Bottom-Up In Vitro Methods to assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

요약

셉틴은 세포골격 단백질이다. 그들은 지질 막과 상호 작용하고 미크론 규모에서 막 곡률을 감지 할 수 있습니다. 우리는 막 변형, 곡률에 민감한 셉틴 결합 및 셉틴 필라멘트 초 구조를 분석하기위한 상향식 시험관 내 방법론을 설명합니다.

초록

막 리모델링은 원형질막과 세포 소기관 내에서 지속적으로 발생합니다. 환경 (이온 조건, 단백질 및 지질 조성물, 막 곡률)과 특정 막 재구성 과정과 관련된 다양한 파트너의 역할을 완전히 해부하기 위해 우리는 시험관 내 상향식 접근법을 수행합니다. 최근 몇 년 동안, 주요 질병과 관련된 셉틴 단백질의 역할을 밝히는 데 관심이 높아지고 있습니다. 셉틴은 원형질막과 상호작용하는 필수적이고 유비쿼터스 세포골격 단백질이다. 그들은 다른 기능들 중에서도 세포 분열, 세포 운동성, 신경 형태 형성 및 정자 형성에 연루되어 있습니다. 따라서 셉틴이 멤브레인에서 어떻게 상호 작용하고 조직되어 멤브레인 변형을 유도하고 특정 막 곡률에 어떻게 민감 할 수 있는지 이해하는 것이 중요합니다. 이 기사는 분자 수준에서 셉틴의 초 구조와 미크론 규모로 발생하는 막 리모델링 사이의 상호 작용을 해독하는 것을 목표로합니다. 이를 위해, 싹트는 효모 및 포유동물 셉틴 복합체를 재조합적으로 발현하고 정제하였다. 이어서 , 시험관내 분석의 조합을 사용하여 막에서 셉틴의 자가조립을 분석하였다. 지지된 지질 이중층(SLBs), 거대한 유니라멜라 소포(GUVs), 큰 유니라멜라 소포(LUVs) 및 물결 모양의 기질을 사용하여 셉틴 자가조립, 막 재구성 및 막 곡률 사이의 상호작용을 연구하였다.

서문

셉틴은 지질막과 상호작용하는 세포골격 필라멘트 형성 단백질이다. 셉틴은 진핵생물에서 유비쿼터스이며 수많은 세포 기능에 필수적입니다. 이들은 신진 효모 및 포유류 ^1,2에서 세포 분열의 주요 조절자로 확인되었다. 그들은 막 재형성 사건, ciliogenesis³ 및 정자 생성⁴에 관여합니다. 포유동물 세포 내에서, 셉틴은 또한 Rho GTPases (BORG)-의존성 방식⁸의 결합제에서 액틴 및 미세소관 ^5,6,7과 상호작용할 수 있다. 다양한 조직(뉴런⁹, 섬모³, 정자¹⁰)에서, 셉틴은 막 결합 성분(¹¹)에 대한 확산 장벽의 조절자로서 확인되었다. 셉틴은 또한 막 블링 및 돌출부 형성⁽¹²)을 조절하는 것으로 나타났다. 멀티 태스킹 단백질인 셉틴은 다양한 유행하는 질병의 출현에 연루되어 있습니다¹³. 그들의 잘못된 조절은 암(¹⁴) 및 신경퇴행성 질환⁽¹⁵)의 출현과 관련이 있다.

유기체에 따라, 몇몇 셉틴 서브유닛들(예쁜꼬마선충에서 두 개에서 인간의 경우 13개까지)이 모여 조직 의존적 방식으로 조직이 변하는 복합체를 형성한다⁽¹⁶). 기본 septin 빌딩 블록은 두 개에서 네 개의 서브 유닛을 수집하며, 두 개의 사본으로 존재하며 막대 모양의 palindromic 방식으로 자체 조립됩니다. 신진 효모에서 셉틴은 옥타머^17,18입니다. 계내에서, 셉틴은 종종 마이크로미터 곡률을 갖는 부위에 국한된다; 그들은 분열 수축 부위, 섬모와 덴드라이트의 기저부, 정자^19,20의 환부에서 발견됩니다. 막에서, 셉틴의 역할은 이중적인 것으로 보인다: 그들은 지질 이중층을 재형성하고 막 완전성을 유지하는데 연루된다⁽²¹). 따라서 멤브레인에서 셉틴 필라멘트 형성 단백질 및 / 또는 서브 유닛의 생체 물리학 적 특성을 조사하는 것은 그 역할을 이해하는 데 중요합니다. 잘 조절된 환경에서 셉틴의 특정 특성을 해부하기 위해, 상향식 시험관내 접근법이 적절하다. 지금까지, 단지 몇몇 그룹만이 시험관내 셉틴 ^20,22,23의 생체물리학적 특성을 기술^하였다. 따라서, 다른 세포골격 필라멘트와 비교하여, 시험관 내에서 셉틴의 거동에 대한 현재의 지식은 여전히 제한적이다.

이 프로토콜은 셉틴 필라멘트의 조직, 막 재구성 및 곡률 감도가 어떻게 분석될 수 있는지를 기술한다⁽¹⁹). 이를 위해, 광학 및 전자 현미경 검사 방법(형광 현미경, cryo-electron microscopy[cryo-EM] 및 주사 전자 현미경[SEM])의 조합이 사용되었다. 마이크로 미터 크기의 거대한 unilamellar vesicles (GUVs)의 막 재구성은 형광 광학 현미경을 사용하여 시각화됩니다. 지질 소포에 결합된 셉틴 필라멘트의 배열 및 초구조의 분석은 cryo-EM을 사용하여 수행된다. 셉틴 곡률 감도의 분석은 가변 곡률의 물결 모양의 기질에 증착 된 고체 지지형 지질 이중층에 결합 된 셉틴 필라멘트의 거동을 연구함으로써 SEM을 사용하여 수행되며, 이는 양의 곡률과 음의 곡률 모두에 대한 곡률 감도의 분석을 가능하게합니다. 이전 분석^20,24와 비교하여, 여기서는 셉틴이 어떻게 자체 조립되고, 시너지 효과를 발휘하여 막을 변형시키고^, 곡률에 민감 할 수 있는지 철저히 분석하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 것을 제안합니다. 이 프로토콜은 막에 대한 친화도를 표시하는 임의의 필라멘트 단백질에 유용하고 적응가능한 것으로 여겨진다.

프로토콜

1. 거대한 유니라멜라 소포(GUV)를 이용한 막 재성형 결정

참고: 이 섹션에서 GUV는 세포 맥락에서 셉틴에 의해 유도될 가능성이 있는 막 변형을 모방하기 위해 생성된다. 실제로, 세포에서, 셉틴은 마이크로미터 곡률을 가진 부위에서 자주 발견된다. GUV는 몇 마이크로미터에서 수십 마이크로미터에 이르는 크기를 가지며 변형될 수 있습니다. 따라서 이들은 임의의 마이크로미터 규모의 셉틴-유도된 변형을 검정하는데 적절하다. 형광 지질뿐만 아니라 형광 표지 된 셉틴 (녹색 형광 단백질 [GFP] 사용)은 형광 현미경을 통해 지질과 단백질 모두의 거동을 추적하는 데 사용됩니다.

1. 완충액 및 용액의 제조
   1. GUV 성장 완충액 (50 mM NaCl, 50 mM 수크로오스, 및 10 mM 트리스[pH = 7.8]) 및 관찰 완충액 (75 mM NaCl 및 10 mM 트리스[pH = 7.8])을 준비하였다.
   2. (상업용 삼투압계 사용)을 측정하고 관찰 및 성장 완충액의 삼투압을 조정하십시오 (170 mOsmol· ^L-1, 이론적으로) 각각의 삼투압이 동일할 때까지 소량의 NaCl을 첨가한다. 0.2 μm 필터를 사용하여 버퍼를 필터링합니다. 성장 완충액을 분취하고, 추가의 사용을 위해 이를 -20°C에서 저장한다. 관찰 완충액을 4°C에서 저장한다.
      참고: 두 버퍼 간의 삼투압 차이는 5%를 초과해서는 안 됩니다.
   3. 관찰 완충액에 5 mg·^{mL-1 β-} 카제인 용액을 준비한다. 완전한 용해를 보장하십시오 (자기 교반으로 4 °C에서 몇 시간 후). 용액을 0.2 μm 필터, 분취액으로 여과하고, -20°C에서 저장한다.
2. 지질 혼합물을 클로로포름에서 3 mg·^mL-1 의 총 지질 농도로 준비한다. 56.8% 달걀 L-α-포스파티딜콜린(EggPC), 15% 콜레스테롤, 10% 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 10% 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS), 8% 뇌 L-α-포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트(PI(4,5)P2), 및_0.2% 보디피-TR-세라미드의 조성물(몰%)을 사용하여 단백질-지질 상호작용을 강화하고 PI(4,5)_P2²⁵의 혼입을 선호한다.
   참고: 니트릴 장갑과 안전 안경을 사용하여 흄 후드 아래에서 클로로포름을 다루십시오. 유리 주사기가있는 피펫 클로로포름 용액과 클로로포름이 플라스틱을 녹일 때 플라스틱을 피하십시오. 사용 전후에 클로로포름 5x-10x를 피펫팅하여 주사기를 헹구십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 특정 형광 지질을 피펫에 별도의 주사기를 사용하십시오. 지질은 테프론으로 캡핑된 호박색 유리 바이알에서 -20°C에서 클로로포름에 저장될 수 있다. 바이알은 닫기 전에 아르곤으로 채워야하며 지질 산화를 방지하기 위해 파라 필름으로 밀봉해야합니다.
3. 백금 전선 설정을 사용한 GUV의 전기 형성
   참고: 그림 1 은 실험 단계의 계획과 챔버의 사진을 보여줍니다.
   1. 챔버와 백금 와이어를 다음과 같이 철저히 청소하여 지질 잔류 물을 제거하십시오.
   2. 전선과 챔버를 아세톤에 넣고 10 분 동안 초음파 처리하십시오. 아세톤을 사용하여 종이 티슈로 조심스럽게 닦으십시오.
   3. 전선을 삽입하여 챔버를 조립하고, 아세톤에 다시 뛰어 들고, 10 분 동안 초음파 처리하십시오. 아세톤으로 한 번 더 닦아서 전선이 완전히 청소되었는지 확인하십시오. 챔버를 에탄올에 담그고 10 분 동안 초음파 처리 한 다음 에탄올로 닦으십시오.
   4. 마지막으로, 챔버를 탈이온수에 담그고 10 분 동안 초음파 처리하고 질소 또는 공기의 흐름으로 건조시킵니다.
      참고: 테프론 챔버(그림 1B)는 사내 작업장에서 맞춤 제작되었습니다. 유리 커버 슬립을 사용하여 양면을 밀봉 할 수있는 세 개의 구획을 수용합니다. 백금 와이어는 직경 1.3mm 구멍을 통해 챔버에 삽입 할 수 있습니다.
   5. 챔버를 세척한 후, 각 백금 와이어에 3 mg·mL-1 지질 혼합물의 구획당 ^3-4 방울(각 방울은 약 0.1 μL)을 증착한다. 전선을 180° 돌리고 각 백금 와이어의 반대쪽에 구획당 3-4개의 지질 방울을 증착합니다. 방울이 서로 접촉하지 않도록하십시오. 전체 챔버 당 약 5 μL의 지질 혼합물이 필요하다.
   6. 성장 챔버를 진공 챔버에 30분 동안 두어 클로로포름의 임의의 흔적을 제거하였다.
      참고: 깊은 진공 (0.1 mbar)이 가장 좋습니다. 건조되면 지질은 산화에 취약하므로 몇 분 이상 공기 중에 방치해서는 안됩니다.
   7. 주사기를 사용하여 세 구획의 주변을 따라 챔버 바닥(전선에 가장 가까운 쪽)에 고진공 그리스를 증착하고 그리스에 대해 깨끗한 (22mm x 40mm) 커버슬립을 눌러 완벽한 밀봉을 보장합니다. 밀봉 페이스트 (왁스 플레이트)를 사용하여 챔버의 양쪽 사지 (즉, 와이어의 입구 / 출구 부위)를 밀봉하십시오. 마찬가지로, 챔버의 반대편에 진공 그리스를 바르십시오.
   8. 피펫을 사용하여 구획을 성장 완충액 (챔버 당 ~ 1 mL)으로 채 웁니다. 전선에서 지질 막이 분리되는 것을 방지하기 위해 용액을 너무 빨리 또는 강하게 교반하지 마십시오. 22mm x 40mm 커버슬립을 사용하여 챔버 상단을 그리스에 대고 눌러 밀폐합니다. 기포가 형성되지 않도록 하려면 유리 커버슬립을 중앙에서 가장자리로 부드럽게 누릅니다.
      1. 챔버를 4°C 냉장고에 놓고 전선을 파동 함수 발생기(500Hz에서 사인 함수)에 연결합니다. Beber et al.25의 연구에서 이미 제시되고 최적화 된 바와 같이 더 짧은 성장 기간 (즉, 6h) 동안 350mV 또는 더 긴 성장 기간 (즉, 12-16h) 동안 ^250mV의 유효 전압을 설정하십시오.
   9. 커버 슬립을 제거하고 실란트와 그리스를 닦아내고 전선을 제거하십시오. 물과 에탄올 (≥70 %)을 번갈아 사용하여 챔버를 종이 티슈로 씻고 문질러 닦으십시오.
      참고: GUV 성장을 위한 최적의 전압 및 시간 스케일은 버퍼 염 농도에서 챔버 지오메트리(즉, 와이어와 챔버 크기 사이의 거리)에 이르기까지 많은 파라미터에 따라 달라집니다. 재현성을 보장하기 위해 실험을 반복 할 때마다 동일한 챔버를 사용하십시오. 전선은 챔버의 바닥과 근접하여 지질이 형광 현미경을 사용하여 이미징 될 수 있도록합니다. 각 단계에서 지질을 이미지화하여 ( 그림 1C, D 참조) 전기 형성 과정이 성공적인지 확인하십시오.
4. 소포와 함께 셉틴 인큐베이션
   1. 전선에 가까운 부근으로 가져온 사전 절단 피펫 팁(~1mm 개구부)을 사용하여 전선에서 GUV를 수집합니다. 그런 다음 용액을 와이어를 따라 모두 피펫하십시오. 이 절차는 GUV를 방해 할 수있는 강력한 라멜라 흐름의 생성을 방지합니다. 이 단계에 따라 파이펫 팁을 절단할 필요가 없습니다. 실제로, 라멜라 흐름은 솔루션의 GUV를 손상시키지 않습니다.
      참고: 지질 혼합물에 PI(4,5)_P2 가 존재하기 때문에, 수집된 GUV는 실험 전에 2-3시간 이상 저장되지 않아야 한다. 실제로, PI(4,5)_P2 는 빠르게 가용화되고 셉틴은 형성 후 몇 시간 후에 더 이상 막에 결합하지 않는다. 그러나 일단 셉틴이 막에 결합되면 며칠 동안 묶여 있습니다.
   2. 셉틴 원액을 트리스 10 mM (pH 8)에 희석하여 성장 완충액과 동일한 삼투압에 도달하도록 배타적으로; 필요한 경우 셉틴 용액을 관찰 완충액에 더 희석하십시오. 수집된 GUV의 의도된 부피를 첨가한다(200 μL의 총 부피에 대해 50-100 μL). β-카제인으로 패시베이션 후 관찰 챔버에서 직접 인큐베이션을 수행한다(아래 참조). 평형에 도달하려면 20-30 분의 대기 시간이 필요합니다.
      참고: 셉틴 옥타머 복합체(인간 또는 신진 효모)의 발현 및 정제는 다른 제¹⁷조에 광범위하게 기술되어 있다. 간략하게, 에스케리치아 콜라이에서 셉틴을 발현시키고, 친화도, 크기-배제 및 이온 교환 크로마토그래피 단계를 사용하여 실험실에서 정제하고, ∼1 mg·mL-1 (3 μM) 농도에서 50 mM Tris-HCl (pH 8), 300 mM KCl, 및 5 mM MgCl2의 수용액 중에서 ^-80°C에서 저장하였다. 높은 염 농도는 셉틴 응집을 피하기 위해 사용됩니다. 셉틴 복합체는 필터 원심분리 장치를 통해 농축되어서는 안되며, 이는 응집을 유도하고 따라서 단백질 수율을 감소시킨다.
5. 공초점 및/또는 회전 디스크 현미경을 사용한 이미징
   1. GUV가 표면에 달라붙거나 폭발하는 것을 방지하기 위해, 관찰실을 5mg·^mL-1 β-카제인 용액으로 30분 동안 인큐베이션하여 부동태화시킨다.
   2. β-카제인 용액을 제거하고 셉틴-GUV 용액(단계 1.4.2.)을 피펫을 이용하여 관찰 챔버 내로 옮긴다. GUVs 침전물을 챔버의 바닥에 10-15 분 동안 두십시오.
      참고: GUV의 내부와 외부 버퍼 사이의 조성 불일치는 밀도와 굴절률 불일치를 만듭니다. 굴절률 불일치로 인해 GUV는 투과광 광학 현미경으로 볼 수 있습니다.
   3. 공초점 현미경을 사용하여 지질의 형광 신호를 시각화하여 GUVs 품질 및 막 라멜라리티 상태를 확인합니다. 적절한 교정(²⁵)을 수행한 후에 셉틴의 형광 신호를 기록함으로써 GUVs에 결합된 셉틴의 밀도를 평가한다. 0.4μm 공간 간격으로 Z-스택 수집을 수행하여 셉틴과 멤브레인 간의 상호 작용에 의해 유도된 소포의 3D 변형을 분석하고 시각화합니다.
      참고: 60배 또는 100배 배율의 오일 침지 목표가 사용되었습니다. 표준 공초점 또는 방사 디스크 현미경(Table of Materials)을 각각 250nm 및 110nm의 픽셀 크기로 사용하여 사용하였다. 이미징 조건을 주어진 장비에 맞게 조정해야 합니다. 특정 항-사진 표백제가 용액에 첨가되지 않았다.

그림 1: GUV 의 전기 형성. (A) 백금 와이어를 이용한 전기 형성 공정의 개략적 표현. (B) 전기 형성에 의해 GUV를 생성하는 데 사용되는 백금 와이어로 조립 된 테프론 수제 장치의 사진. 전선은 직경이 0.5mm이고 떨어져 있으며 3mm 떨어져 있습니다. (c) 성장 과정 동안 투과 광학 현미경에 의해 관찰된 GUV(구형 개체). 이미지 하단의 불투명 영역은 백금 선입니다. (d) GUVs(둥근 형광 개체)는 백금 와이어 상에서 성장하는 동안 형광 현미경으로 관찰되었다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 저온전자현미경에 의한 셉틴 필라멘트의 초구조조직 분석

참고: 베시클은 표준 전자 현미경 검사 방법으로 이미징하는 데 적합하지 않습니다. 실제로, 샘플은 표준 음성 염색 방법을 사용하여 건조됩니다. 탈수시, 소포는 비특이적 변형을 겪을 가능성이 높으며, 종종 지질 돌출을 초래합니다. 따라서 Cryo-electron microscopy는 소포의 특정 변형을 관찰하는 훨씬 더 나은 전략입니다. cryo-EM을 사용하여 샘플은 유리화 된 얼음의 얇은 (~ 100-200nm) 층 내에 매립되어 샘플을 자연 상태에 가깝게 보존합니다. 그러나 GUV는 너무 커서 (수십 마이크로 미터) 얇은 얼음 내에 매립되어 투과 전자 현미경으로 이미징됩니다. 따라서 직경이 ~ 50-500nm에 이르는 대형 일라멜라 소포 (LUV)가 생성되어 셉틴이 소포를 변형시키는 방법과 소포에 배열하는 방법을 결정합니다.

1. 대형 유니라멜라 소포(LIV)의 생성
   1. 클로로포름에서 가용화된 지질 믹스 50 μg을 유리 바이알에서 막과의 셉틴 상호작용을 강화하도록 최적화된 57% EggPC, 15% 콜레스테롤, 10% DOPE, 10% DOPS 및 8% 뇌 PI(4,5)_P2)의 몰 조성물로 준비한다.
   2. 용액을 아르곤 유동 하에 건조시켜 바이알에서 건조된 지질 막을 생성한다. 바이알을 진공 하에 30분 동안 두어 지질을 완전히 건조시켰다.
   3. 지질 필름을 50 μL 수용액 (50 mM Tris-HCl [pH 8]; 50 mM KCl; 2 mM_MgCl2)에 재용해시켜 최종 농도 1 mg·^mL-1을 얻고, 10 초 동안 와류하고, 용액을 튜브로 옮긴다.
      참고 : LUV는 셉틴과의 배양을 위해 한 번에 사용해야합니다. 그렇지 않으면, 단백질-지질 상호작용은 PI(4,5)P2 가용화 때문에 약할 것이다. 이 조잡한 재가용화 과정은 직경이 50nm 내지 500nm 범위인 이종 소포 집단을 생성한다. 따라서 직경의 전체 범위와 곡률이 동시에 분석됩니다.
2. 가용화된 지질과 함께 셉틴을 각각 0.1 mg·^mL-1 (약 300 nM) 및 20 nM의 최종 지질 및 셉틴 농도로 고염 완충액 (50 mM Tris-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM_MgCl2)에서 인큐베이션한다. 샘플을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
3. 시료를 유리화하기 위한 급락 동결
   1. 플라즈마 발생기 장비를 사용하여 5mA에서 30초 동안 탄소 측에 정공 탄소 그리드(300메쉬)를 발광하고 습한 환경에서 급락 냉동 기계 내부에 그리드를 삽입합니다.
   2. 4 μL의 시료를 흡착(단계 2.2.)하여 그리드의 글로우 배출된 탄소 측에 흡착한다. 샘플 흡착 직전에 샘플이 냉동 단층 촬영에 의해 기울어 진 시리즈를 생성하는 데 사용될 경우를 대비하여 용액에 5-10nm 금 비드를 첨가하십시오.
      참고 : 금 비드의 밀도는 경험적으로 선별되고 조정되어야하며 공급자에 따라 다릅니다. 최적화 된 밀도는 시야각에서 10-15 금 비드입니다.
   3. 베어 측에서 샘플을 블롯 건조시켜 반대쪽에 샘플 드롭을 흡인시킨다.
      참고: 블롯팅 시간은 일반적으로 4초이며, 여과지의 위치와 블롯팅력은 여과지의 대체 위치를 테스트 및 스크리닝하여 얼음 품질(두께)과 재료 밀도를 최적화하여 경험적으로 조정됩니다.
   4. 그리드를 현미경으로 옮기거나 액체 질소 용기에 보관하십시오.
      참고 : 구멍이 많은 탄소 그리드를 사용하는 것은 소포 크기의 다분산성을 수용하는 데 필수적입니다. 반대편에서 샘플을 블롯팅하는 것은 그리드 상의 생물학적 물질의 향상된 흡착을 선호한다.
4. Cryo-electron microscopy imaging
   1. 그리드를 cryo-EM 관찰을 위해 장착된 전자 현미경(EM)에 삽입합니다. 전체 그리드를 낮은 배율(전형적으로 120x 배율에서)으로 전체 샘플의 맵을 생성함으로써 더 나은 얼음(즉, 얇고 잘 유리화된)을 표시하는 영역을 선택한다.
   2. cryo-EM 2D 데이터 수집의 경우 픽셀당 약 2Å의 픽셀 크기로 이미지를 수집하여 샘플의 품질을 확인합니다. 셉틴 필라멘트와 지질 이중층이 모두 보이는지 확인하십시오.
   3. 냉동 전자 단층 촬영 데이터 수집의 경우 변형 된 소포를 표시하는 관심 영역을 선택하십시오. 시야에 충분한 금 구슬(최소 10개)이 있는지 확인하십시오.
   4. 기울어진 시리즈 데이터 수집에 사용되는 소프트웨어에 따르면, 초점 선택 및 추적 위치가 관심 영역에서 충분히 멀리 떨어져 있습니다. 기울기 각도를 -60°에서 +60°로 변경하여 기울어진 계열을 수집하고 2°-3°도마다 이미지를 수집합니다.
      참고 : 총 용량은 약 100 전자 / Ų 미만이어야합니다. 픽셀 크기는 데이터 수집에 사용되는 현미경에 따라 1.3 Å에서 2.1 Å까지 다양합니다. 이상적으로, 데이터 수집을 위한 각도 대칭 방식은 다음과 같이 선호된다: 0°, -3°, +3°, -6°, +6°, -9°, +9° [...] -60°, +60°. 그러나, 측면 진입 현미경의 고니오미터는 이러한 대칭 방식을 달성하기에 충분한 기계적 안정성을 제공하지 못한다. 대안적으로, 획득은 0° 내지 34°에서 시작되고, 이어서 -2° 내지 -60°로부터의 제2 각도 시퀀스에 이어서, 36° 내지 60°로부터의 최종 시퀀스에 의해 종료될 수 있다. 목적은 가장 낮은 각도에서 첫 번째 이미지 (방사선 손상이 가장 낮음)를 수집하는 것입니다. 또한, 소포 및 결합 된 셉틴 필라멘트의 울트라 구조를 시각화하기 위해 표준 cryo-EM 현미경을 사용할 수 있습니다 (200kV, Lanthanum hexaboride (LaB6) 필라멘트 및 샘플 측면 입력). 그러나 추가 이미지 처리 (예 : 서브 토모그램 평균화)를 추구하는 것을 목표로하는 경우 직접 검출기가 장착 된 마지막 세대 전계 방출 건 (FEG) 현미경을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 이 프로토콜에서는 설명을 3D 재구성 획득으로 제한하고 하위 단층 측량 평균화를 생략합니다.
5. 냉동 단층 촬영 및 세분화를 통한 3D 재구성
   1. 기울어진 계열 이미지 정렬 및 3D 재구성^26,27을 위해 IMOD 소프트웨어 제품군(재료 표)을 사용하십시오. IMOD 내에서 신탁(금 비드) 위치에 따라 틸트 계열 정렬을 수행합니다. 또한, 필요한 경우, IMOD(²⁶) 내에서 콘트라스트 전달 기능(CTF) 결정 및 보정을 수행한다. 마지막으로, 각 단계를 엄격하게 따라 IMOD로 3D 재구성을 달성하십시오.
   2. 디스플레이를 위해 IMOD 소프트웨어 제품군으로부터 3Dmod²⁷ 을 사용하여 지질 이중층 및 셉틴 필라멘트를 수동으로 세그먼트화한다.

3. SEM을 이용한 셉틴의 곡률 감도 분석

참고: 셉틴이 마이크로미터 곡률에 어떻게 민감할 수 있는지 이해하기 위해, 시험관내 접근법이 마이크로미터 규모의 물결 모양의 물결 모양의 물결 모양의 패턴에 증착된 고체 지지형 지질 이중층으로 셉틴 필라멘트 복합체를 배양하는 데 사용되었습니다.

1. 물결 모양의 폴리디메틸실록산(PDMS) 패턴에서 물결 모양의 NOA(Norland 광학 접착제) 복제본 설계
   1. 250nm 진폭 및 2μm 측면 주기성 또는 다른 치수의 PDMS 물결 패턴을 사용하여 관심 단백질에 적합한 곡률을 분석합니다.
      참고: PDMS 물결 패턴은 Nania et ^al.28,29에 설명된 대로 설계되고 생성됩니다.
   2. 클린룸 환경에서 직경 1cm의 원형 유리 커버슬립에 5μL의 액체 NOA를 증착하고 PDMS 템플릿을 방울 위에 놓습니다. 5분 동안 자외선(320 nm)으로 처리하여 액체 NOA를 박막 폴리머 필름으로 광중합한다. 이어서, 갓 중합된 NOA로 커버슬립으로부터 PDMS 주형을 부드럽게 벗겨낸다.
      참고 : NOA는 광학 현미경 이미징에 적합한 일반적인 광학 투명 접착제입니다. 또한, NOA는 SEM 이미징 전에 수행된 화학적 고정 및 염색 공정에 내성이 있다. NOA 71 및 NOA 81 수지 모두 유사한 결과와 함께 사용될 수 있습니다. 초기 PDMS 패턴은 NOA 복제본을 생성하는 데 여러 번 사용할 수 있습니다. 수득된 NOA 복제물은 수개월 동안 실온에서 박스에 보관될 수 있다.
2. 지지된 지질 이중층의 생성 및 단백질 인큐베이션
   1. NOA 막을 공기 플라즈마 세척기를 사용하여 5분 동안 처리하여 표면을 친수성으로 만듭니다.
   2. 1 mg·^mL-1의 총 지질 농도에서 57% EggPC, 15% 콜레스테롤, 10% DOPE, 10% DOPS 및 8% 뇌 PI(4,5)_P2의 몰 조성을 갖는 작은 일조개 소포(SUVs)의 용액을 준비한다. 단계 2.1.3에 기재된 바와 같이 건조된 지질 필름을 관찰 완충액에 재현탁시켜 SUVs를 제조하였다. 용액이 투명해질 때까지 욕조 초음파 처리기를 사용하여 용액을 5-10 분 동안 부드럽게 초음파 처리하십시오.
      참고 : SUV의 솔루션은 -20 ° C에서 몇 주 동안 냉동 보관할 수 있습니다.
   3. NOA 패턴을 지지하는 커버슬립을 세포 배양 박스의 웰 내에 삽입하십시오. 100 μL의 1 mg·mL-1 SUV 용액을 갓 발광^- 배출된 NOA 패턴(단계 3.2.1)에 증착하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 이 단계는 SUVs와 NOA 패턴의 표면의 융합을 유도하여 지지된 지질 이중층을 생성한다.
   4. 슬라이드를 셉틴 완충액 (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM MgCl2_)으로 6x 완전히 헹구어 융합되지 않은 SUV를 제거하였다. 헹굼 할 때마다 샘플을 완전히 건조시키지 마십시오.
   5. 옥타머셉틴 원액을 셉틴 고염 완충액 (50 mM 트리스-HCl [pH 8], 300 mM KCl, 2 mM_MgCl2)에 희석하여 셉틴 완충액 (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2 mM_MgCl2)을 사용하여 10 nM 내지 100 nM 범위의 최종 농도, 및 1 mL의 부피로 희석한다. 단백질 용액을 실온에서 ∼1 h 동안 슬라이드에 인큐베이션한다.
      참고: 볼륨이 충분히 커서 증발이 문제가 되지 않습니다.
3. SEM 분석을 위한 시료 준비
   참고 : 단백질 구조와 그 어셈블리를 분석하기 위해 전자 현미경에서 다양한 프로토콜이 개발되었습니다. 현재의 프로토콜은 Svitkina et al.에서 파생 된 고정 프로토콜을 사용하여 셉틴 필라멘트의 조직을 보존합니다.³⁰ 구현하기 쉽습니다. 게다가,이 프로토콜은 고해상도 SEM 관찰을 최적화합니다.
   1. 시약 및 재고 용액의 제조
      참고: 이 프로토콜에는 인큐베이션 전에 미리 또는 직전에 준비할 수 있는 몇 가지 시약 및 솔루션이 필요합니다. 제공된 지침에 따라 유물이나 화학 반응성 부족을 피하십시오.
      1. 카코딜레이트 나트륨 0.2 M 원액: 이 이중 강도 용액을 제조하기 위해, 마그네틱 교반 하에 증류수 ~ 40 mL에 소듐 카코딜레이트 분말 2.14 g을 용해시킨다. 완전한 용해 후, 0.1 M HCl (용액 50 mL에 대해 ∼1 mL)을 부드럽게 첨가하여 pH를 7.4로 조정하고 증류수로 최종 부피를 구성한다. 이 솔루션은 4°C에서 24-48시간 동안 저장할 수 있습니다.
      2. 0.1 M 소듐 카코딜레이트(고정 용액) 중 2% 글루타르알데히드(GA): 고순도 EM 등급 GA를 0.2M 소듐 카코딜레이트 용액으로 희석하여 사용 직전에 이 용액을 준비하십시오(위 참조). 25%-50% 상용 GA 원액을 사용하면 4°C에서 최적화된 저장 용량을 사용할 수 있습니다. 10mL의 고정 용액을 준비하기 위해, 25% 상업용 GA 용액 0.8mL를 증류수 4.2mL와 0.2M 소듐 카코딜레이트 5mL로 희석한다.
      3. 0.1 M 소듐 카코딜레이트 중의 1% 오스뮴 테트록사이드(_OsO4): 상용 4%_OsO4 원액을 0.2 M 소듐 카코딜레이트로 희석하여 사용 직전에 이 제2 고정 용액을 준비한다(상기 참조). 4 mL의_OsO4 고정 용액의 경우, 4% 상용_OsO4 용액 1 mL를 증류수 1 mL와 0.2 M 소듐 카코딜레이트 2 mL로 희석한다.
         참고: 저장 및 취급 특성으로 인해 절단 가능한 유리 전구에 상용 4% OsO₄ 원액을 사용하십시오. _OsO4 는 매우 반응성이 높습니다. 색상이 약간 노란색이고 어둡지 않은지 확인하십시오.
      4. 물에 1 % 탄닌산 (TA) : 사용하기 직전에이 용액을 준비하십시오. TA 용액을 준비하여 실온에서 증류수에 최종 농도 1% TA를 얻었다. 10mg을 증류수 1mL에 녹이고 몇 분 동안 와류시킨다. TA 용액은 저장할 수 없으며 사용 전에 0.2μm 필터로 여과해야 합니다.
      5. 물에 1% 우라닐아세테이트(UA) 용액을 준비하여 증류수에 최종 농도 1% UA를 얻었다. 10 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 실온에서 볼텍스 또는 진탕하여 적어도 30분 내지 1시간 동안 와류시킨다. 이 용액은 4°C에서 1개월 동안 저장될 수 있지만 쉽게 침전될 수 있으므로 사용 전에 0.2μm 필터로 여과해야 한다.
      6. 등급이 매겨진 일련의 에탄올 용액을 물에 50 %, 70 %, 95 % 및 100 % 에탄올 용액을 준비하십시오. 새로 열린 병에서 100 % 에탄올 또는 분자체 (공칭 기공 직경 = 4 Å)로 적어도 24 시간 동안 탈수 된 100 % 에탄올에서 최종 욕조를 준비하여 건조 및 코팅을 방해 할 수있는 모든 물의 흔적을 샘플에서 제거하십시오. 규산염 입자가 재현탁 될 수 있으므로이 용액을 흔들지 않도록주의하십시오.
         참고: 이 프로토콜에 사용된 화학 시약을 취급할 때는 주의해야 합니다. 글루타르알데히드, 오스뮴 테트록사이드, 소듐 카코딜레이트, 우라닐 아세테이트는 모두 독성이 강하고 우라닐 아세테이트도 방사성입니다. 시약과 폐기물의 모든 조작은 실험실별 절차에 따라 개별 (장갑, 실험실 코트, 안전 안경) 및 집단 보호 (흄 후드 및 플렉시 글라스 실드)를 사용하여 수행해야합니다.
   2. 샘플 고정
      1. 샘플(즉, NOA 슬라이드를 융합된 담지 지질 이중층 및 인큐베이션된 단백질로 세척)을 PBS로 세척한다. PBS를 37°C에서 예열된 GA 고착 용액으로 교체하고 15분 동안 반응을 진행시켰다. 이어서, 샘플은 4°C에서 저장될 수 있다.
      2. 고정 용액을 제거하고 고정 된 샘플을 0.1 M 소듐 카코딜레이트 (세척 당 5 분)로 3x 부드럽게 흔들면서 씻으십시오.
      3. 샘플을_OsO4 고정 용액에서 10분 동안 인큐베이션하여 빛으로부터 최대한 보호하여 막성 구조물의 고정을 허용하고 샘플의 전기 전도도를 증가시킨다. 고정 용액을 제거하고 샘플을 증류수 (세척 당 5 분)에서 3x 부드럽게 흔들면서 씻으십시오.
      4. 세척된 샘플을 여과된 TA 고정 용액에서 최대 10분 동안 인큐베이션한다. TA 용액을 제거하고 샘플을 증류수(세척 당 5분)로 3x 세척하여 부드럽게 진탕시킨다.
      5. 세척된 샘플을 갓 여과된 UA 고정 용액에서 10분 동안 인큐베이션하여 빛으로부터 최대한의 보호를 한다. UA 용액을 제거하고 샘플을 증류수 (세척 당 5 분)에서 3x 부드럽게 진탕으로 세척하십시오.
   3. 샘플 탈수 및 임계점 건조
      참고: 공기 건조는 액체에서 기체 상태로 변할 때 원치 않는 표면 장력을 통해 시료의 손상을 방지하는 것은 허용되지 않습니다. EM에서 두 가지 방법이 확립되었다:_CO2의 초임계 상태에 도달하고 그의 임계점(31°C, 74 bar)을 우회하는 물리적 방법, 또는 감소된 표면 장력을 갖는 건조제인 헥사메틸디실라잔(HMDS)을 증발시키는 화학적 방법. CO2 및 HMDS는 물과 잘 섞이지 않는다. 결과적으로, 물의 모든 흔적은 건조 과정 동안 나중에 손상을 피하기 위해 전이 용매 (에탄올)로 대체되어야합니다.
      1. 샘플을 50% 내지 100%(무수) 에탄올 배쓰에서 시작하여 각 에탄올 용액에서 2-3분 동안 인큐베이션한다.
         참고: 욕조 사이의 에탄올 증발이 빠르기 때문에 공기 건조를 피하기 위해 시료 취급도 빨라야 합니다.
      2. 유리 슬라이드를 에탄올로 미리 채워진 임계점 건조기 안으로 옮기고 제조업체의 지침을 따르십시오.
         참고: 이 프로토콜에서는 자동 장치가 사용되었지만 모든 시스템을 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 장치마다 다를 수 있지만 에탄올을 완전히 제거하고 (이 프로토콜에서 25 조) 다른 용매 교환 (CO2 입구 및 에탄올 /_{CO2 배출구} ) 및 최종 감압 (이 프로토콜에서 거의 1 시간)의 속도를 줄이기 위해 최적화되어야합니다.
      3. 임계점 건조가 끝나면 장착 및 코팅 될 때까지 샘플을 데시케이터에 즉시 보관하십시오. 건조 된 샘플은 흡습성이 높기 때문에 가능한 한 빨리 코팅하십시오 (아래 참조).
         참고: 또는 HMDS는 더 저렴하고 빠른 방법을 제공할 수 있습니다. HDMS는 샘플에서 테스트된 적이 없지만, 이 접근법은 세포막^(31,32)의 내면에서의 단백질 관찰에 좋은 결과를 가져왔다.
   4. 샘플 장착 및 코팅.
      참고 : 생물학적 샘플은 전기 전도도 특성이 좋지 않기 때문에 SEM 관찰 전에 전도성 금속 필름으로 코팅해야합니다. 따라서 플라즈마-마그네트론 스퍼터링이 사용된다.
      1. 커버 슬립을 향후 SEM 관찰에 사용할 스텁에 부착하십시오. 탄소 디스크와 비교하여 향상된 전기 전도도 때문에 은색 페인트를 사용하십시오. 커버 슬립의 윗면에 은색 페인트 스트립을 추가하고 스텁과의 연결이 만족 스러운지 확인하십시오. 페인트 응집체를 피하십시오.
         참고: 실버 페인트 스트립은 고해상도(즉, 낮은 작동 거리)에서 작업할 때 샘플과 SEM의 대물 렌즈 사이의 접촉을 피하기 위해 얇아야 합니다.
      2. 용매가 완전히 증발 할 때까지 기다리십시오.
         참고: 이 단계의 지속 기간은 은 페인트 퇴적물의 양과 두께에 따라 달라질 수 있습니다. 이 단계는 벨 항아리 또는 코터 및 일차 진공을 사용하여 10-30분 동안 단축될 수 있다.
      3. 플라즈마-마그네트론 스퍼터링 헤드와 회전-행성 스테이지가 장착된 장치를 사용하고 제조업체가 제공하는 표준 프로토콜을 따르십시오. 여기서, 장치를 2.5 x 10-5 mbar로 배기시키고, 고품질 아르곤으로 1x를 퍼징한 다음, 8.0 x ^10-3 mbar로 조정하였다.
      4. 사전 스퍼터링(60초 동안 120mA)을 수행하여 표면에서 산화물 층을 제거합니다. 그런 다음 필름 두께 모니터의 도움으로 1.5nm의 텅스텐 (90mA, 작동 거리 = 50mm)을 증착하십시오.
         참고: 필름 증발의 재현성을 보장하기 위해 코터를 완벽하게 청소해야 합니다. 목표 두께에 도달하면 코팅을 중단해야 합니다. 최종 필름 두께는 나중에 계산되고 수정됩니다. 약 1.5nm의 필름은 평균적으로 우리 장치를 사용하여 0.7nm의 사후 보정을 갖는다. 이러한 보정 값이 대상에 가까우면 일련의 코팅이 수행되어 평가 한 다음이 보정을 목표 값에서 뺍니다.
      5. 샘플을 진공 하에 보관하여 모든 SEM 분석까지 주변 공기로부터 보호합니다.
         참고: 스퍼터링 문제에 사용되는 금속의 특성. Pt는 일반적인 재료임에도 불구하고 셉틴 필라멘트(1.5nm)에 적응된 Pt 막 두께로 품질이 떨어지는 코팅을 초래합니다. 고해상도에서, 1.5nm Pt 필름은 응집성이 결여되어 있다; Pt 클러스터와 셉틴 필라멘트의 크기는 유사해지고, 필라멘트 세분화 프로세스(³³ ) 동안 오해를 야기한다( 도 2A 참조, 인셋). 텅스텐은 고해상도 SEM에서 거의 볼 수없는 작은 입자 크기를 표시하기 때문에 Pt의 좋은 대안입니다 ( 그림 2B, 삽입 참조). 그럼에도 불구하고, 순수한 텅스텐은 쉽게 산화되어, 절차 3.3.4 단계에서 상술된 경우 SEM 관찰 동안 강한 대전 효과 아티팩트를 유도한다. 엄격하게 준수하지 않습니다.
4. 전계 방출 SEM (FESEM) 현미경을 사용하여 이미지를 획득한다.
   참고: SEM 기술은 최근 분해능을 향상시키기 위해 업그레이드되었으며 기술은 제조업체(예: 전자 광학, 빔 감속, 자기 렌즈)에 따라 다릅니다. 이러한 분해능 이득(여러 제조업체에서 액세스 가능), 특히 낮은 가속 전압(1kV의 나노미터 근처)에서 이러한 이득은 셉틴 네트워크와 유사한 나노메트릭 구조를 해결하는 데 필요합니다.
   1. 다음 설정을 사용하여 "렌즈 내" 검출기로 1차 이차 전자(SE1)의 검출을 통해 고해상도 이미징을 달성합니다.
   2. 가속 전압을 3kV로 설정합니다. 충전 효과 억제가 필요한 경우 빔 전류를 20μm 조리개(Zeiss Gemini I 컬럼의 경우 또는 34pA에 해당) 또는 15μm 조리개(Zeiss Gemini I 컬럼의 경우 또는 18.5pA에 해당)로 고정합니다.
   3. 관측치의 경우 21.25nm/pixel ~ 1.224nm/픽셀 범위의 해상도를 사용하고 데이터 분석에는 ~5.58nm/픽셀의 해상도(폴라로이드 545 참조에 따라 20,000x 배율)를 사용합니다.
   4. 고해상도 관찰을 위해 작동 거리를 1mm에서 2mm 사이로 설정하고, 피사계 심도를 늘려야 하는 경우 약 3mm로 설정합니다. 스캔 속도와 라인 통합을 지속적으로 조정하여 이미지 당 약 30-45 초의 수집 시간으로 일정한 신호 대 잡음비를 보장합니다.

도 2: 물결 모양의 PDMS 패턴에 대한 셉틴 필라멘트에 증착된 물질의 효과. 스퍼터링에 의해 코팅된 셉틴 필라멘트의 SEM은 (A) 1.5nm의 백금으로 백금 핵의 클러스터 사이의 응집력 부족의 전형적인 "건조 금이 간 토양" 패턴을 나타내거나, (B) 매끄럽고 응집력 있는 층으로 덮인 1.5nm의 텅스텐을 나타낸다. 스케일 바 = 200nm. 흰색 사각형 상자는 오른쪽 하단의 확대 된 뷰를 나타냅니다. 구형 소구는 세프틴과 상호 작용하는 작은 지질 소포입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

GUV 변형
셉틴과 함께 인큐베이션된 후 재성형된 GUVs의 전형적인 공초점 형광 이미지는 셉틴이 중합되는 조건에서 도 3에 표시된다. 베어 GUV(그림 3A)는 완벽하게 구형이었다. 50 nM 이상의 신진 효모 셉틴 필라멘트와 함께 인큐베이션시, 소포는 변형된 것처럼 보였다. 최대 100 nM 농도의 싹이 트인 효모 셉틴 옥타머까지, 소포는 패싯된 것처?...

토론

상기 언급된 바와 같이, 지질 혼합물이 지질 이중층 내에 PI(4,5)_P2 혼입을 강화하고 따라서 셉틴-막 상호작용을 용이하게 하는 데 사용되었다. 실제로, 우리는 다른 곳에서 신진 효모 셉틴이 PI (^4,5 ) P 2 특정 방식으로 소포와 상호 작용한다는 것을 다른_곳에서 보여주었습니다. 이 지질 조성물은 다수의 조성물을 스크리닝하는 것으로부터 경험적으로 조정되었고, 현...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	850725
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids	840035
Bath sonicator	Elma		Elmasonic S10H
Bodipy-TR-Ceramide	invitrogen, Thermo Fischer scientific	11504726
Chemicals: NaCl, Tris-HCl, sucrose, KCl, MgCl2, B-casein, chloroform, sodium cacodylate, tannic acid, ethanol	Sigma Aldrich
Confocal microscope	nikon		spinning disk or confocal
Critical point dryer	Leica microsystems		CPD300
Deionized water generator	MilliQ	F1CA38083B	MilliQ integral 3
Egg L-α-phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051
Field Emission Gun SEM (FESEM)	Carl Zeiss		Gemini SEM500
Glutaraldehyde 25 %, aqueous solution	Thermo Fischer scientific	50-262-19
High vacuum grease, Dow corning	VWR
IMOD software	https://bio3d.colorado.edu/imod/		software suite for tilted series image alignment and 3D reconstruction
Lacey Formvar/carbon electron microscopy grids	Eloise	01883-F
Lipids	Avanti Polar Lipids
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate	Avanti Polar Lipids	840046
Metal evaporator	Leica microsystems		EM ACE600
NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 and NOA 81	Norland Products	NOA71, NOA81
Osmium tetraoxyde 4%	delta microscopies	19170
Osmometer	Löser		15 M
Plasma cleaner	Alcatel		pascal 2005 SD
Plasma generator	Electron Microscopy Science
Plunge freezing equipment	leica microsystems		EMGP
Transmission electron microscope	Thermofischer		Tecnai G2 200 kV, LaB6
Uranyl acetate	Electron Microscopy Science	22451	this product is not available for purchase any longer
Wax plates, Vitrex	VWR