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요약

S1P는 S1P 수용체(S1PRs) 서브패밀리를 통해 다양한 생리적 효과를 발휘한다. 여기에서는 S1PR의 구조와 기능에 대해 설명하기 위해 파이프 라인에 대해 설명합니다.

초록

리소포스포지질(LPLs)은 스핑고신 1-포스페이트(S1P), 리소포스파티드산 등을 포함하는 생리활성 지질이다. 세포막에서 스핑고지질의 대사 산물인 S1P는 스핑고신 1-인산염 수용체(S1PRs)에 의해 매개되는 신호전달 경로를 통해 다양한 세포 생리적 반응을 조절하는 가장 특징적인 LPL 중 하나이다. 이것은 S1P-S1PRs 신호 전달 시스템이 다발성 경화증 (MS), 자가면역 장애, 암, 염증 및 심지어 COVID-19를 포함한 장애에 대한 주목할만한 잠재적 치료 표적임을 암시했다. 클래스 A G 단백질 결합 수용체 (GPCR) 패밀리의 작은 서브세트인 S1PRs는 S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 및 S1PR5의 다섯 가지 서브타입으로 구성된다. 그러나 상세한 구조 정보의 부족은 S1PR을 겨냥한 약물 발견을 방해합니다. 여기서는 S1P-S1PRs 복합체의 구조를 해결하기 위해 한전자현미경 방법을 적용하고, 세포 기반 기능성 분석법을 이용하여 활성화, 선택적 약물 인식 및 G-단백질 결합의 메카니즘을 해명하였다. 다른 lysophospholipid receptors (LPLRs) 및 GPCRs도 이 전략을 사용하여 연구될 수 있다.

서문

세포막에서 스핑고지질의 대사 산물인 스핑고신-1-포스페이트(S1P)는 림프구 밀매, 혈관 발달, 내피 완전성, 심박수1,2,3을 포함한 다양한 생물학적 활동을 수반하는 유비쿼터스 리소포스파티드 신호전달 분자이다. S1P는 5개의 S1P 수용체 아류형(S1PRs 1-5)을 통해 다양한 생리적 효과를 발휘한다. S1PR은 다양한 조직에서 발견되며 하류 G 단백질 4,5에 대한 독특한 선호도를 나타냅니다. S1PR1은 주로 Gi 단백질과 결합하며, 이는 후속적으로 cAMP 생산을 억제합니다. S1PR2 및 S1PR3은 Gi, Gq 및 G12/13과 결합되고, S1PR4 및 S1PR5는 Gi 및 G12/136을 통해 신호를 트랜스듀스한다.

S1P-S1PR 신호전달은 자가면역 장애7, 염증8, 암 9, 심지어 COVID-19 10을 포함한 다수의 질환에 대한 중요한 치료 표적이다. 2010년, 핀골리모드(FTY720)는 재발성 다발성 경화증(MS)11을 치료하기 위해 S1PR을 표적으로 하는 동급 최초의 약물로 허가되었습니다. 그러나, S1PR2를 제외한 모든 S1PR에 결합할 수 있는 반면, S1PR3에 대한 비특이적 결합은 대뇌 피질의 부종, 혈관 및 기관지 수축, 폐 상피 누출(12)을 초래한다. 치료 선택성을 증가시키기 위한 대안적인 전략으로서, 수용체에 대한 아류형 특이적 리간드가 생성되었다. 시포니모드 (BAF312)는 재발 MS 치료13에 대해 2019 년에 승인되었다; S1PR1 및 S1PR5를 효과적으로 타겟팅하는 반면, S1PR3에 대한 친화력은 없으므로 임상 실습14에서 부작용이 적습니다. 2020 년 미국 식품의 약국 (Food and Drug Administration)은 MS 요법15에 대한 ozanimod를 승인했습니다. ozanimod는 S1PR516보다 S1PR1에 대해 25 배 더 큰 선택성을 보유하고있다고보고되었습니다. 특히, 현재의 COVID-19 전염병의 맥락에서, S1PR을 표적으로 하는 작용제 약물이 면역조절 요법 기술(17)을 사용하여 COVID-19를 치료하는데 이용될 수 있다는 것이 발견되었다. 핀골리모드와 비교했을 때, 오자니모드는 COVID-19 환자의 증상을 낮추는 데 우월성을 보였으며, 현재 임상시험10을 진행 중이다. S1PR의 구조적 기초와 기능을 이해하는 것은 S1PRs(18)를 선택적으로 표적으로 하는 약물을 개발하기 위한 중요한 토대를 마련한다.

X선 결정학, 핵 자기 공명(NMR) 및 전자 현미경(EM)을 포함한 생체 거대분자의 구조 정보를 조사하기 위해 많은 기술이 사용됩니다. 2022년 3월 현재, 단백질 데이터뱅크(PDB)에 180,000개 이상의 구조물이 기탁되어 있으며, 대부분은 X선 결정학에 의해 해결되었다. 그러나 2013 년 Yifan Cheng과 David Julius가 201319 년에보고 한 TPRV1 (3.4 Å 해상도)의 첫 번째 근원자 분해능 구조로 인해 냉동 전자 현미경 (cryo-EM)은 단백질 구조의 주류 기술이되었으며 EM PDB 구조의 총 수는 10,000 개가 넘었습니다. 중요한 획기적인 분야는 직접 전자 감지 카메라 및 새로운 이미지 처리 알고리즘으로 알려진 이미징을위한 새로운 카메라 개발입니다. Cryo-EM은 지난20 년 동안 구조 생물학 및 구조 기반 약물 발견에 혁명을 일으켰습니다. 거대 분자 복합체가 살아있는 세포에서 복잡한 역할을 수행하는 방법을 이해하는 것이 생물 과학의 중심 주제이기 때문에 cryo-EM은 특히 막횡단 단백질21에 대한 동적 분자 복합체의 형태를 밝힐 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. G-단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 막횡단 단백질의 가장 큰 수퍼 패밀리이며 현재 시판되는 의약품22의 30 % 이상을 대상으로합니다. cryo-EM의 개발은 GPCR-G 단백질 복합체의 고해상도 구조의 파열에 기여하여 약물 설계23에서 X 선 결정 학적 분석에 여전히 접근 할 수없는 '난치성'표적에 대한 구조적 결정을 가능하게했습니다. 따라서, cryo-EM 애플리케이션은 원자 분해능(24)에 가까운 거의 네이티브 조건에서 GPCR의 입체 구조를 결정할 기회를 제공한다. cryo-EM의 발전은 GPCR 자극 또는 억제의 기계론적 토대를 시각화하는 것을 가능하게 하고, GPCR 표적 약물 생성(25)을 위한 신규한 결합 부위를 밝히는데 더 많은 이익을 가져온다.

cryo-EM 기술의 엄청난 진보에 의지하여, 우리는 최근26,27 개의 고뇌하는 S1PR1-, S1PR3- 및 S1PR5-Gi 신호 복합체의 구조를 확인했습니다. 인간에서, S1PR은 다양한 조직에서 발견되며 하류 G 단백질 4,5에 대한 독특한 선호도를 나타낸다. S1PR1은 주로 Gi 단백질과 결합하며, 이후 3',5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) 생산을 억제합니다. S1PR3 및 S1PR5는 Gi 6,28과도 결합할 수 있습니다. Gi 결합 수용체 활성화가 cAMP 29의 생산을 감소시키기 때문에, 기능적 변화를 포착하기 위한 cAMP 억제 효과를 측정하기 위해 Gi-억제 cAMP 분석법이 도입되었다26,27. cAMP 결합 단백질 모이어티가 삽입된 포티누스 피랄리스 루시퍼라제의 돌연변이 버전을 사용하여, 이 cAMP 분석은 세포내 cAMP 농도30의 변화를 통해 GPCR 활성을 모니터링하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 이는 민감하고 비방사성 기능성 분석법이며, 약물 발견 목적을 위해 광범위한 GPCRs의 실시간 다운스트림 신호전달을 모니터링하는데 적용될 수 있다(31).

여기서, S1PRs의 활성화 및 약물 인식 모드를 해결하는데 있어서 중요한 방법들에 대한 요약이 제공되며, 주로 cryo-EM 조작 및 Gi-억제 cAMP 분석을 포함한다. 이 기사는 GPCR의 구조와 기능에 대한 추가 탐구를위한 포괄적 인 실험 지침을 제공하는 것을 목표로합니다.

프로토콜

1. S1PRs-G 단백질 복합체의 정제

  1. 인간 S1PRs-G 단백질 복합체를 정제하기 위해, C 말단 잔기 338-382가 결여된 S1PR1의 cDNA를 복제하고, 야생형 S1PR3, C-말단에서 345-398로 잘린 S1PR5, 야생형 Gi1을 pFastBac1 벡터 및 야생형 Gβ1 및 Gγ2의 cDNA를 pFastBacdual 벡터로 복제한다(표 of Materials).
    참고: S1PR에 대한 모든 구축물은 또한 해마글루티닌(HA) 신호 서열 다음에 N-말단에 플래그 에피토프 태그를, C-말단에서 10x 그의 태그를 포함한다. 또한, 수용체 발현 및 정제를 촉진하기 위해 T4 라이소자임(T4L)을 번역하기 위한 합성 DNA 서열(표 물질)을 S1PRs의 N 말단에 삽입하였다.
  2. S1PRs, Gi1, 및 Gβ1γ2를 코딩하는 바큘로바이러스의 제조
    1. 재조합 벡터를 -80°C에서 1.5 mL 튜브에 저장된 DH5α 적격 에스케리치아 콜리(E. coli) 의 50 μL에 첨가하고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다.
    2. 세포를 42°C에서 90초 동안 열충격하고, 즉시 얼음으로 옮기고, 2분 동안 식힌다.
    3. 300 μL의 리조제니 브로스(LB) 배지로 보충한 후 3-5시간 동안 튜브를 37°C에서 흔들어라. 100 μL의 세포를 LB 아가 플레이트에 플레이트하고, 48시간 동안 어둠 속에서 유지함으로써 37°C에서 인큐베이션한다.
    4. 백색 콜로니를 50 μg/mL 카나마이신, 10 μg/mL 테트라사이클린, 7 μg/mL 겐타마이신을 함유하는 LB 배지 5 mL에 접종하고, 37°C에서 16시간 동안 배양하였다.
    5. P0 바큘로바이러스를 제조하기 위한 제조자의 지시에 따라 플라스미드 미니프렙 키트(표 재료)로 재조합 바미드를 분리한다.
      참고: 사용 전에, 정제된 바크미드를 pUC/M13 정방향 및 역방향 프라이머로 PCR에 의해 분석하였다. PCR의 경우, 사이클 수 = 30 사이클, 용융 온도 = 58 °C, 및 연장 시간 = 1 kb 당 1 분.
    6. 이전 프로토콜32에 기재된 바와 같이 P0 바큘로바이러스를 준비한다.
      1. sf9 세포 (ESF921 배지)를 6 웰 플레이트에서 배양하고 세포가 로그 단계 (1.0-1.5 x 106 세포 / mL)에 있는지 확인하십시오.
      2. 8 μL의 바큘로바이러스 형질감염 시약을 100 μL의 그레이스 배지에 희석하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 10 μg의 재조합 바크미드를 100 μL의 그레이스 배지에 희석하고, 부드럽게 혼합한다. 희석된 바크미드를 희석된 바큘로바이러스 형질감염 시약과 결합시키고, 부드럽게 혼합하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
      3. 혼합물 (bacmid 및 시약)을 세포 상에 첨가하고(단계 1.2.6.1), 이들을 27°C에서 3시간 동안 플레이트화한다.
      4. 그레이스 배지를 제거하고 2mL의 ESF921 세포 배양 배지로 교체하십시오. 여섯 웰 플레이트를 27°C에서 플레이트하고, 형질감염 후 5일 후에 ESF921 세포 배양 배지를 수집한다.
      5. 4°C에서 10분 동안 500 x g 의 원심분리하여 세포 및 파편을 제거하였다. 상청액을 2 mL 튜브로 옮긴다. 이것은 P0 바큘로 바이러스 스톡입니다.
    7. P1 바이러스 스톡 분리
      1. 30 mL의 sf9 세포를 원뿔형 병에 옮기고, 270 rpm에서 진탕하면서 27°C에서 배양하고, 세포가 로그상(1.0-1.5 x 106 cells/mL)에 도달하는지 확인한다.
      2. P0 바이러스 스톡 2 mL를 병에 첨가하고, 27°C에서 4일 동안 270 rpm으로 진탕하였다.
      3. 세포를 50 mL 튜브로 옮기고, 4°C에서 10분 동안 1,800 x g 에서 원심분리하여 세포 및 파편을 제거하고, 상층액을 50 mL 튜브로 옮겼다. 이것은 P1 바큘로 바이러스 스톡입니다.
    8. 바큘로 바이러스 스톡을 증폭
      1. 로그 단계에서 50mL의 sf9 세포(1.0-1.5 x 106 세포/mL)와 1mL의 P1 스톡을 사용하여 1.2.7단계를 반복합니다.
      2. 생성된 P2 바큘로바이러스 스톡을 4°C에서 저장하고, 빛으로부터 보호한다.
        참고 : 해로운 돌연변이가 각 통로마다 생성되었으므로 바큘로 바이러스를 무기한으로 증폭시키지 마십시오.
  3. S1PRs-G 단백질 복합체의 발현
    1. sf9 곤충 세포를 2.5 x 106 세포/mL 밀도에 도달하도록 배양하고, S1PRs, Gi1, 및 Gβ1γ2를 코딩하는 P2 바큘로바이러스를 1:2:1의 부피비로 공동감염시키고, 다시 27°C에서 48시간 동안 배양하였다.
    2. 세포를 4°C에서 15분 동안 700 x g 에서 원심분리하여 수집하고, 이를 액체 질소에 동결시키고, 이를 사용하기 위해 -80°C에 보관한다.
  4. 단백질 정제
    1. 단계 1.3에서 수득된 세포 펠렛을 실온에서 해동시킨 다음, 100 μg/mL 벤즈아미딘, 100 μg/mL 류펩틴, 100 μg/mL 아프로티닌, 25 mU/mL 아피라제 및 10 μM 작용제로 보충된 용해 완충액 (20 mM HEPES pH 7.5, 50 mM NaCl2, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, 5 mM CaCl2)에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 실온에서 2시간 동안 교반하여 S1PRs-G 단백질 복합체의 형성을 유도하였다.
      참고: Apyrase는 ATP 디포스포가수분해효소입니다. 그것은 ATP로부터의 감마 포스페이트의 제거와 ADP로부터의 베타 포스페이트의 제거를 촉매한다.
    2. 용액을 튜브로 옮기고, 70,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 제거한다. 펠렛을 가용화 완충액 (20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mMMgCl2, 5 mMCaCl2, 0.5% (w/v) LMNG, 0.1% (w/v) CHS, 1% (w/v) 콜레이트 나트륨, 10% (v/v) 글리세롤)에 재현탁시킨다.
    3. 현탁액을 유리 Dounce로 옮기고 펠렛을 완전히 균질화하십시오. 현탁액에 10 μM 작용제, 4 mg의 scFv16, 100 μg/mL 벤즈아미딘, 100 μg/mL 류펫틴, 100 μg/mL 아프로티닌 및 25 mU/mL 아피라제를 첨가하고, 4°C에서 2시간 동안 교반한다.
      참고: 펠렛을 균질화하는 단계는 GPCR-G 단백질 복합체의 생산에 매우 중요하다.
    4. 용액을 튜브로 옮기고, 4°C에서 30분 동안 100,000 x g 에서 원심분리한다.
    5. 플래그 수지를 세척 완충액 (20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mMMgCl2, 5 mMCaCl2, 10 μM 작용제, 0.0375% (w/v) LMNG, 0.0125% (w/v) GDN, 0.01% (w/v) CHS)로 미리 평형화시킨다.
    6. 상청액을 튜브로 옮기고, 플래그 수지를 4°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
    7. 위의 혼합물을 유리 컬럼에 적재하고 100 μg/mL 벤즈아미딘, 100 μg/mL 루펩틴 및 100 μg/mL 아프로티닌으로 보충된 50 mL의 세척 완충액으로 컬럼을 세척하십시오.
    8. 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 200 μg/mL Flag 펩티드, 10 μM 작용제, 0.0375% (w/v) LMNG, 0.0125% (w/v) GDN, 0.01% (w/v) CHS, 100 μg/mL 벤자미딘, 100 μg/mL 루펩틴 및 100 μg/mL 아프로티닌을 함유하는 용출 완충액 10 mL로 컬럼을 에루트한다.
    9. S1PRs-G 단백질 복합체를 수집하고, 4°C에서 1,300 x g 에서 100 kDa 컷오프 농축기를 사용하여 1 mL로 농축하였다. 0.22 μM 필터를 통해 여과하고, 4°C에서 10분 동안 13,000 x g 에서 원심분리하여 응집체를 제거하였다.
    10. S1PRs-G 단백질 복합체를 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 μM 작용제, 100 Μm TCEP, 0.00375% (w/v) LMNG, 0.00125% (w/v) GDN 및 0.001% (w/v) CHS를 함유하는 SEC 완충액으로 4°C에서 0.5 mL/min의 유속으로 미리 평형화된 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 겔 여과 컬럼 상에 로딩한다.
    11. 피크 분획을 수집하고, cryo-EM에 대해 4°C에서 1,300 x g 에서 100 kDa 컷오프 농축기를 사용하여 농축하였다.

2. S1PRs 구조를 해결하기 위한 전자현미경 검사

  1. 데이터 수집
    1. cryo-EM 그리드를 준비하려면 글로우 방전 클리닝 시스템을 사용하여 300메쉬 Au R1.2/1.3 그리드를 10초 동안 누르고 15mA에서 60초 동안 글로우 방전을 수행하십시오.
    2. 앞서 기술한 바와 같이 샘플 유리화를 수행한다33,34. 급락 냉동 콘솔에서 챔버 작업 환경에 대해 온도를 4°C로, 상대 습도를 100%로 설정합니다. 0의 경우 블롯 힘, 0초의 대기 시간, 2 또는 3초의 블롯 시간, 0초의 드레인 시간을 사용합니다. 일반적으로 단일 유리화를 위해 5-10 mg / mL의 농도에서 3 μL의 샘플 만 필요합니다.
    3. 그리드를 자동 그리드 어셈블리로 클립 및 로드하고, 자동 그리드 어셈블리를 Nanocab에 로드하고, 앞서 설명한 대로 자동 로더를 통해 Nanocab을 현미경으로 로드합니다(35). EPU2 소프트웨어를 사용한 스크린 샘플 품질34. 일반적으로 적절한 얼음 두께의 영역에서 수집 된 데이터가 더 좋았습니다.
    4. 앞서도 35에 상세히 설명된 바와 같이 cryo-EM 데이터를 수집한다. S1P 수용체의 경우, 노출 전자 선량이 50-65 e-/Å2인 상태에서 -1.0 μm와 -1.8 μm 사이의 디포커스 오프셋을 설정한다. S1PR1-Gi 콤플렉스의 경우, K2 검출기와 함께 카운팅 모드에서 EPU2 소프트웨어를 사용하여 총 노출 시간 2초, 초당 5개의 원시 프레임의 레코딩 속도, 스택당 35프레임을 생성하는 총 선량 56e-/Å2로 동영상 스택을 자동으로 수집합니다.
      참고: 일반적으로 수용체 구조를 다시 빌드하려면 5,000개 이상의 영화가 필요합니다.
  2. RELION 조합을 사용하여 데이터 처리36 및 cryoSPARC37 이상적인 cryo-EM 밀도 맵을 얻을 수 있습니다. RELION-3.1_gpu_ompi4을 사용하여 앞에서 설명한 것과 유사한 작업을 포함하는 데이터를 초기에 처리합니다.34.
    1. Linux 시스템 터미널에서 데이터 스토리지 디렉토리의 상위 디렉토리를 입력하십시오.
    2. 터미널 에 relion 명령을 입력하여 RELION 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 엽니다.
      참고: 이 디렉터리에서 RELION GUI를 처음 열면 프롬프트 창이 나타납니다. 예를 클릭합니다.
    3. RELION GUI의 오른쪽에 있는 기능 표시줄에서 가져오기 를 클릭하여 원시 데이터를 RELION으로 가져옵니다.
      1. 동영상/마이크 옵션에서 원시 동영상/현미경 사진 가져오기에 대해 예를 선택하고 원시 입력 파일 필드에 데이터 경로를 입력하고(와일드카드 권장) 이러한 다중 프레임 동영상입니까?에 대해 예를 선택합니다. 동영상의 픽셀 크기를 픽셀 크기(옹스트롬) 필드에 입력하고, 전압(kV) 필드에 현미경 작동 전압(kV)을, 현미경의 구형 수차(mm) 필드에 현미경의 구형 수차를 입력합니다. 이들은 데이터 수집 당시 기록 된 매개 변수입니다.
      2. 실행 옵션에서 프로그램이 실행 중인 서버에 따라 큐 이름을 수정합니다(다른 함수도 이 매개 변수를 수정해야 함). 다른 매개변수는 RELION에서 설정한 기본값으로 둡니다. 마지막으로 모든 매개 변수가 올바르게 감지되면 RUN! 을 클릭하여 프로그램을 실행합니다.
    4. 모든 프레임(38)의 정렬을 위해 모션 보정 기능을 사용한다.
      1. I / O 옵션에서 찾아보기를 클릭하고 입력 영화 STAR 파일의 입력으로 movies.star라는 가져 오기 기능의 출력을 선택하십시오. 프레임당 투여량(e/A2) 필드에 프레임당 투여량을 입력하며, 이는 총 투여량을 프레임 수로 나눈 값과 같습니다. 전력 스펙트럼의 합을 저장하려면 아니요를 선택합니다.
      2. 동작 옵션에서 B 팩터에 대해 250, 패치 수 X, Y에 대해 5.5, 그룹 프레임에 대해 2를 입력합니다(그룹 >3의 투여량 보장). 수집 기간 동안 데이터가 이득 참조되지 않은 경우, 빈 그리드 영역을 획득하여 얻을 수 있는 이득 참조 이미지가 필요합니다. RELION의 자체 구현 사용에 대해 아니요를 선택하고 MOTIONCOR2 실행 파일 필드에 MOTIONCOR239의 실행 파일이 들어 있는 디렉토리를 입력합니다.
      3. 실행 옵션에서 서버의 컴퓨팅 성능에 따라 적절한 MPI 및 스레드 번호를 선택하십시오. 여기서 MPI = 8 및 스레드 = 3이 사용되었습니다.
    5. 유리화된 시편(40)의 cryo-EM 이미지를 변조하기 위해 CTF 추정 기능을 사용한다. I / O 옵션에서 찾아보기를 클릭하고 입력 영화 STAR 파일의 입력으로 수정 된 micrographs.star라는 모션 코르의 출력을 선택하십시오. Gctf 옵션에서 대신 UseGctf에 대해 예를 선택합니다.
    6. 서브셋 선택 기능을 사용하여 rlnCtfMaxResolutin >4의 값을 갖는 현미경 사진을 제거하십시오.
      1. I / O 옵션에서 오른쪽에있는 찾아보기를 클릭하거나 micrographs.star에서 선택하고 micrographs_ctf.star라는 CtfFind의 출력을 입력으로 선택하십시오. 하위 집합 옵션에서 메타데이터 값에 따라 선택에서 예를 선택하고 최대 메타데이터 값에 4를 입력하여 잘못된 데이터를 제거합니다.
    7. 수동 선택: 예비 선택 및 분류를 위해 수동으로 일부 이미지를 선택합니다.
      1. I / O 옵션에서 찾아보기를 클릭하고 이전 선택 디렉토리 (2.2.6 단계)에서 micrographs_selected.star를 입력으로 선택하십시오.
      2. RUN!을 클릭합니다(창이 나타납니다). 새 창 의 왼쪽 상단에있는 파일을 클릭하고 선택 영역 반전을 클릭하여 모든 이미지의 선택을 취소하십시오. 각 항목의 해당 행에서 가장 왼쪽 선택 상자를 선택하고 선택을 클릭하여 이미지를 확인하고 ~ 500 개의 좋은 이미지를 선택하십시오. 파일 > 선택 항목 저장을 클릭하여 선택한 이미지를 저장하고 창을 닫습니다.
    8. 자동 피킹 : 자동 입자 피킹 소프트웨어 패키지는 유용하고 강력한41입니다.
      1. I/O 옵션에서 자동 선택을 위해 입력 현미경 사진 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭하고 이전 ManualPick 디렉토리(2.2.7단계)에서 micrographs_selected.star를 입력으로 선택합니다. Laplacian-of-Gaussian 알고리즘은 처음에 사용되었으므로 OR에 대해 Yes : Laplacian-of-Gaussian을 사용하십시오.
      2. Laplacian 옵션에서 LoG 필터(A)의 최소 지름을 80으로, LoG 필터(A)의 최대 직경을 130으로 설정합니다. 자동 선택 옵션에서 최소 입자 간 거리(A)를 65로 설정하고 GPU에 액세스할 수 있는 경우 GPU 가속 사용에 대해 예를 선택합니다.
    9. 다음 단계를 위해 입자를 추출하십시오.
      1. I / O 옵션에서 현미경 사진 STAR 파일의 오른쪽에있는 찾아보기를 클릭하고 2.2.6 단계에서 micrographs_selected.star를 선택하십시오. 입력 좌표의 오른쪽에있는 찾아보기를 클릭하고 2.2.8 단계에서 cords_suffix_autopick.star를 선택하십시오.
      2. 추출 옵션에서 파티클 크기 조정에 대해 예를 선택하고 크기 조정(픽셀) 크기를 128로 설정하여 이후 단계의 속도를 높입니다.
    10. 입자의 예비 분류를 위한 2D 분류
      1. I / O 옵션에서 입력 이미지 STAR 파일의 오른쪽으로 찾아보기를 클릭하고 2.2.9 단계에서 particles.star를 선택하십시오. 최적화 옵션에서 클래스 수를 100으로 설정하고 마스크 지름(A)을 140으로 설정합니다.
      2. 계산 옵션에서 풀링된 파티클 수를 10으로 설정하고, 파티클을 스크래치로 복사 디렉토리 필드에 빠른 로컬 드라이브(예: SSD 드라이브)에 있는 디렉토리를 입력한 다음, 처리 속도를 높이기 위해 GPU 가속 사용에 대해 예를 선택합니다.
    11. 파티클을 선택하기 위한 템플릿으로 좋은 2D 결과를 선택하기 위한 하위 집합 선택
      1. I/O 옵션에서 model.star에서 클래스 선택 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭하고 입력으로 run_it025_model.star라는 2.2.10단계의 출력을 선택합니다. 실행을 클릭하십시오!. 팝업 창에서 이미지 정렬 및 역방향 정렬?을 선택하고 디스플레이!를 클릭하십시오.
      2. 자동 선택 기능의 참조에 대한 참조로 좋은 대표적인 2D 결과를 선택하십시오.
        참고: 선택한 결과는 빨간색으로 박스로 표시됩니다. 양호한 2D 분류 결과와 불량한 2D 분류 결과는 나중에 표시됩니다.
      3. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 선택한 클래스 저장을 선택합니다.
    12. 자동 선택의 두 번째 라운드에 템플릿을 사용합니다. I/O 옵션에서 자동 선택을 위해 입력 현미경 사진 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭하고 2.2.6단계에서 micrographs_selected.star를 선택합니다. 2D 참조 오른쪽의 찾아보기를 클릭하고 2.2.11 단계에서 class_averages.star를 선택한 다음 OR에 대해 아니오를 선택하십시오 : Laplacian-of-Gaussian을 사용하십시오.
    13. 단계 2.2.12의 coord_suffix_autopick.star와 단계 2.2.6의 micrographs_selected.star를 사용하여 다시 입자 추출을 수행합니다.
    14. 2.2.13단계의 particles.star 를 사용하여 2D 분류를 다시 수행합니다.
    15. 2.2.14단계 의 run_it025_optimiser.star 를 사용하여 하위 집합 선택을 다시 수행합니다.
      참고: 명확한 윤곽선과 올바른 모양을 가진 모든 2D 이미지를 선택해야 합니다.
    16. 다음과 같이 입자 추출을 수행하십시오. I / O 옵션에서 현미경 사진 STAR 파일의 오른쪽에있는 찾아보기를 클릭하고 2.2.6 단계에서 micrographs_selected.star를 선택한 다음 정제 된 입자를 다시 추출하거나 다시 추출 할 때 예를 선택하십시오. 정제 된 파티클 STAR 파일의 오른쪽으로 찾아보기를 클릭하고 2.2.15 단계에서 particles.star를 선택하십시오.
    17. 3D 초기 모델 및 참조 맵 생성: I/O 옵션에서 입력 이미지 STAR 파일의 오른쪽으로 찾아보기를 클릭하고 2.2.16단계에서 particles.star를 선택합니다. 최적화 옵션에서 클래스 수를 1로 설정하고 마스크 지름(A)을 140으로 설정합니다.
    18. 3D 분류 및 예비 3D 맵 생성: I/O 옵션에서 입력 이미지 STAR 파일의 오른쪽 찾아보기를 클릭하고 2.2.16단계에서 particles.star를 선택합니다. 참조 맵의 오른쪽에 있는 찾아보기를 클릭하고 2.2.17단계에서 initial_model.mrc를 선택합니다. 최적화 옵션에서 클래스 수를 4-6으로, 마스크 지름(A)을 140으로 설정합니다.
    19. 마스크 생성: I/O 옵션의 입력으로 2.2.17단계에서 양호한 3D 맵을 선택합니다. 초기 이진화 임계값을 0.05로 설정하고(출력에 따라 조정), 이진 맵을 이 많은 픽셀을 3으로 확장하고, 마스크 옵션에서 이 많은 픽셀의 소프트 에지를 8로 추가합니다.
    20. 다음 처리를 위해 cryoSPARC를 사용하십시오.
    21. 새 작업 영역을 만들고 첫 번째 작업에 대한 작업 작성기를 클릭합니다.
    22. 파티클 스택을 가져오려면 파티클 메타 경로 필드에 파티클 경로(단계 2.2.16)를 입력하고 파티클 데이터 경로 필드에 동영상의 경로(단계 2.2.16)를 입력합니다.
      참고: 가속 전압(kV), 구형 수차(mm) 및 픽셀 크기(옹스트롬) 매개 변수는 이전과 동일합니다. 진폭 콘트라스트 (분수) 값은 0.1입니다.
    23. 볼륨 데이터 경로의 2.2.18단계에서 최상의 3D 볼륨의 경로를 입력하고 가져올 볼륨 유형에 대한 맵 을 선택하여 3D 볼륨을 가져옵니다.
    24. 볼륨 데이터 경로에 마스크 경로(2.2.19단계)를 입력하고 가져올 볼륨 유형에 대해 마스크를 선택하여 마스크를 가져옵니다.
    25. 불균일 구체화: 단계 2.2.22, 2.2.23 및 2.2.24의 출력을 입력으로 사용합니다.
      참고 :이 기능은 막 단백질에 매우 유용합니다.
      1. 단계 2.2.22(imported_particles)의 출력을 불균일 구체화의 입자(입자)의 입력으로, 2.2.23단계(imported_volume_1)의 출력을 불균일 구체화의 볼륨(volume)의 입력으로, 2.2.24단계(imported_mask_1)의 출력을 불균일 구체화의 마스크(mask)의 입력으로 드래그합니다.
        참고 : 때로는 마스크없이 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.
      2. 큐를 클릭하여 처리를 시작합니다.
    26. 더 나은 결과를 얻으려면 2.2.18-2.2.25단계를 실행합니다. 위의 일련의 처리를 통해 양호한 해상도의 S1PR-Gi 3D 맵을 얻을 수 있습니다.

3. S1PRs-Gi 매개 cAMP 억제 분석

참고: S1PRs-Gi 매개 cAMP 억제 실험은 여러 부분으로 나뉘었으며, 다음은 상세한 실험 절차이다. 실험 원리와 일반적인 실험 과정은 도 1의 순서 도 형태로 도시되어 있다.

  1. 플라스미드 구성
    1. 야생형 S1PR1, S1PR3, 및 S1PR5의 cDNA를 HA 신호 서열을 갖는 벡터 pcDNA3.1+ 내로 서브클로닝한 다음, N 말단에서 플래그 태그를 붙였다(표 오브 머티리얼).
      주: 모든 수용체에 대한 돌연변이는 돌연변이유발 키트를 사용하여 생성되었다(표 물질).
  2. 플라스미드의 제조
    1. 재조합 pcDNA3.1+ 벡터 또는 센서 플라스미드 (표 물질)를 -80°C에서 1.5 mL 튜브에 저장된 DH5α 적격 에스케리치아 콜리 (E. coli) 50 μL에 첨가하고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다. 세포를 42°C에서 90초 동안 열충격하고, 즉시 얼음으로 옮기고, 2분 동안 식힌다.
      참고: Gi-inhibition cAMP 분석 키트(표 of Materials)에 의해 제공되는 센서 플라스미드는 cAMP 결합 도메인과 융합된 변형된 루시퍼라제 유전자를 발현하고 cAMP가 결합될 때 발광 활성을 증가시킨다.
    2. 300 μL의 리소제니 브로스(LB) 배지로 보충한 후 튜브를 37°C에서 1시간 동안 흔들어라. 100 μL의 세포를 LB 한천 플레이트에 플레이트하고, 48시간 동안 어둠 속에서 유지함으로써 37°C에서 인큐베이션한다. 백색 콜로니를 100 μg/mL 암피실린을 함유하는 LB 배지 5 mL에 접종하고, 37°C에서 16시간 동안 배양하였다.
    3. 플라스미드 미니프렙 키트(표 재료)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 DNA를 분리한다; 플라스미드는 350 ng/μL 이상의 농도에서A260/A280 의 값은 1.7과 1.9 사이였다.
  3. 세포 배양
    1. CHO-K1 세포를 10 cm 페트리 접시에 플레이트하고, 이를 5%CO2가 있는 37°C 배양기에서 배양하고, 단층이 80%-90% 합류할 때 이를 수확한다.
    2. CHO-K1 세포 성장 배지를 흡인하고, 37°C에서 미리 가온된 0.05% 트립신-EDTA 4 mL를 페트리 디쉬 상에 부드럽게 첨가하고, 15초 동안 인큐베이션한다. 이어서, F12 배지 + 10% FBS로 구성된 성장 배지 4 mL를 첨가한다.
    3. 페트리 접시 표면에서 세포를 부드럽게 흔들고 페트리 접시의 측면을 두드리면 세포를 떼어냅니다. 원뿔형 튜브에 셀 현탁액을 채 웁니다. 천천히 저어주고 피펫을 주어 세포 덩어리를 부드럽게 제거하십시오.
    4. 세포를 실온에서 5분 동안 250 x g 에서 원심분리하고, 상청액을 흡인하고, 3 mL의 PBS로 소생시킨다. 이 단계를 반복합니다.
    5. 혈구측정기로 세포 수를 결정하고, 실온에서 5분 동안 250 x g 에서 세포를 원심분리한다.
    6. 흡인물 PBS 완충액을 F12 배지 및 10% FBS로 구성된 성장 배지 3 mL로 CHO-K1 세포를 재현탁시킨다.
    7. F12 배지와 10% FBS로 구성된 성장 배지 2 mL를 여섯 웰 플레이트의 각 웰에 넣고 150 μL의 세포 현탁액을 각 웰에 시드하여 세포를 1.5 x 105 cells/ mL의 밀도로 유지합니다. 여섯 웰 플레이트를 약 24시간 동안 5%CO2 와 함께 37°C 조직 배양 인큐베이터에서 인큐베이션한다.
  4. 일시적 형질감염
    1. 2 μg의 DNA (단계 3.2.3)를 200 μL의 형질감염 시약 완충액 (물질 표)에 희석한다. 10초 동안 볼텍싱하고 사용하기 전에 간단히 회전하여 혼합합니다.
      참고: 여기서 2 μg의 DNA는 0.5 μg의 수용체 벡터 (S1PR1, S1PR3 또는 S1PR5) 및 1.5 μg의 센서 플라스미드를 함유한다.
    2. 트랜스펙션 시약 4 μL(표 of Materials)를 첨가하고, 10초 동안 와류하고, 사용 전에 간단히 스핀한다. 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
    3. 형질감염 믹스 200 μL를 각 웰(CHO-K1 세포 함유)에 천천히 떨어뜨려 고르게 분배한다. 여섯 웰 플레이트를 부드럽게 흔들어 철저한 혼합을 보장합니다.
    4. 4-6시간 후에 형질감염 배지를 F12 배지 + 10% FBS로 구성된 세포 성장 배지로 교체하고, 6웰 플레이트를 인큐베이터로 복귀시킨다.
    5. 형질감염 후 24-48 시간 동안 세포를 수확하십시오.
      1. 웰 상의 CHO-K1 세포를 500 μL의 0.05% 트립신-EDTA(37°C에서 예열)로 15초 동안 소화시키고 F12 배지 + 10% FBS로 구성된 성장 배지 1 mL를 첨가한다. 우물의 측면을 흔들고 부드럽게 두드려 우물 표면에서 세포를 떼어냅니다.
      2. 세포 현탁액을 원뿔형 튜브로 옮기고, 실온에서 5분 동안 250 x g 에서 원심분리한다. 상청액을 붓고 형질감염된 세포를 수확한다.
        참고: 형광 신호 결정 전에, 앞서26에 기술된 바와 같이 ELISA에 의해 수용체의 세포 표면 발현 수준을 확인한다.
  5. D-루시페린-칼륨 염과의 평형 (재료 표)
    1. 수확된 세포를 즉시 3mL의 분석 완충액(즉, 10mM HEPES pH 7.4를 함유하는 행크스 밸런스드 염 용액(HBSS))으로 현탁시키고, D-루시페린-칼륨 염의 추가 3% v/v 희석액으로 현탁시킨다.
    2. 다채널 피펫을 사용하여 96-웰 플레이트의 웰 당 90 μL의 세포 현탁액을 첨가하고 부드럽게 혼합한다.
    3. 실온에서 40분 동안 인큐베이션한다.
  6. 형광 신호 결정
    1. DMSO에 용해된 시포니모드의 10mM 원액을 미리 준비하고, 리간드 자극 전에 25μM 포스콜린을 함유하는 HBSS 버퍼를 사용하여 연속 희석을 만든다.
      참고: 리간드가 없는 대조군을 제외하고, 나머지는 10-11-10-5 mol/L의 농도 구배 범위를 갖는다.
    2. 10 μL (웰 당)의 작용제 용액으로 30 분 동안 다른 농도로 자극하십시오.
    3. 다음과 같이 관련 소프트웨어(Table of Materials) 파라미터를 사용하여 마이크로플레이트 리더 상의 발광 신호를 계수한다. 검출 방법에는 발광, 읽기 유형의 경우 끝점, 광학 유형에는 발광 광섬유를 선택합니다. 광학 게인을 255로 설정합니다.
      참고: 각 측정은 적어도 세 번의 독립적인 실험에서 반복되었으며, 각각은 삼중으로 반복되었다.
    4. 형광 신호의 값을 얻고, 데이터를 스프레드시트 프로그램으로 가져오고, 비선형 회귀(curve fit) 용량 반응 함수를 사용하여 데이터를 처리합니다.

figure-protocol-19280
그림 1 : 실험의 개략적인 그림. 실험 설정 및 실행에 대한 자세한 단계별 가이드입니다. 간단히 말해서, 수용체 및 변형된 루시퍼라아제는 수용체 및 센서 플라스미드를 형질감염 시약으로 세포 내로 형질감염시킴으로써 CHO-K1 세포에서 일시적으로 공동발현되었다. 세포를 루시퍼라제 기질인 D-루시페린-칼륨 염과 함께 HBSS 용액에 현탁시키고, 24시간 후에 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포 내로의 투과를 허용하기 위해, D-루시페린은 세포와 미리 평형화되어야 한다. 산화 효소 루시퍼라제는 루시페린을 옥시루시페린으로 변형시키고 빛을 방출합니다. 반면에 변형된 루시페라제는 cAMP에 결합할 때만 화학 반응을 통해 빛을 생성하며, 빛의 강도는 세포의 cAMP 수준과 긍정적인 연관성을 갖는다. cAMP의 수준은 작용제에 의해 활성화된 GPCR로 조절되었다. Gi-결합 수용체는 cAMP의 수준을 감소시켰고, Gi-억제 cAMP 실험에서 아데닐일 사이클라제를 활성화시키기 위해 포스콜린의 첨가를 필요로 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

S1PRs-Gi 복합체의 샘플을 동결시키기 전에, 정제된 샘플은 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분리되고 겔 여과 크로마토그래피로 분석될 필요가 있다. 도 2 는 S1PR3-Gi 복합체를 예로 들어 나타낸 것이다. 균질한 GPCR-G 단백질 복합체의 피크 분획은 보통 크기-배제 크로마토그래피의 ∼10.5 mL에 위치하였다(도 2A). S1PR3-Gi 복합체의 SDS-page 분석(

토론

이 프로토콜은 cryo-EM에 의한 S1PR의 구조를 결정하고 Gi 매개 cAMP 억제 분석법에 의해 S1PR의 활성화 효능을 측정하기 위한 1차 파이프라인을 기술한다. 일부 단계는 실험의 성공에 매우 중요합니다.

S1PRs-Gi 복합체를 정제하려면 바이러스의 품질과 sf9 세포의 건강에 더 많은주의를 기울여야합니다. 수용체의 발현은 불량한 sf9 세포에서 극적으로 감소된다. sf9 ?...

공개

저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

S1PRs-Gi 복합체의 데이터는 쓰촨 대학의 서중국 Cryo-EM 센터와 남부 과학 기술 대학 (SUSTech)의 Cryo-EM 센터에서 수확되었으며 쓰촨 대학의 Duyu 고성능 컴퓨팅 센터에서 처리되었습니다. 이 연구는 중국 자연 과학 재단 (32100965 L.C., W.Y.에서 32100988, 31972916에서 Z.S.까지)과 쓰촨 대학의 전임 박사후 연구 기금 (2021SCU12003에서 L.C.까지)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% trypsin-EDTAGIBCOCat# 25300054
0.22 µM filterThermo Fisher ScientificCat# 42213-PS
100 kDa cut-off concentratorThermo Fisher ScientificCat# 88533
6-well plateCorningCat# 43016
96-well plateCorningCat# 3917
AprotininSigma-AldrichCat# 9087-70-1
ApyraseNEBCat# M0398S
Baculovirus transfection reagentThermo Fisher ScientificCat# 10362100For the preparation of P0 baculovirus
BenzamidineSigma-AldrichCat# B6506
CHO-K1ATCCN/A
CHSSigma-AldrichCat# C6512
CryoSPARCPunjani, A., et al.,2017https://cryosparc.com/
DH5α competent E.coliThermo Fisher ScientificCat# EC0112
D-Luciferin-Potassium SaltSigma- AldrichCat# 50227
DMSOSigma- AldrichCat# D2438
EDTAThermo Fisher ScientificCat# S311-500
ESF921 cell culture mediumExpression SystemsCat#  96-001
ExcelmicrosoftN/A
F12 mediumInvitrogenCat# 11765
FBSCell BoxCat# SAG-01U-02
Flag resinSigma- AldrichCat# A4596
ForskolinAPExBIOCat# B1421
GctfZhang, 2016 https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/
GDNAnatraceCat# GDN101
Gel filtration columnGE healthcareCat# 28990944
Gen5 3.11BIO-TEKN/A
GentamicinSolarbioCat# L1312
GloSensor cAMP assay kitPromegaCat# E1291Gi-inhibition cAMP assay kit
GloSensor plasmidPromegaCat# E2301Sensor plasmid
Grace’s mediumGIBCOCat# 11595030
GraphPad Prism 8GraphpadN/A
HBSSThermo Fisher ScientificCat# 88284
HEPESSigma- AldrichCat# H4034
jetPRIME ReagentPolyplus TransfectionCat# 114-15transfection reagent
JanamycinSolarbioCat# K1030
LB mediumInvitrogenCat# 12780052
LeupeptinSigma-AldrichCat# L2884
LMNGAnatraceCat# NG310
MotionCor2(Zheng et al., 2017)https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software
NanoCabThermo Fisher ScientificCat# 1121822
PBSInvitrogenCat# 14190-144
pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRsGenScriptN/A
pFastBac1-GαiGenScriptN/A
pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10GenScriptN/A
pFastBacdual-Gβ1γ2GenScriptN/A
PureLink HiPure Plasmid Miniprep KitInvitrogenCat# K210003For the preparation of plasmids and P0 baculovirus
Q5 site-Directed Mutagenesis kitNEBCat# E0554SFor the preparation of plasmids
QuantifoilQuantifoilCat# 251448
RELION-3.1(Zivanov et al., 2018)https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion
S1PRs cDNAaddgeneN/A
scFv16InvitrogenCat# 703976
Sf9Expression SystemsN/A
SiponimodSelleckCat# S7179
sodium cholateSigma-AldrichCat# C1254
Synergy H1 microplate readerBIO-TEKN/A
Synthetic T4L DNA (sequence)N/AN/AAacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg
cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg
ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca
aagagcccatcactcaacgctgccaagtctga
actggacaaagccattggtcgcaacaccaac
ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac
tcttcaaccaagatgtagatgcggctgtccgtgg
catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt
atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt
gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg
agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc
agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga
atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc
taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg
tactggaacttgggacgcttac
TCEPThermo Fisher ScientificCat# 77720
TetracyclineSolarbioCat# T8180
Vitrobot Mark IVThermo Fisher ScientificN/A

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