자손의 감수성과 회복력을 연구하기 위해 Poly(I:C)를 사용하여 임신 중기 모체 면역 활성화의 재현 가능한 모델 생성

요약

산모 감염은 신경 발달 장애의 위험 요소입니다. 모체 면역 활성화(MIA)의 마우스 모델은 감염이 뇌 발달 및 기능에 미치는 영향을 설명할 수 있습니다. 여기에서는 MIA에 노출된 안정적으로 회복력 있고 감수성이 있는 자손을 생산하기 위한 일반적인 지침과 절차가 제공됩니다.

초록

임신 중 산모의 면역 활성화(MIA)는 자손의 신경 발달 및 신경 정신 장애의 위험 증가와 지속적으로 관련이 있습니다. MIA의 동물 모델은 인과관계를 테스트하고, 메커니즘을 조사하고, 이러한 장애에 대한 진단 및 치료법을 개발하는 데 사용됩니다. 이들의 광범위한 사용에도 불구하고, 많은 MIA 모델은 재현성의 결여로 고통받고 거의 모든 것이 이 위험 인자의 두 가지 중요한 측면을 무시한다: (i) 많은 자손이 MIA에 탄력적이고, (ii) 감수성 자손은 표현형의 뚜렷한 조합을 나타낼 수 있다. 재현성을 높이고 MIA에 대한 감수성과 탄력성을 모두 모델링하기 위해 임신 전 암컷 마우스의 기본 면역반응성(BIR)을 사용하여 MIA에 노출된 후 어떤 임신이 회복력 있는 자손 또는 정의된 행동 및 분자 이상을 가진 자손을 낳을지 예측합니다. 여기서, 임신 12.5일에 이중 가닥 RNA(dsRNA) 바이러스 모방 폴리(I:C)의 복강내(i.p.) 주사를 통해 MIA를 유도하는 상세한 방법이 제공됩니다. 이 방법은 댐에서 급성 염증 반응을 유도하여 인간 정신 및 신경 발달 장애(NDD)에서 유사하게 영향을 받는 영역에 매핑되는 마우스의 뇌 발달 교란을 유발합니다.

서문

역학적 증거는 산모 감염을 정신분열증(SZ) 및 자폐 스펙트럼 장애(ASD)를 포함한 정신과 및 NDD의 위험 증가와 연관시킵니다1,2,3,4,5,6,7. MIA 마우스 모델은 이러한 장애의 병인에서 MIA의 인과관계와 기계론적 역할을 테스트하고 분자 바이오마커를 식별하고 진단 및 치료 도구를 모두 개발하기 위해 개발되었습니다 ^4,6. 이 모델의 유용성과 인기가 높아지고 있음에도 불구하고 현장 내에서 MIA 유도 프로토콜에는 상당한 변동성이 있어 연구 전반에 걸쳐 결과를 비교하고 결과를 복제하기가 어렵습니다 ^8,9. 또한, 이 모델의 대부분의 반복은 MIA의 두 가지 중요한 번역 측면을 조사하지 않는다: (i) 많은 자손이 MIA에 탄력적이고, (ii) 감수성이 있는 자손은 표현형의 뚜렷한 조합을 나타낼 수 있다⁸.

재현 가능한 MIA 모델을 생성하기 위해 조사관은 댐에서 유도된 MIA의 크기에 대한 정량적 측정을 하나 이상 보고해야 합니다. 임신 중 MIA를 유도하기 위해 우리 연구실은 이중 가닥 RNA 바이러스 모방 폴리이노시틱: 폴리시티딜산[폴리(I:C)]의 복강내(i.p.) 주사를 수행합니다. Poly(I:C)는 톨 유사 수용체 3(TLR3)¹⁰에 의해 인식되기 때문에 인플루엔자 바이러스와 유사한 면역 캐스케이드를 유도합니다. 그 결과, 폴리(I:C)는 전염증성 사이토카인 8,11,12의 급격한 상승을 초래하는 급성기 반응을 활성화시킨다. 이전 연구에서는 인터루킨-6(IL-6)을 포함한 전염증성 사이토카인의 상승이 MIA^11,12,13의 결과로 자손의 행동 이상과 신경병리를 생성하는 데 필요하다는 것을 입증했습니다. 따라서 폴리(I:C) 주사 후 2.5시간에 최고조에 달하는 동안 수집된 모체 혈청의 IL-6 수준은 현장 내 실험실 간 결과를 비교하는 데 사용할 수 있는 MIA의 강력한 정량적 측정입니다.

단일 유도 프로토콜(single induction protocol)^8,14을 사용하여 회복력(resilience)과 감수성(sceptibility)의 번역상 필수 요소들을 다루는 MIA 모델을 생성하기 위해, 연구자들은 전형적인 유도 접근법과 임신 전 댐의 기준선 면역반응성(BIR)의 특성화를 결합할 수 있다 ⁸. 최근, 처녀 암컷 C57BL/6 마우스는 임신 전 폴리(I:C)에 저선량으로 노출되었을 때 광범위한 IL-6 반응을 보인다는 것이 발견되었다⁸. 감수성 자손을 낳는 것은 이러한 암컷의 일부일 뿐이며, BIR과 폴리(I:C) 용량의 조합에 의해 결정된 면역 활성화의 특정 크기에서만 가능하다⁸. MIA는 거꾸로 된 U 패턴으로 표현형을 유도합니다. 자손은 댐이 적당히 면역반응이 있을 때 가장 큰 행동 및 분자 이상을 보이며, 모체 염증의 크기는 임계 범위에 도달하지만 이를 초과하지는 않는다⁸. 여기에서는 poly(I:C)의 임신 중기 주사의 결과로 다양한 행동 표현형을 가진 탄력 있는 자손과 감수성 자손을 모두 안정적으로 생성하는 방법에 대한 자세한 방법을 제공합니다.

프로토콜

모든 프로토콜은 University of California-Davis Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인 하에 수행됩니다.

1. 동물 준비

1. 동물을 획득할 때 최대한의 재현성을 보장하기 위해 다음 매개변수를 일관되게 유지하십시오.
   1. 공급업체 및 공급업체 위치: 이전에 보고된 바와 같이, 야생형 C57BL/6J 마우스는 공급업체에 따라 동일한 용량의 폴리(I:C)에 대해 다른 반응을 보인다⁸. 일관된 응답을 보여주는 공급업체 및 마우스 변형을 선택합니다. 이 실험에서 Charles River에서 얻은 C57BL/6 마우스는 임신 중반 MIA에 노출된 후 행동의 일관된 변화를 보인 반면, Taconic에서 구입한 마우스는 Charles River 마우스에 비해 처리군에 따라 약간의 차이가 있어 더 큰 크기 반응을 보였다⁸.
   2. 균주: C57BL/6J 마우스가 가장 일반적으로 사용되지만, BTBR 마우스와 다른 균주는 임신 중기 MIA에 대해 차별적인 반응을 보인다⁹. 이러한 차등 반응은 방법의 재현성을 향상시키고 자손의 차등 결과에 기여하는 잠재적 변수가 될 수 있으므로 유의하십시오.
   3. 변동성을 최소화하기 위해, MIA 연구⁸ 에는 처녀 암컷만을 사용하고 분석법의 세부 사항을 명확하게 기록한다.
   4. 출하 연령 및 적응 기간: 7주 이전에 출하된 마우스는 조절되지 않는 내분비계를 보임(Increased endocrine system)¹⁵. 동물이 최소 48시간 동안 적응하도록 허용하십시오^16,17. 마우스를 7 주 (± 2 일)에 배송하고 8 주 (± 2 일)에 BIR을 주사하도록 주문하십시오.
   5. 짝짓기 연령: 동물의 면역 체계는 일생 동안 역동적입니다. 짝짓기/주사 시 연령을 가능한 한 일관되게 유지하여 변동성을 최소화하도록 주의하십시오^18,19,20. 암컷 마우스를 9주(± 2일)에 짝짓기합니다. 생후 6 개월 이상의 수컷을 짝짓기에 사용하지 마십시오.

2. 폴리(I:C) 로트 테스트 및 준비

1. 아래에 설명된 대로 고분자량 폴리(I:C)를 준비합니다.
   1. 보관용 1.5mL 미세원심분리기 튜브를 오토클레이브합니다. 재현탁 폴리(I:C)는 -20°C에서 보관할 수 있지만 반복적인 동결 해동은 효능에 영향을 줄 수 있습니다. 수조를 70°C로 가열합니다.
   2. 멸균 기술을 사용하여 주사기를 사용하여 동결건조된 폴리(I:C)에 멸균 생리식염수(NaCl 0.9%) 10mL를 추가합니다. 70°C 수조에서 15분 동안 가열하여 완전 어닐링이 가능합니다. 제거하고 실온으로 식히십시오.
   3. 멸균 후드에 생리 식염수 40mL를 병에 넣고 여러 번 뒤집어 혼합합니다. 폴리(I:C) 병의 상단을 제거하거나 주사기를 사용하여 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 분취합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
2. 아래에 설명된 대로 혼합 분자량 폴리(I:C)를 준비합니다.
   1. 보관용 1.5mL 미세원심분리기 튜브를 오토클레이브합니다. 재현탁 폴리(I:C)는 -20°C에서 보관할 수 있지만 반복적인 동결 해동은 효능에 영향을 미칠 수 있습니다. 수조를 50°C로 설정합니다.
   2. 멸균 기술을 사용하여 멸균 폴리(I:C)에 멸균 0.9% NaCl 10mL를 넣고 뚜껑을 고정합니다. 50°C 수조에서 25분 동안 가열하여 완전히 어닐링할 수 있도록 합니다. 제거하고 실온으로 식히십시오.
   3. 멸균 기술을 사용하여 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 분취량을 넣고 -20°C에서 보관합니다.
3. 아래에 설명된 대로 복강내(i.p.) 주사를 통해 폴리(I:C)를 투여합니다.
   1. 정확한 투여량을 결정하기 위해 마우스의 무게를 잰다. 0.5cc 인슐린 바늘을 사용하여 재현탁 폴리(I:C)를 그립니다. 마우스를 긁고 뒤집어 복부가 노출되도록 합니다.
   2. 다른 손을 사용하여 바늘을 약 0.5 ° 각도로 앞쪽 두 젖꼭지 사이에 약 45cm 깊이로 삽입합니다.
   3. 주입하기 전에 혈액이나 소변이 주사기에 들어 가지 않는지 확인하십시오. 둘 중 하나가 발생하면 바늘의 위치를 변경하고 다시 시도하십시오. 천천히 주사하십시오. 폴리(I:C)가 거품을 일으키면 주사가 피하로 주입되었을 가능성이 높습니다. 성공적인 주입 배치는 바늘을 삽입한 후에는 아무 것도 뽑히지 않고 제거한 후에는 누출이 없습니다.
4. 아래에 설명된 대로 MMW 폴리(I:C) 로트 효능을 테스트합니다⁸.
   1. 원하는 형태의 폴리(I:C)를 얻습니다. 일부 제조업체는 나중에 여러 병을 동시에 얻을 수 있도록 효능을 테스트하는 동안 연구원이 전체 또는 부분 로트를 보류할 수 있도록 허용합니다. 전형적으로, 이들은 동결-해동을 피하는 경우 -20°C에서 몇 년 동안 동결건조하여 보관할 수 있습니다.
   2. 테스트를 위해 30개의 임신한 댐을 얻거나 번식시킵니다. E12.5에서 i.p. 용량당 최소 20마리의 마우스에 30, 40 및 10mg/kg의 주사를 수행합니다.
   3. 주사 후 2.5 시간에 꼬리 출혈을 통해 혈액을 채취하십시오. 말초 혈액과 몸통 혈액은 사이토카인 수치가 다를 수 있으므로 연구 내에서 수집 방법을 일관되게 유지하십시오.
   4. 혈액이 실온에서 밤새 응고되도록하십시오. 12-24시간 후, 혈액 샘플을 3,768 x g 에서 4°C에서 8분 동안 회전시킵니다. 혈청을 수집하고 분석될 때까지 -80°C에서 보관합니다.
   5. 혈청을 분리하고 ELISA 또는 Luminex 를 통해 IL-6 수치를 측정합니다. 다양한 양식과 제조업체로 측정된 총 농도에 상당한 변동성이 있으므로 측정 도구를 일관되게 유지하십시오. 파일럿 코호트를 활용하여 표현형을 유도하는 데 필요한 IL-6 반응의 크기를 결정합니다.

3. 기본 면역 반응성(BIR) 검사

참고: 그림 1 은 단계의 개략도를 보여줍니다. 화합물에 대한 적응 면역 반응의 가능성을 낮추기 위해 임신과 비교하여 BIR 테스트에 다른 분자량 폴리(I:C)를 사용합니다.

1. 처녀 암컷 생쥐를 7 주령에 배송하도록 주문하십시오. 도착하자마자 4-5 마리의 생쥐를 새장에 모으고 짝짓기 할 때까지 그룹을 보관합니다. 이어 노치 또는 다른 식별 시스템을 사용하십시오.
2. 도착 1주일 후 5mg/kg의 폴리(I:C)를 여성에게 복강 주사합니다. 주사 후 2.5 시간에, 순환 IL-6이 가장 높을 때⁶, 꼬리 절단 을 통해 주사 된 동물로부터 전혈을 수집하십시오.
3. 혈액이 실온에서 밤새 응고되도록하십시오. 12-24시간 후, 혈액 샘플을 3,768 x g 에서 4°C에서 8분 동안 회전시킵니다.
4. 각 샘플에서 최소 32μL의 혈청을 수집합니다. 사이토카인을 테스트할 준비가 될 때까지 -80°C에서 동결합니다. IL-6 수준을 가장 일관되게 측정하려면 Luminex와 같은 멀티플렉스 분석을 활용하십시오. 다양한 양식과 제조업체로 측정된 총 농도에 상당한 변동성이 있으므로 측정 도구를 일관되게 유지하십시오.
   1. Luminex 분석 프로토콜에 대해서는 Bruce et ^al.21을 참조하십시오.
5. 상대적인 IL-6 수준을 사용하여 동물을 낮음(하위 사분위수), 중간(중간 2사분위수) 및 높은(가장 높은 사분위수) BIR 그룹으로 나눕니다.

4. 채혈을 위한 꼬리 출혈 방법

참고: 잠재적으로 면역 조절 진정제의 사용을 피하려면 꼬리 출혈 혈액 수집 방법을 사용하십시오.

1. 설정하려면 납땜 스탠드와 구속 컵을 주로 사용하지 않는 손 측면의 표면에 놓습니다. 35mm 페트리 접시에 식품 등급의 식용유 1-2mL를 넣습니다. 퀵 블러드 스토퍼에서 캡을 제거하고 설정 근처에 놓습니다.
2. 납땜 스탠드에 종이 타월을 몇 겹 깔고 첫 번째 모세관을 클립으로 놓고 마우스의 꼬리 끝이 고정되고 테이블 표면과 평행하게 유지되는 위치 근처에 배치합니다. 면도날을 준비하십시오.
3. 혈액을 수집하려면 다음 단계를 수행하십시오.
   1. 필요한 시간에 케이지에서 마우스를 꺼내 꼬리가 바닥의 노치에서 나오도록 컵 아래에 놓습니다. 새 면도날을 사용하여 꼬리의 맨 끝(1-2mm)을 잘라내고 납땜 스탠드에 고정된 모세관에 첫 번째 혈액 한 방울을 수집합니다.
   2. 주로 사용하는 손의 손가락을 식용유에 담그고 꼬리 끝에서 끝까지 짜내고 꼬리 끝을 모세관으로 안내하여 혈액 방울을 수집합니다. ~200 μL의 혈액이 채취될 때까지 계속하십시오.
   3. 상단 캡 앞에 모세관의 테이퍼 끝 부분에 작은 엔드 캡을 씌웁니다. 상단 캡을 먼저 씌우면 튜브의 테이퍼 끝에서 샘플이 배출됩니다. 튜브를 보호 외부 쉘에 넣습니다.
   4. 실온에서 밤새 응고되도록 합니다. 마이크로 원심분리기를 4°C로 냉각하고 3.3단계에 명시된 대로 혈액을 회전시킵니다.

그림 1. 처녀 암컷의 기본 면역 반응성 및 짝짓기를 테스트하기 위한 타임라인입니다. 생후 7주에 마우스를 도착시키고 1주일 동안 시설에 적응하도록 명령합니다. 동물에게 5mg/kg의 폴리(I:C)를 주사하고 2.5시간 후에 혈액을 채취합니다. 혈액이 밤새 응고되도록 한 다음 3,768 x g, 4°C에서 8분 동안 원심분리합니다. 혈청을 수집하고 ELISA 또는 멀티플렉스를 통해 상대적인 IL-6 수치를 평가합니다. 생후 9 주가되면 짝짓기 쌍을 설정하십시오. BioRender.com 사용하여 생성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 짝짓기 및 임신 E12.5 주사를 위한 체중 기반 방법

참고: 그림 2 는 단계의 개략도를 보여줍니다. 두 가지 방법을 사용하여 결합 쌍을 설정하고 E12.5 시점을 결정할 수 있습니다. 첫 번째, 시간 짝짓기는 다른 곳에서^{설명됩니다 22}. E12.5 임신을 평가하기 위해 체중 기반 계산을 사용할 수도 있다²³. 이 접근법의 이점은 짝짓기 시 댐의 나이를 시간 고정하여 면역 반응의 변동성을 줄일 수 있다는 것입니다. 여기서는 이 절차를 사용합니다.

1. 수컷을 깨끗한 새장에 넣고 최소 2시간 동안 적응하도록 합니다. 이것은 수컷이 이미 새장에서 지배적 인 향기를 형성하기 때문에 여성의 침략 가능성을 줄입니다.
2. 암컷을 수컷 새장에 추가하여 단일 수컷, 단일 암컷 번식 쌍을 설정합니다. 그녀를 새장에 넣기 전에 체중을 측정하고 체중을 기록하십시오. 짝짓기 효율을 높이기 위해 각 케이지에 작은 소수의 해바라기 씨를 추가하십시오.
3. 체중 증가 범위를 결정하려면 다음 단계를 수행하십시오.
   1. 암컷의 테스트 그룹을 얻고 짝짓기 쌍을 설정하여 짝짓기 시 체중을 기록합니다.
   2. 암컷이 눈에 띄게 임신한 것처럼 보이기 시작하면 체중을 측정하고 8.5g, 9.5g, 10.5g 및 11.5g의 체중 증가로 나눕니다. E12.5의 태아는 발에 뚜렷한 손가락이 생기기 시작했습니다. 태아 형태를 사용하여 E12.5에 도달하기 위한 평균 체중 증가를 결정합니다.
4. 짝짓기 후 12 일에 암컷의 체중을 측정하고 체중 증가를 결정하십시오. 시험 시설에서 암컷은 짝짓기에서 E12.5까지 지속적으로 9.5-10.5g을 얻습니다. ip를 통해 주사 여성의 체중 증가가 미리 결정된 범위 내에 있을 때 2.3.2단계에서 결정된 가용화된 폴리(I:C)의 용량.
5. 다음 매개 변수를 사용하여 댐에서 MIA에 대한 반응을 관찰하십시오.
   1. 질병 행동: 처리에 대한 반응으로 댐이 얼마나 활성화되는지에 대해 1-3의 척도로 주관적인 점수를 수집하며, 여기서 1은 처리에 대한 반응으로 움직임이 거의 또는 전혀 없고 3은 포획 및 구속에 대한 정상적인 반응입니다. 면역 반응이 큰 동물은 취급에 대한 저항력이 떨어진다⁸.
   2. 발열 반응: IR 온도계를 사용하여 주입 전 및 주입 후 2.5시간 온도를 수집합니다. 면역 반응의 크기가 큰 동물은 더 큰 면역 활동에 대한 반응으로 저체온증을 보이는 경우가 많다⁸.
   3. 체중 변화: 주사 후 24시간에 동물의 무게를 잰다. 면역 반응의 크기가 큰 동물은 일반적으로 체중이 더 많이 감소한다⁸.
   4. 임신성 IL-6 수치를 다음과 같이 측정한다⁸.
      1. 주사 후 2.5 시간에 선호하는 방법으로 혈액을 채취하십시오. 혈액이 실온에서 밤새 응고되도록하십시오. 12-24시간 후, 혈액 샘플을 3,768 x g 에서 4°C에서 8분 동안 회전시킵니다.
      2. 혈청을 수집하고 분석될 때까지 -80°C에서 보관합니다. 혈청을 분리하고 ELISA 또는 Luminex 를 통해 IL-6 수치를 측정합니다. 다양한 양식과 제조업체로 측정된 총 농도에 상당한 변동성이 있으므로 측정 도구를 일관되게 유지하십시오.
      3. 주입 후 댐을 단독으로 수용하고 네슬렛 및 농축 장치와 같은 적절한 농축을 사용합니다. 농축의 변화는 설치류 행동에 중대한 영향을 미칠 수 있으므로 모든 농축을 일관되게 유지하십시오 24,25,26,27,28,29.
6. C57 마우스의 임신 기간은 18.5-20.5 일입니다. 정확한 시점에 주사가 수행되었는지 확인하기 위해 동물이 이 범위 내에서 태어났는지 확인하기 위해 깔짚 검사를 수행합니다. 깔짚을 확인할 때 가능한 한 케이지를 방해하십시오. 깔짚이 태어난 직후의 스트레스는 식인 풍습의 위험을 증가시킬 수 있습니다.

그림 2. MIA 유도. MIA 유도는 임신 평가, 즉 폴리(I:C) 주사 및 산모 염증의 정확한 시기를 보장하기 위한 깔짚 검사가 필요합니다. 시간 제한 교미 또는 체중 증가 방법을 통해 재태 일을 평가한 후 I.P. E12.5에서 폴리(I:C) 주사. 주사 후 2.5시간에 혈액 샘플을 수집하여 면역 활성화를 확인하고 IL-6 활성화 수준을 결정합니다. 새끼는 대략 E18.5-E20.5에서 태어납니다. BioRender.com 사용하여 생성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 성인 MIA 및 대조군 자손의 행동 변화 조사(선택 사항)

1. P60에서 시작하여 행동 테스트를 수행하기 전에 연속 3일 동안 하루에 1분 동안 부드럽게 다루면서 동물을 사람과의 접촉에 적응시킵니다. 케이지 교체일이 행동 테스트가 수행되는 날과 같은 날에 발생하지 않도록 하십시오.
2. 행동 테스트를 시작하기 전에 항상 마우스가 30-60분 동안 시험실에 적응하도록 하십시오. 불안을 최소화하기 위해 조명이 어두운(15-20lux) 방을 사용하십시오.
3. 반복적인 그루밍을 위해 뚜껑이 있는 깨끗하고 침구가 없는 케이지에 쥐를 혼자 두십시오. 카메라를 사용하여 이 케이지에 있는 마우스를 20분 동안 기록합니다. 처음 10분은 적응 기간으로, 후반 10분은 테스트 기간입니다.
4. 저장된 비디오와 스톱워치를 사용하여 10분 테스트 기간 동안 각 마우스의 누적 그루밍 시간을 기록합니다. 이 비디오에서 점수를 매길 수 있는 다른 행동으로는 양육(뒷다리로 서기), 얼기, 점프⁸ 등이 있습니다.
5. 전펄스 억제(PPI) 14,30,31,32, 오픈 필드 ^12,33,34, 3-챔버 사회적 접근^13,35,36, 새로운 객체 인식 37, y-미로 30^, 상승 플러스 미로³³ 및 컨텍스트/단서 공포 조건화 ³⁸.
6. 출생 후 면역블로팅⁸ (선택 사항)
   1. P0에서 HBSS에서 태아의 뇌 조직을 빠르게 참수하고 해부하고 액체 질소에서 동결하고 -80°C에서 보관합니다.
   2. 2x Laemmli 완충액에서 5초 동안 진폭이 20%인 프로브 초음파 처리기를 사용하여 샘플을 중단한 다음 85°C에서 5분 동안 변성합니다. 원심분리기는 실온에서 16,000 x g 로 10분 동안 용해합니다. 상층액을 수집하고 -80 °C에서 보관하십시오.
   3. 제조업체의 지침에 따라 상업용 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 함량을 측정하고 소 혈청 알부민을 보정 표준으로 사용합니다.
   4. 환원제로서 dithiothreitol을 100 mM의 최종 농도로 샘플에 첨가한다. 겔에 로딩하기 전에 2분 동안 85°C로 가열합니다.
   5. 7.5% TGS 겔에서 환원 조건에서 5μg/레인의 단백질을 실행하고 PVDF 멤브레인에 전기영동으로 옮깁니다. 차단 완충액으로 막을 차단하고 선택한 항체로 배양합니다.
   6. TBS + 0.05% 트윈 20으로 3회 세척하고 형광 태그가 부착된 2차 항체로 막을 45분 동안 배양합니다.
   7. TBS/Tween 20에서 추가로 4회 세척하고 결과를 이미지화합니다. 항-β-튜불린을 사용하여 검출된 β-튜불린을 사용하여 결과를 표준화합니다.

결과

E12.5에서 30mg/kg의 폴리(I:C)에 노출된 모든 동물이 일관된 행동 이상을 가진 자손을 생산하는 것은 아닙니다 ^8,31. 30mg/kg과 40mg/kg의 폴리(I:C)는 모두 활동 수준 감소, 저체온 반응 및 체중 감소를 포함하여 댐에서 질병 행동을 안정적으로 생성하고 IL-6의 상당한 상승을 유발하지만, MIA에 노출된 새끼의 하위 집합만이 인간 정신과 및 NDD에서 관찰되는 것과 유...

토론

모체 감염은 인간과 설치류 및 비인간 영장류 모두에서 뇌 발달 과정을 변화시킨다 ^4,5,7. 여기에서는 poly(I:C)를 사용하여 임신 중반 시점에서 마우스에서 MIA를 유도하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 임신 전 BIR 평가를 통합하여 재현성을 높이고 MIA에 대한 자손의 회복력과 감수성을 유발하는 메커니즘을 기계적으로 조사할 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% NaCl physiological endotoxin free saline	Sigma-Aldrich	7647-14-5	Control and vehicle for Poly(I:C)
35mm petri dish	Thomas Scientific	1219Z45	Used to hold oil during tail bleed
7.5% TGX gels	Bio-rad	4561084	Optional
Ancare Nestlets	Fisher Scientific	NC9365966	Optional
anti-β-tubulin	Millipore	MAB3408	Optional
Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standards Group I	Bio-rad	171I50001
Bio-Plex Pro Reagent Kit with Flat Plate	Bio-rad	171304070M
Bovine Serum Albumin	ThermoFisher	23209	Optional
Centrifuge	Eppendorf	5810R	Optional
Covidien Monoject 1/2 mL Insulin Syringe with 28G x 1/2 in. Needle	Spectrum	552-58457-083
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D9779-10G	Optional
Environmental enrichment	Bio-serv	K3327 and K3322	Optional
Ethovision	Noldus	Ethovision	Optional
Fluorsecent-tagged seondary ntibodies	Li-cor	925-32213 and 925-68072	Optional
Food-grade edible oil (like olive, canola or grapeseed)	Various vendors		Use to lubricate tail during tail bleeds
HBSS	ThermoFisher	14060040	Optional
High molecular weight polyinositic:polycytidilic acid	Invivogen	#tlrl-pic-5	Used to establish females' BIR
Humane Mouse Restrainer	AIMS	1000	Used to restrain mouse during tail bleeds
Image Studio Software	Licor	5.2	Optional
Laemmli buffer	Bio-rad	1610737EDU	Optional
Luminex200	ThermoFisher	APX10031
Microvette CB300 300μl Serum capillary tube	Sarstedt	16.440.100
Mixed molecular weight polyinositic:polycytidilic acid	Sigma-Aldrich	#P0913	Gestational induction of MIA
monoclonal anti-MEF2A	AbCam	ab76063	Optional
monoclonal anti-STAT3	Cell signaling	12640S	Optional
Observer	Noldus	Observer	Optional
Odyssey blocking buffer (TBS)	Li-cor	927-50003	Optional
Odyssey CLx imaging system	Li-cor	9140	Optional
Omnipure PBS	Millipore	65054L	Optional
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23227	Optional
polyclonal anti_TH	Pel-Freez	P4101-150	Optional
PVDF membrane	Bio-rad	162-0177	Optional
Qsonica Sonicator Q500	Fisher Scientific	15-338-282	Optional
Quick blood stopper	Petco	17140
Seal-Rite 1.5 ml microcentrifuge tube, natural non-sterile	USA Scientific	1615-5500
Soldering stand	Amazon	B08Y12QC73	Used to hold capillary tube during tail bleeds
Sunflower seeds	Bio-serv	S5137-1	Use to increase breeding efficiency
The Bio-Plex Pro Mouse IL-6 set,	Bio-rad	171G5007M
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Optional
Tween 20	Bio-rad	23209	Optional