위장 기질 종양의 유전자 조작 마우스 모델의 분자 및 면역 학적 기술

요약

이 원고의 목표는 키트^V558Δ/+ 마우스 모델 및 마우스 표본의 성공적인 해부 및 처리를 위한 기술을 설명하는 것입니다.

초록

위장 기질 종양 (GIST)은 가장 흔한 인간 육종이며 일반적으로 KIT 수용체의 단일 돌연변이에 의해 구동됩니다. 종양 유형 전반에 걸쳐 차세대 암 치료법을 조사하기 위해 수많은 마우스 모델이 개발되었습니다. 그러나, GIST에서, 대부분의 생체내 연구는 내 재된 한계를 갖는 이종이식편 마우스 모델을 사용한다. 여기에서, 우리는 키트^V558Δ/+ 돌연변이를 보유하는 위장 기질 종양의 면역유능하고 유전적으로 조작된 마우스 모델을 기술한다. 이 모델에서, 대부분의 GIST를 담당하는 종양유전자인 돌연변이 KIT는 인간 GIST에서 볼 수 있는 조직학적 외관과 면역 침윤을 모방하는 GIST로 이어지는 내인성 프로모터에 의해 구동된다. 또한, 이 모델은 표적화된 분자 및 면역 요법 둘 다를 조사하는데 성공적으로 사용되어 왔다. 여기에서는 키트^V558Δ/+ 마우스 콜로니의 번식 및 유지에 대해 설명합니다. 또한이 논문은 GIST의 치료 및 조달, 키트^{V558Δ / +} 마우스의 장간막 림프절 및 인접한 맹장의 배출 및 분자 및 면역 학적 분석을위한 샘플 준비에 대해 자세히 설명합니다.

서문

GIST는 미국에서 약 6,000 건의 발생률을 보이는 인간에서 가장 흔한 육종입니다¹. GIST는 Cajal의 간질성 세포로 명명된 위장관 심박조율기 세포로부터 유래하는 것으로 보이며, 전형적으로 티로신 키나아제 KIT 또는 PDGFRA²의 단일 돌연변이에 의해 구동된다. 수술은 GIST에 대한 치료의 주류이며 치료 적 일 수 있지만 진행성 질환 환자는 티로신 키나제 억제제 (TKI), 이마티닙으로 치료할 수 있습니다. 20 년 전에 도입 된 이래로, imatinib은 GIST의 치료 패러다임을 변화시켜 진행성 질병의 생존율을 1 년에서 5 년 이상 ^3,4,5 년 이상으로 향상 시켰습니다. 불행히도, imatinib은 획득 된 KIT 돌연변이로 인해 거의 치유되지 않으므로이 종양에 대한 새로운 치료법이 필요합니다.

마우스 모델은 암에서 새로운 치료법의 조사에 중요한 연구 도구입니다. 다중 피하 이종이식편 및 환자 유래 이종이식편 모델이 개발되고 GIST ^6,7에서 조사되었다. 그러나, 면역결핍 마우스는 GISTs가 그들의 종양원성 돌연변이에 따라 차등적인 면역 프로파일을 보유하고, 위장관 종양 미세환경을 변경시키는 것은 TKI 요법 ^8,9의 효과에 따라 개선되기 때문에 인간 GIST를 완전히 나타내지 않는다. 키트^V558Δ/+ 마우스는 키트 엑손 11에서 이형접합성 생식계열 결실을 가지며, 이는 인간 GIST¹⁰에서 가장 일반적으로 돌연변이된 부위인 병치막 도메인을 인코딩한다. 키트^V558Δ/+ 마우스는 100% 침투율을 갖는 단일 맹장 GIST를 개발하고, 종양은 인간 GIST 8,11,12,13과 같은 유사한 조직학, 분자 신호전달^, 면역 침윤 및 치료에 대한 반응을 갖는다. 여기에서는 GIST의 분자 및 면역 연구에 사용하기 위해 키트^{V558Δ / +} 마우스의 번식, 치료 및 표본 분리 및 처리에 대해 설명합니다.

프로토콜

모든 마우스는 NIH 지침과 펜실베니아 대학 IACUC의 승인에 따라 펜실베니아 대학에서 병원균이없는 조건 하에서 수용되었습니다. 안락사는 펜실베니아 대학 실험실 동물 자원 표준 운영 절차에 따라 수행되었습니다.

1. 키트^{V558Δ / +} 마우스 번식

1. 키트^V558Δ/+ 마우스를 C57BL/6J 마우스를 C57BL/6J 마우스를 사용하여 C57BL/6J 배경으로 10회 이상 백크로스합니다. 이렇게하려면 수컷 키트^{V558Δ / + 마우스를 암컷 C57BL /} 6J 마우스와 1 : 2 비율로 번식시킵니다.
   참고: 동형접합성 키트 V558 Δ^/V558Δ 유전자형은 utero에서 치명적이다. 수컷 C57BL / 6J 마우스로 암컷 키트^{V558Δ / +} 마우스를 번식시킬 수는 있지만 깔짚 크기는 암컷 야생형 C57BL / 6J 마우스에서 본 것보다 약 절반입니다. 또한, 암컷 키트^{V558Δ / +} 마우스는 생후 4 개월 후에 제한된 깔짚을 생산합니다.
2. 생후 7-14일에 새끼를 발가락 깎기로 유전자형화하여 키트^V558Δ/+ 유전자형의 존재를 확인하였다. 정방향 프라이머 사용: TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; 기자 1: CCTCGACAACCTTCCA; 역방향 프라이머: TTGCGTCGGGTGTCTATGTAAACAT; 및 기자 2 : 유전자형에 대한 TCTCCTCGACCTTCCA.

2. 키트^V558Δ/+ 마우스 치료

1. 나이와 성별은 치료 전에 키트^V558Δ/+마우스와 일치합니다. 코호트에서 연령 및 성별에 매칭된 마우스를 사용하여 암컷 키트^V558Δ/+ 마우스로부터의 종양이 수컷 마우스의 종양보다 크기 때문이다. 8-12 주령에 마우스를 치료하고, 이때 종양이 확립됩니다 (그림 1).
2. 티로신 키나제 억제제를 경구 또는 복강내(i.p.) 주사에 의해 부여; 키트^V558Δ/+ 종양은 티로신 키나제 억제제에 민감하다. 하루에 두 번 식수에 600 mg / L의 용량으로 이마티닙을 제공하거나 45 mg / kg의 i.p. 주사를 제공하십시오. 단계 3에 나타낸 바와 같이 종양 해부 후 디지털 스케일을 사용하여 종양 중량 감소를 측정하는데, 이는 이마티닙으로 치료한 후 1주일에 대략 50%, 4주에 80%이다(도 2).

3. 키트^V558Δ/+ 마우스 장기 수확

1. CO2 마약에 의해 마우스를 분당 60% 챔버 부피의 유속으로 안락사시킨다. 호흡이 중단 된 후 마우스를 적어도 2 분 동안 챔버에 방치 한 다음 자궁 경부 탈구를 수행하여 사망을 확인하십시오.
2. 모든 악기를 살균하고, 절차 전반에 걸쳐 장갑을 착용하고, 멸균 된 필드를 유지하십시오. 70 % 에탄올로 피부를 준비하십시오. 가위를 사용하여 2cm 중간 선 세로 절개를 만들고 복강에 들어갑니다. 복부 내 유착을 급격하게 용해시킵니다.
3. 배수되는 장간막 림프절을 제거하려면 아래에 설명 된 단계를 따르십시오.
   1. 맹장을 확인하고 그 장간막을 우월하게 들어 올리십시오. 결장 장간막의 기저부까지 대략 중간쯤에, 장간막 림프절을 확인하고 급격하게 해부하십시오. 림프절은 회백색이며 크기는 약 0.5cm x 0.5cm입니다.
   2. 필요에 따라 림프절 조직을 단백질 분리, 조직학 및 단일 세포 현탁액을 위해 삼분의 일로 나눕니다. 단일 세포 현탁액의 경우, 림프절 조직을 20mL의 무혈청 배지(RPMI)에 넣고 얼음 위에 보관하십시오.
4. GIST와 맹장의 분리를 위해 아래에 설명 된 단계를 따르십시오.
   1. 키트^V558Δ/+ 마우스의 맹장은 대부분 GIST로 대체됩니다. 조심스럽게 ileocolic 접합부를 종양의 기저부에서 나눕니다. 맹장을 수집하려면 결장을 다시 나누고 종양의 기저부에 2cm 근위입니다.
   2. 키트^{V558Δ/+ 마우스의 50}%-60%에서 종양의 머리에는 일반적으로 장액이 포함되어 있지만 고름이 거의 포함되지 않을 수 있는 맹장 조직 캡이 포함되어 있습니다(그림 3). 뚜껑 조직을 종양 조직에서 급격하게 해부합니다.
   3. 필요에 따라 종양 조직 및/또는 맹장을 단백질 분리, 조직학 및 단일 세포 현탁액을 위해 삼분의 일로 나눕니다. 단일 세포 현탁액의 경우, 종양 조직 또는 맹장을 2% FCS로 HBSS에 넣고 샘플을 덮고 얼음 위에 보관할 수 있습니다.

4. GIST 조직의 웨스턴 블롯 분석

1. 50 mM TrisHCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% 변성 세제, 2 mM_Na3VO4, 1 mM PMSF, 10 mM NaF 및 20 μl/ml 프로테이나제 억제제 혼합물을 함유하는 조직 용해 완충액을 준비한다.
2. 1800 mL의 탈이온수, 2 mL의 트윈 20 및 200 mL의 10x 트리스 완충 식염수 (TBS)를 조합함으로써 1x 트리스 완충 식염수 용액을 1% 트윈 20 (TBST)으로 제조하였다.
3. 3.4.3단계의 조직을 5mL/g의 조직 용해 완충액의 FACS 튜브에 재현탁하고 얼음 위에서 15초 동안 15,000rpm의 기계적 균질기로 두 번 균질화합니다. 용해물을 얼음 위에서 30 분 동안 배양하십시오.
4. 용해물을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 4°C에서 20분 동안 최대 속도로 원심분리한다. 상층액을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
5. 용해물을 4% 내지 15% 구배 겔 상에서 실행한 다음,^{도 14}에 기재된 바와 같이 니트로셀룰로스 막으로 옮긴다.
6. 멤브레인을 1x TBS에서 5 분 동안 한 번 씻은 다음 1 시간 동안 5 % 우유에서 멤브레인을 차단하십시오. 다시 10 분 동안 1x TBS에서 멤브레인을 한 번 씻으십시오.
7. 4°C에서 5% BSA에서 1:1000으로 희석된 1차 항체의 멤브레인을 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 멤브레인을 1x TBST에서 각각 10분 동안 3배로 세척한다. 블롯을 실온에서 1시간 동안 2.5% 우유에 1:2500으로 희석한 이차 항체로 인큐베이션한다.
8. 멤브레인을 1x TBS에 한 번 5 분 동안 씻으십시오. 멤브레인(일반적으로 200-500 μL)을 덮기에 충분한 HRP 기질을 첨가하고, 디지털 이미저를 사용하여 화학발광을 검출하고 정량화한다.

5. 지스트 조직의 면역조직화학

1. 단계 3.3.2 또는 3.4.3에서 4°C에서 하룻밤 동안 4% 파라포름알데히드에서 조직을 고정시킨다. 처리 준비가 될 때까지 조직을 70% EtOH에 보관하십시오. ^15,16에 기재된 바와 같이 유리 슬라이드 상에⁵ μm 두께의 블록을 임베딩하고 단면화한다.
2. 앞서 기술한 바와 같이 기본적인 면역검출 키트를 이용한 완전한 면역조직화학 검출¹⁷.

6. 장간막 림프절의 단일 세포 현탁액

1. RPMI 배지를 단계 3.3.2의 림프절 표본과 함께 100 μm 필터 위에 붓는다. 필터를 새로운 50mL 원뿔형 및 매쉬 림프절로 옮기고 3mL 플라스틱 주사기의 부드러운 끝을 만듭니다. 20 mL의 RPMI 매질로 필터를 세척하십시오.
2. 여액을 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리한다. 상층액을 흡인하십시오.
3. 펠렛을 PBS(비드 버퍼) 중의 1% FBS 중 20 mL에 재현탁시키고, 40 μm 필터 위에 부었다. 세포 여액을 수집한다. 혈구분석기를 사용하여 세포를 계수합니다.
4. 여액을 4°C에서 5분 동안 450 x g 에서 원심분리한다. 상층액을 흡인하십시오. 유세포 분석을 위해 비드 버퍼에 6 x 10⁷ cells/mL로 재현탁하십시오.

7. GIST의 단일 세포 현탁액

1. 250 mg의 콜라게나제 IV, EDTA가 없는 프로테아제 억제제 100 μL의 정제 및 100 μL의 DNase I을 HBSS 50 mL에 첨가하여 콜라게나제 완충액을 제조하였다. 용해될 때까지 실온에서 10분 동안 회전시킨다.
2. GIST를 멸균 접시에 넣고 콜라게나제 버퍼 2.5 mL를 첨가하십시오. 종양이 미세 파편에 있을 때까지 멸균된 메스와 가위를 사용하여 종양을 다듬는다. 큰 보어 피펫을 사용하여 종양과 콜라게나제를 50 mL 튜브에 흡인하십시오.
3. 진탕 인큐베이터에서 30분 동안 37°C에서 100 rpm으로 인큐베이션한다. 2 mL의 FBS로 반응을 냉각시킨다.
4. 콜라게나제를 GIST 시편과 함께 100 μm 필터 위에 붓고 3 mL 플라스틱 주사기의 부드러운 끝으로 종양을 매쉬하고 50 mL 튜브에 수집한다. HBSS 20mL로 필터를 세척합니다. 여액을 450 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 흡인하십시오.
5. 펠렛을 20 mL의 비드 버퍼에 재현탁시키고 40 μm 필터 위에 부어준다. 여액을 수집하고 혈구분석기를 사용하여 세포를 계수하십시오. 여액을 450 x g, 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 흡인하십시오. 유세포 분석을 위해 비드 버퍼에 6 x 10⁷ cells/mL로 재현탁하십시오.

8. 맹장의 단일 세포 현탁액

1. 단계 7.1에서와 같이 콜라게나제 완충액을 준비한다. 가위를 사용하여 맹장을 세로로 분할하여 내부 점막을 노출시킵니다. 0.5cm 절편으로 자르고 2% FBS가 있는 HBSS 5mL가 있는 50mL 튜브에 넣습니다. 30초 동안 격렬하게 흔들고, 450 x g에서 20 초 동안 원심분리한 다음, 상층액을 흡인시킨다.
2. HBSS 5 mL를 2 mM EDTA와 함께 첨가하십시오. 진탕 인큐베이터에서 37°C에서 100 rpm으로 15분 동안 인큐베이션한다. 450 x g 에서 20초 동안 원심분리한다. 상층액을 흡인하십시오.
3. HBSS 5 mL를 첨가하십시오. 30초 동안 격렬하게 흔들고, 450 x g에서 20 초 동안 원심분리한 다음, 상층액을 흡인시킨다. 한 번 더 반복하십시오.
4. 콜라게나제 버퍼 5 mL를 첨가한다. 100 rpm에서 30분 동안 37°C의 진탕 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 10분마다 격렬하게 흔들어 주십시오. 2 mL의 FBS로 반응을 냉각시킨다.
5. 콜라게나제를 맹장 검체와 함께 100 μm 필터 위에 붓고 3 mL 플라스틱 주사기의 부드러운 끝으로 매쉬한다. HBSS 20mL로 필터를 세척합니다. 여과액을 수집하십시오.
6. 여액을 4°C에서 5분 동안 450 x g에서 원심분리한다. 상층액을 흡인하십시오. 펠렛을 20mL의 비드 버퍼에 재현탁하고 40 μm 필터 위에 붓는다. 여액을 수집하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수하십시오.
7. 여액을 4°C에서 5분 동안 450 x g에서 원심분리한다. 상층액을 흡인하십시오. 유세포 분석을 위해 비드 버퍼에 6 x 10⁷ cells/mL로 재현탁하십시오.

결과

키트^V558Δ/+ 마우스 모델은 면역적격 마우스 모델에서 치료제의 조사를 가능하게 한다. 키트^V558Δ/+ 마우스는 진행성 장 폐쇄로 인해 평균 수명이 8개월입니다(그림 4). 키트^V558Δ/+ 마우스로부터의 종양은 티로신 키나제 키트 및 막횡단 채널 DOG1(도 5) 및 전사 ?...

토론

키트^V558Δ/+ 마우스 모델은 GIST의 분자 및 면역학적 분석에서 강력한 연구 도구입니다. 번식 전략에는 단일 교차가 필요하지만 종양 반응을 분석하는 실험에서 키트^{V558Δ / +} 마우스 코호트를 사용하려면 광범위한 번식이 필요합니다. 마우스는 유사한 종양 중량을 보장하기 위해 연령 및 성별이 일치해야하며, 종양이 확립 될 때 생쥐의 10 %가 생후 8 주 전에 사망합니다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 micron filter	EMSCO	1194-2360
1x RBC lysis buffer	Life Technologies	00-4333-57
3mL syringe	Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences	14823435
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 µl	Bio-Rad	4561083
4% Paraformaldehyde Solution	Thermo Fisher Scientific	AAJ19943K2
40 micron filter	EMSCO	1194-2340
5M NaCl	Sigma Aldrich	S6546
70 micron filter	EMSCO	1194-2350
AKT antibody (C67E7)	Cell Signaling	4691
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory
Collagenase IV	Sigma Aldrich	C5138
Complete mini edta free protease inhibitor	Thomas Scientific	C852A34
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific
Disposable Scalpels	Thermo Fisher Scientific/Exel International	14-840-00
Dnase I	Thomas Scientific	C756V81
Dog1 antibody	abcam	ab64085
EDTA	Sigma Aldrich	E9884
ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9102
FBS	Thomas Scientific	C788U23
FIJI software	FIJI		https://imagej.net/software/fiji
Fisherbrand 850 Homogenizer	Thermo Fisher Scientific	15-340-169
HBSS	University of Pennsylvania Cell Center
Imatinib mesylate	Selleck Chemicals	S1026
KIT antibody (D13A2)	Cell Signaling	3074
KitV558Δ/+ Genotyping	Transnetyx
Microcentrifuge tubes (1.5mL)	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Mouse on Mouse Immunodetection Kit, Basic	Vector Laboratories	BMK-2202
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm	Rio-Rad	1620145
Nonfat Dry Milk	Thermo Fisher Scientific	NC9121673
Nonidet P 40 Substitute	Sigma Aldrich	74385
p-AKT antibody (S473)	Cell Signaling	4060
p-ERK antibody (p44/42)	Cell Signaling	9101
p-KIT antibody (Y719)	Cell Signaling	3391
PMSF Protease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	36978
Proeinase K	Thermo Fisher Scientific	BP170050
Round-Bottom Polystyrene Test (FACS) Tubes	Falcon/Thermo Fisher Scientific	14-959-2A
RPMI	University of Pennsylvania Cell Center
Sodium fluoride (NaF)	Sigma Aldrich	201154
Sodium orthovanadate (Na3VO4)	Sigma Aldrich	S6508
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate	Thermo Fisher Scientific	34076
TBS buffer (10x)	University of Pennsylvania Cell Center
Tissue culture dish (100mm2)	Thermo Fisher Scientific/Falcon	08-772E
TrisHCL	Thermo Fisher Scientific	BP1757500
Tween 20	Rio-Rad	1706531
vivaCT 80 platform	Scanco medical