이 수집될 때까지 이 단계를 반복합니다.
2. 비실질 세포로부터 간세포를 세척하고 정화하십시오.
   1. 수집된 세포를 50 mL 원뿔형 튜브에서 4°C에서 50 × g 으로 저감속 또는 브레이크 없이 5분 동안 원심분리한다.
   2. 파편과 비실질 세포를 함유하는 상등액을 버리고 튜브를 부드럽게 소용돌이치면서 남은 상청액에 펠렛을 재현탁시킨다. 펠렛을 재현탁시킨 후, 신선하고 얼음처럼 차가운 DMEM + 10% FBS 배지 30mL를 첨가한다.
   3. 원심분리(단계 2.2.1) 및 세척(단계 2.2.3)을 3회 반복한다.
   4. 최종 세포 펠릿을 빙냉 DMEM + 10% FBS 배지 10 mL에 재현탁시킨다.
      참고: 펠릿을 재현탁하는 데 사용되는 배지의 부피는 펠릿 크기에 따라 다릅니다. 펠렛이 15mm보다 상당히 작은 경우 얼음처럼 차가운 DMEM + 10% FBS 배지 1-5mL를 사용하십시오.
3. 세포 생존율 정량화
   1. 마이크로퍼지 튜브에서, 50 μL의 0.4% 트리판 블루 용액을 350 μL의 간세포 도금 배지(PM)에 첨가한다. 이어서, 100 μL의 세포 현탁액을 첨가하여 최종 1:5 희석을 만들고 피펫을 여러 번 상하로 혼합한다.
   2. 혈구분석기를 사용하여 세포 밀도 및 생존율을 계수한다. 세는 동안 간세포 현탁액을 얼음 위에 놓은 다음 간세포가 정착하지 못하도록 30rpm으로 설정된 궤도 쉐이커에 얼음 통을 놓습니다.
   3. 세포 생존율이 <70%인 경우 아래의 Percoll 처리 및 원심분리 단계를 따르십시오.
      1. Percoll을 10x 인산염 완충 식염수(PBS)로 9:1 비율로 희석한다.
      2. 간세포 현탁액을 희석된 Percoll과 1:1 비율로 혼합한다.
      3. 200 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한다.
      4. 죽은 세포를 포함하는 상층액을 버리십시오. 펠렛을 빙냉 DMEM + 10% FBS 배지에 재현탁시킨다.
      5. 셀을 다시 계산합니다.
4. 간세포 혈소성 테스트
   1. 일부 세포를 미리 가온된 PM을 사용하여 mL당 0.5 × 10 6 세포의 밀도로 콜라겐 I이 코팅된⁶ -웰 플레이트 상에 플레이트화한다.
   2. 전기천공을 수행할 준비가 될 때까지 궤도 쉐이커에 있는 동안 나머지 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
   3. 세포의 플레이트를 37C의 물 재킷_CO2 인큐베이터에 놓고, 균질한 도금을 보장하기 위해 플레이트를 남북 및 동서 운동으로 수평 및 수직으로 부드럽게 움직인다. 1.5 시간마다 두 번 더 움직임을 반복하십시오.
   4. 도금 후 3 h에서 셀 부착을 확인하십시오.
      참고 : 세포의 적어도 60 %는 양질의 간세포의 지표로 플레이트에 부착되어야합니다.
   5. 배지를 플레이팅 후 24 h에서 예열된 간세포 유지 배지 (MM)로 변경하여 세포를 배양 중에 유지시킨다.
5. 글리코겐 염색
   1. 세포가 6-웰 콜라겐 I-코팅된 플레이트에 부착된 후, 배양된 세포로부터 소비된 배지를 제거하였다.
   2. 얼음처럼 차가운 에탄올에 10-15 분 동안 세포를 고정시킵니다.
   3. 멸균수로 깨끗이 씻으십시오.
   4. 1% 수성 주기산에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 멸균수로 세척한다.
   5. 100% 쉬프 시약에서 30분 동안 인큐베이션한다.
      참고: Schiff 시약은 세포에 첨가하기 전에 희석해서는 안 됩니다.
   6. 10 분 동안 물로 세 번 씻으십시오.
   7. 장착 매체에 장착하십시오.
   8. 밝은 필드 설정에서 현미경을 사용한 이미지입니다.

3. CRISPR-Cas9 유전자 편집을 위한 sgRNA 설계

참고: 이 섹션에서는 간장의 IMD와 관련된 치료 표적 유전자를 교란시키기 위한 원리 증명 유전자 편집으로서 마우스 하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제(Hpd) 유전자를 표적화하는 sgRNA의 설계에 대해 설명한다.

1. 참조된 소프트웨어(¹⁵)를 사용하여 Hpd를 표적화하는 가이드 시퀀스를 설계한다.
2. Ensembl 게놈 브라우저를 사용하여 hpd 의 서열을 확인합니다.
3. gRNA를 설계하기 위해 다음 파라미터를 사용하십시오: 20개 뉴클레오티드의 단일 가이드 길이 및 NGG (N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있음) 프로토스페이서-인접 모티프 (PAM) 서열.
4. Hpd의 엑손 3에서 대상 영역을 선택합니다.
5. 온-타겟 및 오프-타겟 스코어가 있는 타겟 영역의 가이드 시퀀스 리스트를 생성한다.
   참고: On-Target 점수는 지정된 설계에 대해 예측된 온타깃 편집 효율성을 나타냅니다. 점수가 높을수록 편집 효율성이 높아집니다. 오프 타겟 점수는 가이드 시퀀스의 특이성과 관련이 있습니다 : 점수가 높을수록 오프 타겟 편집 가능성이 낮음을 나타냅니다. 이상적으로 두 점수 모두 높아야합니다 : On-Target Score >60, Off-Target Score >50.
6. 온타깃 및 오프타겟 점수가 가장 높은 가이드 시퀀스를 선택합니다. 화학적으로 합성된 가이드 서열을 함유하는 sgRNA를 갖는다.

4. 전기천공 및 세포 배양

1. CRISPR-Cas9 기판, 매질, 전지 및 전기천공 기기의 제조
   1. 수반되는 보충제 전체를 PM에 첨가하고 37°C 수조에서 10분 동안 따뜻하게 한다.
   2. 전원 버튼을 눌러 전기 천공 장치를 켜고 프로그램 T-028이 화면에 나타날 때까지 x 버튼을 누른 다음 아래쪽 화살표 버튼을 눌러 전기 천공 프로그램을 설정합니다.
   3. 전기천공된 간세포에 대한 목적지 웰을 여섯 웰 콜라겐 I 코팅된 플레이트에 1.5 mL의 PM을 첨가하여 준비한다. 플레이트를 사용할 준비가 될 때까지 37°C 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
   4. 수반되는 전체 보충물을 전기천공 완충 용액에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
      참고: 바이알에 전기천공 버퍼 만료 날짜를 표시하십시오(보충제 첨가일로부터 3개월 후).
   5. 포장에서 전기 천공 용기를 제거하고 각 샘플에 대해 라벨을 붙입니다.
   6. PCR 스플릿 스트립 튜브에서, 30 μg의 sgRNA와 300 pmol의 Cas9 단백질을 조합함으로써 Cas9 RNP 복합체를 제조하고, 복합체를 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다. 30 μg의 sgRNA와 4 μL의 Cas9 mRNA (1 μg/μL)를 결합하여 Cas9 mRNA를 준비하십시오. mRNA-sgRNA 믹스를 전기천공될 때까지 얼음 위에 보관한다. 형광 현미경을 사용하여 성공적인 전기천공을 검증하기 위해 1.0 μg의 eGFP mRNA를 함유하는 튜브를 별도로 준비한다.
   7. 1.2 × 10⁶ 셀당 100 × g 에서 전기천공 반응시켜 4°C에서 2분 동안 원심분리한다.
   8. 세포 펠릿으로부터 상층액을 제거하고 튜브 벽의 측면을 따라 반응 당 100 μL의 전기 천공 용액을 첨가한다. 튜브를 손으로 부드럽게 흔들어 전기천공 용액에 간세포를 재현탁시킨다.
2. CRISPR-Cas9 RNP 및 mRNA를 간세포로 전기천공
   1. 간세포가 전기천공 용액 중에 고르게 분산되어 나타나면, 간세포 현탁액 100 μL를 Cas9 복합체를 함유하는 스트립 튜브로 옮긴다.
      참고: 간세포를 옮길 때 넓은 피펫 팁을 사용하여 세포 생존력을 보존하십시오.
   2. 스트립의 내용물을 전기 천공 용기에 잘 옮깁니다.
   3. 뉴클레오벳 용기를 전기천공 장치의 슬롯에 넣습니다. x 버튼을 눌러 간세포를 전기천공합니다. 전기 천공 후 장치가 OK라고 표시된 화면이 나타날 때까지 기다립니다. x 버튼을 다시 누르고 용기를 제거하십시오.
   4. 전기천공된 용기를 얼음 상에서 15분 동안 인큐베이션한다.
   5. 500 μL의 예열된 PM을 전기천공 용기에 첨가한다.
   6. 300 μL의 전기천공 반응을 예열된 플레이트 상의 각 목적지 웰로 옮긴다.
      참고: 전기 천공 반응 당 두 개의 대상 웰이 있어야 합니다. 하나의 웰은 유전자 편집 효율을 정량화하는 데 사용될 것이다; 다른 웰은 MTT 및 알부민 분석에 사용될 것이다.
   7. 간세포가 우물의 중앙에 축적되는 것을 방지하려면 플레이트를 수평 및 수직으로 부드럽게 움직여 세포를 북-남 및 동서 운동으로 분산시킨다. 플레이트가 움직이는 동안 인큐베이터 선반과의 접촉을 유지하는지 확인하십시오. 전기천공된 간세포를 도금한 후 15, 30, 45, 60, 및 90분에서 이 동작을 반복한다.
   8. 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
   9. 세포를 도금 한 후 24 시간 후에 유전자 편집 분석을 위해 지정된 웰에서 배지를 제거하고 0.25 mg / mL 기저막 매트릭스 오버레이로 교체하십시오.
      참고: 냉동실에 보관하는 경우 멤브레인 매트릭스를 4°C로 옮기고 해동되도록 합니다. 기저막 매트릭스는 10°C 이상에서 견고하기 때문에, 기저막 매트릭스가 사용 준비가 될 때까지 얼음 위에 또는 4°C에서 유지되는 것이 중요하다.

5. MM과 혼합하여 0.25 mg / mL의 최종 농도를 제공하는 멤브레인 매트릭스의 부피를 계산하십시오.

참고: 6웰 플레이트의 경우 웰당 2mL의 오버레이가 필요합니다.

6. 멤브레인 매트릭스의 계산 된 부피를 얼음처럼 차가운 MM에 추가하고 10 번 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.

1. 오버레이 혼합물을 세포의 상부에 천천히 피펫하고, 플레이트를 다시 37°C 인큐베이터에 놓는다.
2. 매질을 매 24시간마다 새로운 유지보수 매체로 교체하십시오.
3. 도금 후 24 h에서, MTT 및 알부민 분석을 위해 지정된 웰로부터 컨디셔닝 배지를 옮긴다. 알부민 분석을 수행할 준비가 될 때까지 컨디셔닝된 배지를 마이크로퍼지 튜브에 보관한다. MTT 분석을 위한 단계 7.1로 진행한다.
   참고: 컨디셔닝 배지를 4°C에 보관하여 단기간 보관하십시오(하루 미만). 더 긴 보관을 위해, 매체를 -80°C에서 저장한다.

7. 전기천공된 마우스 간세포에서의 전달 효율, 생존력 및 온-타겟 편집의 분석

1. MTT 분석을 이용한 생존력 측정
   1. MTT 1개의 5 mg 바이알에 PBS 1 mL를 첨가하여 12 mM MTT 원액을 제조하였다.
   2. MTT 원액 150 μL를 웰에 첨가하고 24시간 동안 인큐베이션한다.
   3. 인큐베이션 후, 1.5 mL의 소듐 도데실 설페이트-하이드로클로라이드 (SDS-HCl) 용액을 각 웰에 첨가한 다음, 피펫을 혼합한다.
   4. 플레이트를 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 생존 가능한 세포를 나타내기 위해 배지의 색의 변화를 맑은 것에서 보라색으로 바꾼다.
   5. 피펫을 이용하여 각 샘플을 다시 혼합하고 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 판독하였다.
   6. Eq (1)을 사용하여 Cas9 처리 샘플에 대한 정규화된 생존율을 계산하십시오.
      (1)
2. 간세포 기능성을 평가하기 위한 알부민 분석
   1. 컨디셔닝 배지 50 μL를 알부민 키트에 의해 제공된 플레이트 내의 웰로 옮긴다. 우물을 덮고 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
   2. 웰을 200 μL의 세척 완충액으로 5x 세척한다.
   3. 플레이트를 뒤집어 티슈 페이퍼의 각 웰을 비우고 몇 번 탭하십시오.
   4. 세척 후, 알부민 분석 키트에 제공된 비오티닐화 항체 50 μL를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
   5. 5.2.2-5.2.3단계를 반복하여 웰을 세척합니다.
   6. 알부민 분석 키트에 제공된 50 μL의 스트렙타비딘-퍼옥시다제를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
   7. 5.2.2단계를 반복합니다.
   8. 알부민 분석 키트에 제공된 50 μL의 크로모겐 기질을 웰 당 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 부드럽게 탭하여 균일 한 혼합을 보장합니다. 피펫 팁으로 기포를 제거하십시오.
   9. 마지막으로, 각 웰에 50μL의 정지 용액을 첨가하고 기능성 세포를 나타내기 위해 노란색에서 파란색으로 변색을 찾습니다.
   10. 즉시 진행하여 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 판독한다.
3. eGFP mRNA로 전기천공된 웰에서 전달 효율을 추정한다.
   1. 전기천공 후 24시간 후에 간세포의 위상 대비 및 녹색 형광 이미지를 캡처한다. 우물 내의 다른 위치에서 세 개의 이미지를 찍습니다.
   2. 셀의 이미지를 ImageJ에 업로드합니다. 이미지 탭에서 16비트| 유형 선택을 선택하여 이미지를 그레이스케일로 변환합니다.
   3. 이미지에서 셀 구조를 강조 표시하려면 이미지 탭에서 조정을 선택 합| 임계값. 슬라이더를 조정하여 셀을 강조 표시합니다.
   4. 프로세스 탭에서 배경 빼기를 선택하여 배경 노이즈를 제거합니다.
   5. 분석 탭을 클릭하여 셀 수를 계산한 다음 입자 분석을 선택합니다. 확인을 클릭하여 계수된 파티클 목록을 생성합니다.
   6. 녹색 형광 이미지에서 계수된 입자의 수를 상응하는 위상차 이미지에서 계수된 입자의 수로 나눔으로써 GFP 양성 세포의 백분율을 계산한다.
4. 온타겟 Cas9 활성 분석
   1. 전기천공된 세포로부터 게놈 DNA를 추출한다.
      1. 전기천공 3일 후에 플레이트로부터 배지를 제거하고, 500 μL의 0.25% 트립신을 첨가한다. 37°C에서 5분 동안 인큐베이션한다. 피펫은 간세포가 플레이트로부터 분리되었는지 확인하기 위해 인큐베이션 후 여러 번 배양한다.
      2. 트립신화된 세포 현탁액을 마이크로원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 10분 동안 800 × g 의 탁상용 원심분리기에서 스핀한다. 회전 후, 튜브에서 펠렛을 검사하십시오.
      3. 피펫팅으로 트립신을 함유하는 상층액을 제거한다. 펠릿을 방해하지 않도록하십시오. 펠렛을 80 μL의 DNA 추출 용액에 재현탁시킨다. 펠렛을 보기 어려운 경우, 튜브의 함량을 50 μL의 DNA 추출 용액에 재현탁시킨다.
      4. 펠릿이 재현탁되도록 30초 동안 소용돌이친다. 현탁액을 PCR 스플릿 스트립 튜브로 옮기고 열 사이클러에 넣습니다. 95°C에서 15분, 68°C에서 8분 동안 실행한다.
   2. PCR-표적 유전자좌를 증폭시킨다.
   3. DNA 중합효소를 이용하여 표적 상의 Hpd 영역을 증폭시키기 위해 하기에 기재된 절차를 따르십시오.
      1. 0.5 μL의 10 mM dNTPs, 0.5 μL의 10 μM 정방향 프라이머, 0.5 μL의 10 μM 역방향 프라이머, 0.125 μL의 Taq 중합효소, 간세포로부터 추출된 5 μL의 게놈 DNA, 및 18.375 μL의 뉴클레아제 유리물을 함유하는 반응을 준비하였다. 프라이머 서열에 대해서는 보충표 S1 을 참조한다.
      2. PCR 믹스를 간략하게 와류하고 신속하게 원심분리하여 용액이 튜브의 바닥에 있는지 확인합니다.
      3. PCR 믹스를 열 사이클러에 배치하고 이들 조건 하에서 증폭한다: 변성을 위해 94°C 동안 30 s, 30 s 동안 94°C의 30 사이클, 어닐링을 위한 45 s를 위한 57°C, 1분 동안 68°C, 및 5분 동안 68°C의 최종 연장.
         참고: PCR 반응을 위한 어닐링 온도는 프라이머의 조성에 따라 달라질 것이다. PCR을 수행하기 전에 용융 온도 계산기를 사용하는 것이 좋습니다.
      4. 정확한 제품 크기를 확인하려면 PCR 제품 3μL를 물 2μL와 6x 염료 1μL를 섞는다. 1.5 % 아가로스 젤로 실행하고 올바른 제품 크기를 확인하십시오.
   4. 자기 비드를 사용하여 DNA를 정화하십시오.
      참고: 스핀 컬럼은 PCR 정리에도 사용할 수 있습니다. 다음은 마그네틱 비드를 사용하여 PCR 산물을 정제하는 절차입니다.
      1. 4 °C에서 마그네틱 비드를 제거하고 실온에 도달하도록하십시오.
      2. 간단히 와류하고 PCR 믹스를 신속하게 원심분리한다.
      3. PCR 믹스의 부피의 1.8×와 동일한 비드의 부피를 첨가한다. PCR-비드를 10x 혼합한 피펫을 피펫하여 용액이 동등하게 혼합되도록 한다.
      4. 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
      5. PCR-비드 믹스를 PCR 플레이트로 옮기고 자성 플레이트 상에 놓는다.
      6. 플레이트를 자석 상에서 5분 동안 인큐베이션한다. 5 분 후, 용액이 깨끗한지 확인하고, 비드가 다음 단계로 이동하기 전에 자석에 결합됩니다.
      7. 상층액을 버리십시오.
      8. 200 μL의 70% 에탄올을 웰에 첨가하고, 30초 동안 인큐베이션한다.
         참고 : 70 % 에탄올은 DNA 손실을 방지하기 위해 정리를 수행하기 직전에 준비해야합니다.
      9. 상청액을 버리고 7.4.4.8단계를 반복한다.
      10. 상층액을 제거하고 실온에서 3 분 동안 건조시켜 에탄올의 흔적을 제거하십시오.
      11. 자석에서 플레이트를 제거하고 22μL의 물을 샘플에 첨가한다. 피펫을 10x 위아래로 피펫하여 물과 구슬을 섞습니다.
      12. 샘플을 실온에서 3분 동안 인큐베이션한다.
      13. 플레이트를 자석으로 다시 옮기고 3 분 동안 또는 용액이 맑을 때까지 인큐베이션하십시오.
      14. 20 μL의 샘플을 PCR 튜브로 옮긴다. 구슬이 이월되지 않도록주의하십시오.
   5. 서열 정제된 DNA 앰플리콘은 생어 시퀀싱에 의해 정제된다.
   6. 처리 및 제어(처리되지 않은) 샘플에 대한 .ab1 시퀀스 파일을 분해에 의한 indels 추적(TIDE)¹⁶ 에 업로드하여 대상 부위의 indels를 정량화합니다.

결과

간에서 도금 가능한 원발성 간세포의 분리
간 관류 및 간세포 분리의 전체 과정은 도 1에 예시되어 있다. 본 실험에서는 야생형, 8-10주령의 C57BL6/6J 마우스를 사용하였다. 이 절차는 85 %와 95 % 사이× 생존력을 가진 마우스 당 10⁶ 세포에 대해 20-50을 산출 할 것으로 예상됩니다. 생존율이 <70 %이면 죽은 세포를 제거하기 위해 퍼콜 치료를 따라야합니다. 갓 ...

토론

간세포 격리를위한 프로토콜에 설명 된 단계는 도전적이며 숙련도를위한 연습이 필요합니다. 간에서 성공적인 간세포 분리를위한 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 열등한 정맥 카바의 적절한 통조림은 완전한 간 관류에 필수적입니다. 관류 후 간에서 블랜칭이 없다는 것은 카테터의 변위를 나타냅니다 (표 1). 열등한 정맥 카바 (역행 관류)는 포털 정맥 (antegrade perfusion)보다 간단?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural	USA Scientific	1402-4700
6-well Collagen Plates	Advanced Biomatrix	5073
accuSpin Micro 17R	Fisher Scientific	13-100-675
All-in-one Fluorescent Microscope	Keyence	BZ-X810
Analog Vortex Mixer	VWR	97043-562
ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL	ThermoFisher Scientific	2079GPK
Automated Cell Counter	Bio-Rad Laboratories	TC20
Blue Wax Dissection Tray	Braintree Scientific Inc.	DTW1	9" x 6.5" x 1/2"+F21
Cell scraper/lifter	Argos Technologies	UX-04396-53	Non-pyrogenic, sterile
Conical tubes (15 mL)	Fisher Scientific	339650
Conical tubes (50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22
Cotton applicators	Fisher Scientific	22-363-170
Curved scissors	Cooper Surgical	62131
Disposable Petri Dishes	Falcon	351029	100mm,sterile
Disposable Petri Dishes	VWR	25373-100	35mm, sterile
Epoch Microplate Spectrophotometer	BioTek Instruments	250082
Falcon Cell strainer (70 µm)	Fisher Scientific	08-771-2
Forceps	Cooper Surgical	61864	Euro-Med Adson Tissue Forceps
IV catheters	BD	382612	24 G x 0.75 in
IV infusion set	Baxter	2C6401
MyFuge 12 Mini Centrifuge	Benchmark Scientific	1220P38
Needles	Fisher Scientific	05-561-20	25 G
Nucleofector 2b Device	Lonza	AAB-1001	Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes
Peristaltic Pump	Masterflex	HV-77120-42	10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC
Precision pump tubing	Masterflex	HV-96410-14	25 ft, silicone
Primaria Culture Plates	Corning Life Sciences	353846	Nitrogen-containing tissue culture plates
Serological Pipets (25 mL)	Fisher Scientific	12-567-604
Syringes	BD	329464	1 mL, sterile
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories	1861096
Water bath	ALT	27577	Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3	IDT	1081058
Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL	Fisher Scientific	NC9959336
CleanCap Cas9 mRNA	Trilink Biotechnologies	L-7606-100
CleanCap EGFP mRNA	Trilink Biotechnologies	L-7201-100
Corning Matrigel Matrix	Corning Life Sciences	356234
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885076	Low glucose, pyruvate
Ethanol 70%	VWR	71001-652
Fetal bovine serum	Thermoscientific	26140-079
Hepatocyte Maintenance Medium (MM)	Lonza	MM250
Hepatocyte Plating Medium (PM)	Lonza	MP100
Mouse Albumin ELISA Kit	Fisher Scientific	NC0010653
Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit	Lonza	VPL-1004
OneTaq HotStart DNA Polymerase	New England Biolabs	M0481L
PBS 10x pH 7.4	Thermoscientific	70011-044	No calcium or magnesium chloride
Percoll (PVP solution)	Santa Cruz Biotechnology	sc-500790A
Periodic acid	Sigma-Aldrich	P7875-25G
Permount Mounting Medium	VWR	100496-550
QuickExtract DNA Extraction Solution	Lucigen Corporation	QE05090
Schiff’s fuchsin-sulfite reagent	Sigma-Aldrich	S5133
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056	Phenol red
Vybrant MTT Cell Viability Assay	ThermoFisher Scientific	V13154
Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized)			Stable at 4 °C for 2 months
EBSS	Fisher Scientific	14155063	Complete to 200 mL
EGTA (0.5 M)	Bioworld	40520008-1	200 µL
HEPES (pH 7.3, 1 M)	ThermoFisher Scientific	AAJ16924AE	2 mL
Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized)			Stable at 4 °C for 2 months
CaCl2·2H20 (1.8 mM)	Sigma	C7902-500G	360 µL of 1 M stock
EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red)	Fisher Scientific	14-155-063	Complete to 200 mL
HEPES (1 M)	ThermoFisher Scientific	AAJ16924AE	2 mL
MgSO4·7H20 (0.8 mM)	Sigma	30391-25G	160 µL of 1 M stock
Perfusion Solution 3			Prepared fresh prior to use
Solution 2			50 mL
Liberase	Roche	5401127001	0.094 Wunsch units/mL
Mouse Anesthetic Cocktail
Acepromzine			0.25 mg/mL final concentration
Ketamine			7.5 mg/mL final concentration
Xylazine			1.5 mg/mL final concentration
Software	URL
Benchling	https://www.benchling.com/
ImageJ	https://imagej.nih.gov/ij/
TIDE: Tracking of Indels by Decomposition	https://tide.nki.nl/