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요약

이 프로토콜은 iDISCO+를 사용하여 온전한 마우스 뇌의 자기 공명 영상, 제거 및 면역 표지를 수행하는 방법을 설명한 다음, 라이트 시트 현미경을 사용한 이미징 및 NuMorph를 사용한 다운스트림 분석에 대한 자세한 설명을 설명합니다.

초록

조직 투명화 후 라이트 시트 현미경(LSFM)을 통해 온전한 뇌 구조의 세포 분해능 이미징이 가능하여 유전적 또는 환경적 섭동으로 인한 구조적 변화를 정량적으로 분석할 수 있습니다. 전뇌 영상은 세포의 보다 정확한 정량화와 물리적으로 절단된 조직의 일반적으로 사용되는 현미경으로는 놓칠 수 있는 영역별 차이에 대한 연구를 가능하게 합니다. 라이트 시트 현미경을 사용하여 맑은 뇌를 이미지화하면 컨포칼 현미경에 비해 획득 속도가 크게 향상됩니다. 이러한 이미지는 매우 많은 양의 뇌 구조 데이터를 생성하지만 제거 된 조직의 이미지에서 특징 정량화를 수행하는 대부분의 계산 도구는 모든 핵이 아닌 희소 세포 집단을 계산하는 것으로 제한됩니다.

여기에서는 분석 도구 그룹인 NuMorph(핵 기반 형태 측정법)를 시연하여 라이트 시트 현미경으로 투명화 및 이미징한 후 출생 후 4일차(P4) 마우스 뇌의 주석이 달린 영역 내의 모든 핵과 핵 마커를 정량화합니다. 조직 제거 탈수 단계로 인한 수축 전에 뇌 부피를 측정하는 자기 공명 영상 (MRI), 면역 표지를 포함한 iDISCO + 방법을 사용한 조직 청소, 상용 플랫폼을 사용하여 세포 해상도로 마우스 뇌를 이미지화하는 라이트 시트 현미경에 대해 설명합니다. 그런 다음 강도 차이를 수정하고, 이미지 타일을 연결하고, 여러 채널을 정렬하고, 핵을 계산하고, 공개적으로 사용 가능한 지도책에 등록을 통해 뇌 영역에 주석을 추가하는 데 사용되는 NuMorph를 사용하여 이 이미지 분석 파이프라인을 시연합니다.

우리는 공개적으로 사용 가능한 프로토콜과 소프트웨어를 사용하여 이 접근 방식을 설계하여 필요한 현미경과 계산 리소스를 가진 모든 연구원이 이러한 기술을 수행할 수 있도록 했습니다. 이러한 조직 청소, 이미징 및 계산 도구를 사용하면 피질에서 세포 유형의 3차원(3D) 조직을 측정하고 정량화할 수 있으며 모든 야생형/녹아웃 마우스 연구 설계에 널리 적용할 수 있어야 합니다.

서문

단일 세포 분해능의 전체 뇌 영상은 신경 과학에서 중요한 과제입니다. 세포 해상도 뇌 이미지는 뇌 회로에 대한 상세한 분석 및 시스템 수준 매핑과 신경 정신 장애에 대한 유전 적 또는 환경 적 위험 요소, 발달중인 배아의 세포 행동 및 성인 뇌의 신경 회로 1,2,3에 의해 회로가 어떻게 파괴되는지를 허용합니다. 재구성 된 3D 뇌의 고해상도 이미지를 허용하는 여러 조직 학적 방법이 있습니다. 그러나 이러한 기술은 값 비싸고 전문화 된 장비가 필요하며 면역 표지와 호환되지 않을 수 있으며 일부 방법의 2 차원 (2D) 특성으로 인해 절편 4,5 동안 조직 손상 및 전단이 발생할 수 있습니다.

최근의 발전은 조직 절편이 필요하지 않은 전체 뇌를 영상화하는 대안적인 접근 방식을 제공했습니다. 그들은 뇌를 투명하게 만들기 위해 조직 청소를 사용하는 것을 포함합니다. 대부분의 조직 투명화 방법에서 지질은 광산란의 주요 원인이기 때문에 지질을 제거하고 이미징 중에 물체의 굴절률(RI)을 샘플 액침 용액의 RI와 일치시킴으로써 달성됩니다. 빛은 산란되지 않고 물질 사이의 경계를 통과 할 수 있습니다 6,7,8,9.

iDISCO+와 같은 조직 투명화 방법은 종종 LSFM 6,7,10과 같은 단일 광자 여기 현미경을 사용하는 신속한 3D 이미징과 결합됩니다. 형광단으로 표지된 투명한 조직 내에서, 얇은 광면(11)을 사용한 여기(여기)에 의한 광시트 형광 현미경 이미지 절편. LSFM의 주요 장점은 한 번에 하나의 광학 섹션이 조명되고 해당 섹션 내의 분자에서 나오는 모든 형광이 여기되어 광퇴색을 최소화한다는 것입니다. 더욱이, 전체 광학 슬라이스를 이미징하는 것은 그 여기 슬라이스의 카메라 기반 검출을 가능하게 하여, 포인트 스캐닝(12)에 비해 속도를 증가시킨다. LSFM은 3D 재구성에 적합한 잘 등록된 광학 섹션을 비파괴적으로 생산합니다.

iDISCO+ 방법은 ~3주 이내에 저렴한 조직 청소를 가능하게 하지만, 프로토콜 내의 탈수 단계는 조직 수축 및 샘플 형태의 잠재적 변화로 이어질 수 있으므로 체적 측정에 영향을 미칠 수 있습니다6,10. 조직 투명화 절차 전에 사용되는 MRI와 같은 2차 이미징 방법을 추가하면 샘플 전체에 걸쳐 조직 투명화 유도 수축 정도를 측정할 수 있습니다. 탈수 단계에서 회백질과 백질 사이의 기계적 특성의 차이는 불균일한 뇌 물질 변형을 유발할 수 있으며, 이로 인해 야생형 샘플과 돌연변이 샘플 간에 서로 다른 조직 투명으로 인한 부피 변형이 발생할 수 있으며 이러한 샘플의 체적 차이에 대한 해석이 혼란스러울 수 있습니다.10,13 . MRI는 먼저 동물을 조영제(예를 들어, 가돌리늄)로 관류시킨 다음, 추출된 관심 조직을 이미징 전에 침지 용액(예를 들어, 폼블린)에서 인큐베이션함으로써 수행된다(14). MRI는 조직 투명화 및 동일한 샘플에서 LSFM 수행과 호환됩니다.

LSFM은 뇌 구조의 정량적 평가보다는 관심 있는 뇌 조직의 정성적 시각화를 위한 대규모 현미경 이미지를 생성하는 데 자주 사용됩니다(그림 1). 정량적 평가 없이는 유전 적 또는 환경 적 모욕으로 인한 구조적 차이를 입증하기가 어렵습니다. 조직 청소 및 이미징 기술이 향상되고 스토리지 및 컴퓨팅 성능 비용이 감소함에 따라 관심 조직 내에서 세포 유형 위치를 정량화하는 것이 더 쉬워지고 더 많은 연구자들이 이러한 데이터를 연구에 포함할 수 있게 되었습니다.

마우스 뇌(15) 내의 1억 개 이상의 세포와 테라바이트의 데이터를 생성할 수 있는 전뇌 이미징 세션으로 인해, 세포와 같은 이미지 내의 특징을 정확하게 정량화할 수 있는 고급 이미지 분석 도구에 대한 수요가 증가하고 있다. 핵 염색 강도에 대한 임계값을 적용하고 미리 정의된 모양, 크기 또는 밀도가10,16,17,18인 물체를 필터링하는 조직 투명 이미지에 대한 다양한 분할 방법이 있습니다. 그러나 결과의 부정확한 해석은 세포 크기, 이미지 대비 및 라벨링 강도와 같은 매개변수의 변화로 인해 발생할 수 있습니다. 이 논문은 마우스 뇌의 세포핵을 정량화하기 위해 확립 된 프로토콜을 설명합니다. 먼저, P4 마우스 뇌의 조직 수집을 위한 단계를 자세히 설명한 다음, 공개적으로 이용 가능한 iDISCO+ 방법(10)으로부터 최적화된 조직 투명화 및 면역표지 프로토콜이 뒤따른다. 둘째, 이미지 캡처에 사용되는 매개 변수를 포함하여 MRI 및 라이트 시트 현미경을 사용한 이미지 획득에 대해 설명합니다. 마지막으로, 조직 제거 후 세포 유형 특이적 정량화, 핵 마커를 사용한 면역 표지 및 주석이 달린 영역의 라이트 시트 이미징을 가능하게 하는 우리 그룹이 개발한 이미지 분석 도구 세트인 NuMorph19를 설명하고 시연합니다.

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프로토콜

모든 마우스는 채플 힐에있는 노스 캐롤라이나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 승인되고 승인되었습니다.

1. 마우스 해부 및 관류

참고: 다음 해부는 주사기를 사용하여 P4 및 P14 마우스에서 수행되었습니다. 관류액의 양은 동물의 나이에 따라 다릅니다.

  1. 관류
    주의 : 파라 포름 알데히드 (PFA)는 위험한 화학 물질입니다. 화학 흄 후드에서 모든 관류 단계를 수행하십시오.
    1. 수술 전에 복강 주사 (100mg / kg) 를 통해 펜토 바르비탈을 투여하고 마취제가 효과를 발휘하도록하십시오.
    2. 동물이 마취 수술면에 도달하면 발가락 꼬집음 반응 방법을 사용하여 반응이 없는지 확인하십시오.
    3. 흉곽 아래에 측면 절개를하여 동물의 흉강을 노출시킵니다.
    4. 구부러진 수술 용 가위를 사용하여 흉곽을 동물의 한쪽 쇄골까지 조심스럽게 자르고 반대쪽을 똑같이 잘라 흉골을 들어 올려 심장을 노출시킵니다.
    5. 하행 대동맥을 손상시키지 않고 우심방에 작은 절개를하기 전에 심장에 연결된 조직을 조심스럽게 다듬어 혈액이 혈관 구조에서 흘러 나오도록하십시오.
    6. 주사기 기반 방법을 사용하여 좌심실을 통해 마우스를 P14 및 P4에 대해 각각 10mL 및 7mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 관류하고 시스템을 통해 1.5mL/분의 관류 속도로 관류합니다.
    7. 혈액이 깨끗해지면 P14 및 P4에 대해 각각 10mL의 PBS + 4% PFA 및 7mL의 PBS + 4% PFA로 4°C에서 1.5mL/분의 관류 속도로 다시 관류하여 동물을 고정합니다.
      알림: 고정 떨림이 관찰되고 완료되면 동물이 뻣뻣 해집니다. 샘플에 MRI를 사용하는 경우 각 시점에 대해 유사한 부피의 PBS 및 PFA + PFA 용액에서 20% 가돌리늄 기반 MRI 조영제로 관류합니다.
    8. 수술용 가위를 사용하여 머리를 제거하고 완전한 고정을 위해 4°C에서 24시간 동안 PBS + 4% PFA로 드롭픽스합니다.
      참고: 이 단계에서 뇌는 두개골이 켜진 상태로 손상되지 않은 상태로 유지됩니다(섹션 2 참조). 일시 중지 지점: 뇌는 이 단계에서 4°C에서 PBS + 0.1% 아지드화나트륨에 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.

2. 온전한 두개골 및 분석을 통한 MR 기반 총 뇌 구조 영상

알림: 뇌는 두개골에서 제거되지 않고 위에서 설명한 대로 가돌리늄에서 관류 및 배양되어야 합니다. 모든 MRI는 해부 중 의도하지 않은 조직 손실을 피하기 위해 두개골에서 뇌를 제거하기 전에 발생합니다. 손상되지 않은 두개골을 사용한 이미징은 또한 샘플 준비 및 이미징 중에 샘플 홀더(즉, 주사기)의 뇌를 지원합니다.

  1. 샘플 준비
    참고: 다음 단계는 P4 및 P14 마우스 뇌 샘플에 최적화되어 있습니다. 필요한 주사기 크기는 샘플의 물리적 크기에 따라 다릅니다.
    1. 샘플에 대해 MRI를 수행하는 경우, 두개골로부터 피부를 제거하고 영상화 전에 4°C에서 23일 동안 PBS + 3% 가돌리늄에서 배양한다(14). 23일 후, 샘플을 PBS에서 신속하게 헹구십시오.
    2. 5mL 주사기를 사용하여 MRI용 샘플 홀더를 만들고, 주사기 피스톤을 사용하여 주사기(20)로 만든 홀더의 각 끝을 닫습니다. 플라스틱 조각을 사용하여 두개골을 홀더에 단단히 고정합니다(그림 2A). 이미징시 인공물을 방지하기 위해 에탄올로 주사기의 표시를 제거하십시오.
    3. 두개골을 샘플 홀더에 단단히 놓고 MRI와 호환되는 침지 용액으로 채 웁니다 ( 재료 표 참조). 홀더를 닫고 주사기를 사용하여 모든 기포를 제거하십시오.
      알림: 일시 중지 지점: 두개골은 이미징하기 전에 몇 달 동안 침지 용액에 보관할 수 있습니다.
  2. 전체 뇌 구조 영상 (MRI)
    1. 다음 매개 변수가있는 15mm 볼륨 코일과 스핀 에코 기반 시퀀스를 사용하여 9.4T / 30cm 수평 보어 동물 MRI 시스템으로 샘플을 이미지화합니다. 공간 분해능 : 60 μm x 60 μm x 60 μm; 총 스캔 시간: 7시간 12분; 에코 시간(TE): 6.83ms; 반복 시간 (TR) : 40ms; 여기/초점 조정 플립 각도: 90/180도; 이미지 크기:166 x 168 x 209 복셀; 시야 (시야) : 9.9 밀리미터 x 10.1 밀리미터 x 12.4 밀리미터; 대역폭: 100,000 킬로헤르츠.
  3. 전산 총 뇌 구조 분석
    1. 분할 소프트웨어를 사용하여 마우스 뇌를 수동으로 추적하여 원시 MRI 이미지에서 주변 두개골을 제거합니다. 다음으로, 마스크 이미지와 원시 MRI 이미지 사이에 복셀별 곱셈 연산을 적용하여 두개골이 벗겨진 뇌 MRI 이미지를 생성합니다.
      참고: 출력은 브레인 복셀의 강도가 1로 설정되고 그렇지 않으면 0으로 설정된 이진 마스크 이미지입니다.
    2. FSL 패키지(21, 22)에서 'flirt'를 사용하여 엄격한 이미지 정합(평행선-회전 추정)을 적용하여 두개골-박리된 MRI 이미지(동영상)를 대응하는 광시트 현미경 이미지(참조 이미지)에 정렬한다.
    3. 비강체 정합을 적용하여(ANTS 소프트웨어(23)에서 'SyN' 사용) 단계 2.3.2의 강성-정렬된 MRI 이미지와 라이트-시트 이미지(단계 2.3.2의 동일한 참조 이미지) 사이의 점대점 대응을 찾는다.
      참고: 출력에는 뒤틀린 MRI 이미지와 MRI에서 라이트 시트 이미지로의 볼륨 변화와 관련된 변형 필드가 포함됩니다.
    4. 2.3.3단계에서 생성된 변형 필드에 대한 야코비 행렬식을 계산하여 3 x 3 x 3 복셀 로컬 이웃의 볼륨 변화를 정량화합니다.
    5. 변형 가능한 이미지 등록을 사용하여 두개골이 벗겨진 이미지를 Allen 발달 마우스 뇌 아틀라스에 정렬합니다.
      참고: 설정된 공간 지점 간 대응을 통해 새 마우스 이미지에서 관심 있는 뇌 영역의 자동 주석을 달 수 있습니다(그림 2C-H).

3. 두개골에서 뇌 해부

  1. 두개골을 노출시키기 위해 목에서 코까지 두개골 상단을 따라 정중선 절개를하십시오.
  2. 나머지 목 근육과 다른 모든 잔여 근육을 잘라내어 두개골 기저부를 노출시킵니다.
  3. 날카로운 수술 용 가위를 사용하여 날카로운 수술 장비로 절단하는 동안 부드러운 위쪽 압력을 유지하여 뇌가 손상되지 않도록주의하면서 두개골의 안쪽 표면을 따라 조심스럽게 자릅니다.
  4. 핀셋을 사용하여 두개골의 두 잘라낸 반쪽을 뇌에서 떼어내고 뇌에 부착된 과도한 지방을 조심스럽게 제거합니다.
  5. 수술 용 가위를 사용하여 뇌와 두개골을 연결하는 경막을 다듬은 다음 주걱을 사용하여 머리에서 뇌를 부드럽게 제거하십시오.
  6. 뇌를 제거하고 PBS로 씻은 다음 0.1% 아지드화나트륨으로 PBS로 교체하고 장기 보관을 위해 4°C에서 보관합니다.

4. 조직 청소

참고: 이 프로토콜은 P4 마우스6용 iDISCO+ 프로토콜에서 약간 변경된 것입니다. 일부 세부 사항은 다른 시점 / 종 / 실험에 따라 변경 될 수 있습니다. 주의 : 메탄올, 디클로로 메탄 (DCM) 및 디 벤질 에테르 (DBE)는 위험한 화학 물질입니다. 이러한 조직 청소 단계는 화학 흄 후드에서 수행됩니다.

  1. 항체 검증
    참고: 테스트되지 않은 항체의 메탄올 호환성은 iDISCO+ 프로토콜에 필요한 거친 메탄올 세척에 의해 부정적인 영향을 받을 수 있으므로 확인해야 합니다. iDISCO+에서 작용하는 것으로 밝혀진 항체 목록은 웹사이트24를 참조하십시오.
    1. 관심 있는 PFA 고정 조직의 10μm 동결 섹션을 입체 슬라이드에 수확합니다.
    2. 실온에서 3 시간 동안 100 % 메탄올에서 섹션을 배양합니다.
    3. 표준 면역조직화학 프로토콜을 진행하기 전에 PBS에서 재수화하여 항체가 메탄올 세척 후 예상되는 형광 패턴을 나타내는지 여부를 결정합니다. 양성 대조군의 경우 메탄올로 처리되지 않은 슬라이드를 사용하십시오.
  2. 완충액 준비
    1. 공식 iDISCO 프로토콜에 따라 버퍼를 준비합니다. 이 프로토콜에 사용되는 완충액 및 기타 용액의 구성에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
  3. 전처리
    1. 메탄올 / PBS 시리즈로 샘플을 탈수하십시오 : 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 %; 실온에서 각각 1시간.
      알림: 탈수 중에 PBS를 사용하면 메탄올 세척에서 샘플의 균열을 방지하는 데 도움이 됩니다.
    2. 샘플을 100% 메탄올로 1시간 동안 세척한 다음, 실온에서 66% DCM/33% 메탄올에서 진탕하면서 밤새 배양하기 전에 4°C에서 1시간 동안 냉각합니다.
    3. 샘플을 실온에서 100% 메탄올로 2x 세척한 다음 4°C에서 냉각합니다.
    4. 메탄올 중 신선한 5%H2O2를 사용하여 샘플을 4°C에서 밤새 표백한다.
    5. 메탄올 / PBS 시리즈로 샘플을 재수화하십시오 : 80 %, 60 %, 40 %, 20 %, PBS; 실온에서 각각 1시간, 실온에서 PTx.2에서 2시간 동안 2회 세척합니다.
    6. 샘플을 37°C에서 1x PBS/0.2% TritonX-100/20% DMSO에서 밤새 배양합니다.
    7. 샘플을 37°C에서 1x PBS/0.1% 트윈-20/0.1% 트리톤X-100/0.1% 데옥시콜레이트/0.1% NP40/20% DMSO에서 밤새 인큐베이션합니다.
    8. PTx.2에서 실온에서 1 시간 동안 두 번 세척하십시오.
  4. 면역 표지
    1. 샘플을 투과화 용액에서 37°C에서 2일(~48시간) 동안 배양합니다.
    2. 37 ° C에서 2 일 (~ 48 시간) 동안 블로킹 용액에서 샘플을 차단합니다.
    3. 샘플을 37°C에서 4일(~96시간) 동안 PTwH/5%DMSO/3% 혈청 중 1차 항체와 함께 인큐베이션합니다(예: 토끼(Rb) Brn2/POU3F2 mAb(1:100) 및 항-Ctip2 래트(Rt) 항체(1:400)(재료 표).
    4. PTwH에서 3 x 1 시간 세척. PTwH에서 2 시간 더 세척하십시오. 세척 용액에 실온에서 밤새 두십시오.
    5. 샘플을 2차 항체 및 핵 염료, 예컨대 TO-PRO-3과 함께 37°C에서 PTwH/3% 혈청에서 4일 동안 인큐베이션한다(~96시간; 예를 들어, 염소 항-Rb(1:50) 및 (염소 항-Rt(1:200)) (재료 표).
    6. PTwH에서 3 x 1시간 세척 PTwH에서 2시간 더 세척합니다. 세척액에 실온에서 밤새 두십시오.
  5. 지우기
    1. 실온에서 메탄올/PBS 시리즈-20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 h에서 각각 탈수합니다. 실온에서 66% DCM/33% 메탄올에서 진탕하면서 3시간 동안 배양합니다.
      알림: 샘플은 100% 메탄올에서 탈수 직후 실온에서 밤새 방치할 수 있습니다.
    2. MeOH를 세척하기 위해 실온에서 2회 15분 동안 100% DCM에서 인큐베이션(진탕과 함께)합니다.
    3. 실온에서 흔들지 않고 디벤질 에테르(DBE)에서 배양합니다. 샘플의 산화를 방지하기 위해 튜브가 DBE로 거의 완전히 채워져 있는지 확인하십시오. 이미징하기 전에 몇 번 뒤집어 용액 혼합을 마칩니다.

5. 라이트 시트 이미징

참고: iDISCO 조직 청소 뇌는 2X/0.5 NA 대물렌즈, 보완 금속 산화물 반도체 카메라, P4 시점의 경우 0.75 x 0.75 x 4μm/복셀의 현미경 작동 및 이미지 획득 소프트웨어가 장착된 라이트 시트 현미경으로 이미지화되었습니다(그림 3A,B).

  1. 시료 장착
    1. 라이트 시트 현미경의 정격 작동 거리(5.7mm - 0.5mm 안전 여유)로 인해 샘플이 깊이가 5.2mm 이하인 z 치수로 향하도록 샘플을 올바른 샘플 크기 홀더에 조심스럽게 장착하십시오.25.
    2. 홀더의 나사를 크래들 지지대에 대해 45° 각도로 사용하여 홀더를 샘플 크래들에 놓습니다(그림 1B). 광 경로가 샘플에 수직이 되도록 크래들을 배치합니다(그림 1C).
  2. 이미징 매개 변수
    1. 현미경의 줌 바디를 4x 배율 이상으로 설정하여 0.75μm/픽셀을 생성합니다.
      참고: P4 라이트 시트 이미지에 대한 단일 셀 계산 분석은 0.75 x 0.75 x 4 μm/복셀 이상의 해상도를 허용하는 상용 라이트 시트 현미경으로 수행할 수 있습니다. 더 낮은 해상도는 핵이 더 드물게 분포된 나중 시점의 뇌에 충분합니다.
    2. 이미지 수집 소프트웨어에서 NA = ~0.08(두께 9μm/z 단계 4μm)인 단일 라이트 시트를 선택합니다.
      참고: 수평 동적 초점과 결합된 이 설정은 합리적인 시간 내에 마우스 뇌의 단일 세포 해상도로 전체 뇌 이미징을 허용합니다. 출생 후 4일차(P4) 뇌의 경우 이미지 획득 시간은 뇌의 크기에 따라 3개 채널에 대해 11-15시간으로 추정됩니다.
    3. 축 해상도가 이미지 너비를 따라 유지되도록 하려면 수평 동적 초점을 선택하고 레이저 파장에 따라 권장되는 단계 수를 적용합니다. 전체 P4 마우스 브레인의 경우 수평 동적 초점을 11로 설정합니다. 등록 채널을 기준으로 각 채널에 대해 미세 초점을 조정합니다.
      참고 : 여기서 TO-PRO-3 채널 (647 nm) 은 모든 핵에 라벨을 붙이기 때문에 Allen Developmental Mouse Brain Atlas에 등록됩니다.
    4. 채널 속성과 관련하여 채널당 레이저 출력을 조정합니다.
      알림: 더 긴 파장은 더 짧은 파장에 비해 더 높은 레이저 출력이 필요합니다. 예를 들어, 780nm는 높은 레이저 출력(70% - 75%) 및 낮은 노출(50ms)에서 이미징해야 하는 반면 647nm 채널은 평균 레이저 출력(40% - 45%) 및 낮은 노출(50ms)이 필요합니다.
    5. 라이트 시트 너비를 ~50%로 조정하여 시트 전력이 이 샘플 크기에 대해 y 치수에 최적으로 분배되도록 합니다.
      참고: 수평 동적 초점과 함께 50% 시트 너비는 광퇴색 위험을 줄이면서 이미지 전체에 걸쳐 평균 전력 분포를 제공합니다(25).
    6. 샘플 크기에 따라 타일 수를 타일 간 권장 겹침 15%로 설정하고 지정된 타일 위치의 각 스택에 대해 각 채널에 대한 이미지를 순차적으로 캡처합니다.

6. 누모프를 이용한 이미지 처리

참고: NuMorph 파이프라인에는 3D 이미지 분석을 위한 세 가지 주요 부분인 전처리, 분석 및 평가가 있습니다. 이 부분은 각각 NMp_template.m, NMa_template.m 및 NMe_template.m으로 구성되어 있으며 아래에서 설명합니다. 또한 NuMorph가 원활하게 실행되는 데 필요한 소프트웨어 패키지를 다운로드하고 설치할 수 있도록 NM_setup.m이 추가되었습니다. NM_samples.m은 또한 이미지 획득 정보를 입력하는 템플릿을 제공합니다.

  1. 누모프 설정
    1. Linux26용 conda 환경 관리자를 다운로드하여 설치합니다. NuMorph19 이미지 처리 도구를 다운로드하여 설치합니다.
    2. 명령줄에서 Matlab을 실행합니다 . NuMorph에서 NM_setup.m을 실행하여 분석에 필요한 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 다운로드하고 설치합니다.
      참고: 이 단계를 수행하면 conda 환경이 올바르게 설정되고 Matlab이 세 파이프라인 각각을 실행하는 데 필요한 모든 도구와 애드온이 올바르게 다운로드 및 설치되었는지 확인할 수 있습니다. 여기서 가장 주목할만한 것은 등록을 실행하기 위한 Elastix와 세포 감지 및 계수를 위한 3D-Unet입니다.
  2. 샘플 이름, 입력 및 출력 디렉토리, 채널 정보 및 라이트 시트 이미징 파라미터를 NM_samples.m 파일을 편집하여 지정합니다.
    참고: 여기에서는 올바른 정보, 특히 이미지 입력 디렉토리가 올바르게 지정되었는지 다시 확인하는 것이 좋습니다. 오류는 일반적으로 후속 단계를 실행할 때까지 여기에서 호출되지 않습니다.
  3. 이미지 전처리
    1. 강도 조정
      1. NMp_template에서 강도 조정 = true로 설정합니다.
        참고: 강도 조정이 필요한 경우 true로 설정합니다. 그렇지 않은 경우 강도 조정 = false로 설정합니다. '업데이트'를 사용하여 이전 조정 매개 변수를 덮어 쓰는 옵션도 있습니다.
      2. 새 이미지 집합으로 작업할 때 처리된 이미지 사용 = false 를 설정합니다. 그렇지 않으면 출력 디렉터리에 이전에 저장된 이미지 데이터 세트(예: "정렬됨", "스티칭")를 표시하여 후속 처리 단계에 사용합니다.
        참고: 이 옵션은 입력 이미지가 이미 전처리된 경우에 제공됩니다. 이 경우 전처리된 이미지가 입력 이미지로 사용되고 옵션은 출력 디렉터리의 하위 디렉터리 이름으로 설정됩니다.
      3. 이미지 저장 = true로 설정합니다.
        참고: 이 옵션을 사용하면 처리된 이미지가 출력 디렉터리에 저장됩니다. 그렇지 않으면 매개 변수 만 계산되고 저장됩니다.
      4. 저장 샘플 = true로 설정합니다.
        참고: 이 옵션을 사용하면 각 주요 단계에 대한 샘플 결과가 저장됩니다.
      5. 타일 음영 조정 = 기본을 설정하여 BaSiC 알고리즘27을 사용하여 음영 보정을 적용하거나 수동으로 설정하여 특정 라이트 시트 너비에서 라이트 시트 현미경의 측정값을 사용하여 타일 음영 보정을 적용합니다.
        참고: 이 옵션은 시트 허리의 모양으로 인해 발생하는 y 치수를 따라 고르지 않은 조명을 수정합니다.
    2. 이미지 채널 정렬
      1. NMp_template에서 채널 정렬 = true로 설정합니다. 채널 정렬이 필요한 경우 이 옵션을 true로 설정합니다. 그렇지 않은 경우 false로 설정합니다. 채널 정렬 방법을 평행 이동(강성) 또는 탄성체(비강체)로 설정합니다.
        참고: 변환 방법은 다중 채널을 정렬할 때 엄격한 2D 등록 접근 방식을 사용하는 반면, 탄성 방법은 긴 이미지 획득(19) 동안 발생할 수 있는 회전 드리프트를 보정하기 위해 비강성 B-스플라인(28)을 사용합니다.
    3. 반복적인 이미지 스티칭
      1. NMp_template에서 스티치 이미지 = true를 설정합니다.
        참고: 스티칭이 필요한 경우 이 옵션을 true로 설정합니다.
      2. 선별 구체화 = true로 설정합니다.
        참고: 이 옵션은 고정 피쳐 축척 변환29를 사용하여 xy에서 변환을 더 구체화하는 데 사용됩니다.
      3. 하중 맞춤 매개 변수 = true를 설정합니다.
        참고: 이 옵션은 스티칭 중에 채널 정렬 변환을 사용합니다. 이 옵션은 다중 채널 이미징에 권장됩니다. 그렇지 않으면 false로 설정합니다.
      4. 겹침 = 0.15를 설정하여 이미징 중 타일 겹침과 일치시킵니다.
    4. 이러한 전처리 단계를 실행하려면 환경 외부의 Matlab에서 다음을 실행하십시오NMp_template
      1. 샘플 이름을 지정합니다. 설정 = NM_config(프로세스, 샘플)을 설정합니다.
      2. NM_process(config,stage)를 지정하여 전처리 단계를 실행하고 모든 프로세스에 대해 강도, 정렬 또는 스티칭을 사용하여 단계를 지정합니다. 출력 디렉터리에서 각 단계의 출력 파일을 확인합니다(그림 3 및 그림 4).
  4. 이미지 분석
    1. 뉴모프 이전
      1. 3D 아틀라스 이미지와 각 복셀을 특정 구조에 할당하는 관련 주석 이미지로 시작합니다.
        참고 : MagellanMapper30 에서 생성 된 P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas가 여기에 사용됩니다.
      2. 아틀라스 이미지와 주석 파일을 모두 정렬하여 올바른 방향으로 올바르게 일치하는지 확인합니다.
    2. 누모프 내
      참고: 이제 아틀라스와 해당 주석이 올바르게 정렬되었으므로 나중에 사용할 수 있도록 저장할 수 있도록 파일을 NuMorph 내에서 "혼합"하거나 처리해야 합니다. 이렇게 하려면 munge_atlas 함수를 사용하여 아래와 같이 입력을 지정하십시오.
      1. Atlas_file:(문자열)을 지정합니다. 아틀라스 파일의 전체 경로를 제공합니다.
      2. Annotation_file:(문자열)을 지정합니다. 연결된 주석의 전체 경로를 제공합니다.
      3. 해상도 지정: (1x3 숫자). 아틀라스 y, x, z 해상도를 픽셀당 미크론으로 지정합니다.
      4. 방향 지정: (1 x 3자). 아틀라스 방향을 제공하고 크래들(전방(a)/후방(p),상급(s)/열등(i),왼쪽(l)/오른쪽(r))의 샘플 설정과 일치하는지 확인합니다.
      5. 반구 지정: 이미징된 뇌 반 구를 지정합니다("왼쪽", "오른쪽", "둘 다", "없음").
      6. out_resolution:(int)를 지정합니다. 아틀라스 출력의 등방성 분해능을 미크론 단위로 지정합니다. (기본값: 25).
      7. "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, 해상도, 방향, 반구)"명령을 실행하여 /data/annotation_data에 여러 주석을 생성하고 /data/atlas에 아틀라스 이미지의 복사본을 생성합니다.
      8. Matlab 구조체와 아틀라스 파일을 읽고 두 파일이 올바른 방향으로 올바르게 처리되었는지 확인합니다.
        참고: 면역표지된 단백질 마커의 공동 국소화에 기초하여 세포 유형을 정량화하기 위해 추가적인 세포 분류 단계를 수행할 수 있다.
    3. 리샘플링
      1. NMa_template에서 이미지 등록을 수행하여 아틀라스를 참조하거나 고해상도 데이터 세트의 다운샘플링된 볼륨을 생성하는 경우 이미지 리샘플링 = true로 설정합니다.
        참고: NMa_template.m은 리샘플링, 정합, 핵 검출 및 세포 계수를 위한 매개변수를 설정하는 데 사용됩니다.
      2. 아틀라스와 일치하도록 리샘플링 해상도를 설정합니다.
        참고: 여기서 25μm3/복셀 등방성 분해능은 참조 아틀라스가 이 분해능에 있기 때문에 사용됩니다.
      3. 리샘플링 채널 = [ ]을 사용하여 리샘플링할 채널 번호를 지정합니다.
        참고: 여기서 채널 번호는 핵 채널과 일치하도록 설정됩니다. 이 옵션이 비어 있으면 등록 채널만 리샘플링됩니다.
    4. 등록
      1. NMa_template에서는 레지스터 이미지 = true를 설정합니다. 등록이 필요한 경우 true로 설정합니다. 그렇지 않은 경우 등록 = false로 설정합니다.
      2. atlas 디렉터리의 파일과 일치하도록 atlas 파일을 지정합니다.
      3. 등록 매개 변수 설정 = 기본값.
        참고: 이 옵션은 아핀 다음에 B 스플라인 변환을 사용하여 공간 대응을 추정합니다. 그렇지 않으면 /data/elastix_parameter_files/atlas_registration에서 Elastix를 통해 새 등록 매개 변수 세트를 정의합니다.
      4. 등록된 이미지 저장 = true로 설정합니다.
        참고: 등록 및 리샘플링의 출력 파일은 Matlab 또는 FIJI31과 같은 기타 시각화 도구에서 다운로드하여 육안으로 검사할 수 있습니다.
    5. 핵 검출, 세포 계수 및 분류
      참고: 여기서 발생하는 오류는 주석 파일을 올바르게 지정하지 않았거나 샘플의 사용 기간을 올바른 주석과 일치하지 않기 때문일 수 있습니다.
      1. NMa_template에서는 핵 수와 세포 분류 = true를 모두 설정합니다.
      2. 카운트 방법 설정 = 3dunet.
        참고: 이 옵션을 사용하면 훈련된 3D-Unet 모델19를 사용할 수 있습니다. 그렇지 않으면 헤시안 얼룩 검색 방법을 활용하는 헤센을 선택합니다.
      3. 감지된 개체에 대한 최소 강도 임계값을 정의하려면 min_intensity 설정합니다.
        참고: 적절한 임계값은 핵 라벨링의 신호 대 잡음비를 기반으로 경험적으로 결정됩니다.
      4. classify_method 중심 위치의 비지도 형광 강도를 기반으로 하는 임계값 또는 감독된 선형 SVM(서포트 벡터 머신) 분류기를 모델링하는 svm으로 설정합니다.
        참고: 이 단계에서는 감지된 모든 셀을 3채널 이미징을 사용하여 4개의 주요 클래스로 분류합니다. 이 프로토콜을 사용하면 Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2+, Ctip2-/Brn2- 및 이상값이 생성됩니다.
    6. 분석 단계
      1. 샘플 이름을 지정합니다. 구성 = NM_config (분석, 샘플)을 설정합니다.
      2. NM_analyze(config,stage)를 지정하여 분석 단계를 실행하고 리샘플링, 레지스터, 카운트 또는 분류를 사용하여 단계를 지정합니다. 출력 디렉터리에서 각 단계의 출력 파일을 확인합니다(그림 5).
    7. 세포 유형 분류 및 그룹 분석
      1. NMe_template에서 update = true를 설정하고 계산된 모든 이전 통계를 덮어씁니다.
        참고: NMe_template.m은 분석 중인 동일한 뇌의 뇌 영역에서 세포 유형 그룹 분석을 수행할 수 있는 옵션을 제공합니다.
      2. compare_structures_by 모든 고유 주석으로 비교할 인덱스 또는 테이블에 따라 구조를 비교할 테이블로 설정합니다.
      3. 가능한 모든 구조체 인덱스를 지정하고 /annotations에 있어야 하는 template_file 설정합니다.
      4. structure_table 설정하고 평가할 구조를 지정합니다.
      5. NMa_template.m에 설명된 대로 세포 계수 및 세포 유형 분류를 지정합니다.
      6. 비교할 그룹을 지정하려면 compare_groups 설정합니다.
      7. 쌍을 이루는 t-검정 또는 2표본 t-검정을 수행하려면 쌍을 이루는 true 또는 false로 설정합니다.
    8. 분석을 실행합니다.
      참고: 이 단계를 수행하려면 NMe_template.m 환경 외부의 Matlab에서 다음을 실행하십시오.
      1. 샘플 이름을 지정합니다. 설정 = NM_config (평가, 샘플)을 설정합니다.
      2. NM_evaluate(config,stage)를 지정하여 분석 단계를 실행하고 단계를 지정합니다. 출력 디렉터리에서 그룹 분석을 위한 출력 파일을 확인합니다.

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결과

iDISCO+ 프로토콜은 눈으로 쉽게 알아볼 수 있는 상당한 조직 수축을 도입하므로(그림 2B), 조직 투명화로 인한 수축을 정량화하기 위해 조직 제거 전에 이 파이프라인에 MRI 단계를 추가했습니다. 워크플로우는 MR 이미지에서 뇌가 아닌 조직을 제거하는 것으로 시작됩니다(그림 2C). 다음으로, 강체 변환(3개의 평행 이동 및 3개의 회전 각도)을 적용하여 MR ?...

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토론

조직 제거 방법은 뇌의 3D 세포 조직을 측정하는 데 유용한 기술입니다. 문헌에 기술된 다수의 조직 투명화 방법이 있으며, 각각의 장점과 한계가 있다 6,7,8,9. 조직 투명 이미지에서 세포 유형을 분석하기 위한 계산 도구에 대한 옵션은 상대적으로 제한적입니다. 다른 이용가능한 도구들은 분할이 덜 ?...

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공개

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 NIH (R01MH121433, R01MH118349 및 R01MH120125에서 JLS로, R01NS110791에서 GW로)와 희망의 재단에 의해 지원되었습니다. 샘플 이미징을 지원해 주신 현미경 서비스 연구소의 Pablo Ariel에게 감사드립니다. 병리학 및 실험실 의학과의 현미경 서비스 실험실은 노스 캐롤라이나 대학교 (UNC) Lineberger 종합 암 센터에 대한 암 센터 핵심 지원 보조금 P30 CA016086에 의해 부분적으로 지원됩니다. 신경 과학 현미경 코어는 보조금 P30 NS045892에 의해 지원됩니다. 이 간행물에보고 된 연구는 노스 캐롤라이나 생명 공학 센터 기관 지원 보조금 2016-IDG-1016에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Bruker 9.4T/30 cm MRI ScannerBruker BiospecHorizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl etherSigma-Aldrich108014-1KG
Dichloromethane (DCM)Sigma-Aldrich270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher-ScientificICN19605590
Donkey serumSigma-AldrichS30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin YSpeciality Fluids CompanyYL-VAC-25-6perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)Bracco DiagnosticsA9576
gadolinium contrast agent(ProHance)Bracco Diagnostics0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPUEVGA08G-P4-6286-KR
GlycineSigma-AldrichG7126-500G
Heparin sodium saltSigma-AldrichH3393-10KUDissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%Sigma-AldrichH1009-100ML
ImSpector ProLaVision BioTecMicroscope image acquisition software
ITK Snapsegmentation software
MethanolFisher-ScientificA412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA ObjectiveOlympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)Sigma-Aldrich30525-89-4Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)Corning46-013-CMDiluted to 1x in H2O
Sodium AzideSigma-AldrichS2002-100GDissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
Tergitol type NP-40Sigma-AldrichNP40S-100ML
TritonX-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Fisher-ScientificBP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet MicroscopeLaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4IntelE5-2690
Zyla sCMOS CameraAndorComplementary metal oxide semiconductor camera
AntibodyWorking concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-RabbitThermofisher ScientificA11369(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-RatThermofisher ScientificA11077(1:200)
Rat anti-Ctip2Abcamab18465(1:400)
Rabbit anti-Brn2Cell Signaling Technology12137(1:100)
To-Pro 3 (TP3)Thermofisher ScientificT3605(1:400)

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