필 블롯 기법: 다층 또는 농축된 생물학적 시료에서 단층을 분리하는 Cryo-EM 시료 전처리 방법

요약

필 블롯 기술은 다층 및 농축된 생물학적 샘플을 단일 레이어로 분리하여 두께를 줄이고 샘플 농도를 높이며 이미지 처리를 용이하게 하는 Cryo-EM 그리드 준비 방법입니다.

초록

필 블롯 Cryo-EM 그리드 준비 기술은 다층 시료의 층을 줄이기 위해 크게 수정된 역주입 방법입니다. 플런지 동결 전에 층을 제거하면 시료 두께를 Cryo-EM 데이터 수집에 적합한 수준으로 줄이고 시료 평탄도를 개선하며 이미지 처리를 용이하게 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 필 블롯 기술은 다층 멤브레인을 단일 층으로 분리하고, 층상 2D 결정을 개별 결정으로, 용해성 단백질의 적층 된 시트 모양의 구조를 단일 층으로 분리 할 수 있습니다. 이러한 유형의 시료의 높은 시료 두께는 특히 데이터 수집을 위해 현미경 스테이지를 기울여야 하는 경우 Cryo-EM 데이터 수집 및 Cryo-EM 이미지 처리에 극복할 수 없는 문제를 자주 제기합니다. 또한, 그리드 준비 이전의 샘플 농도를 증가시킬 수 있고 필 블롯 기술을 조정하여 단층 표본의 조밀 한 분포를 초래할 수 있기 때문에 이러한 샘플 중 임의의 고농도의 그리드를 효율적으로 데이터 수집을 위해 준비 할 수 있습니다.

서문

필 블롯 기술은 적층된 막 단백질의 2차원 결정을 단층으로 분리하여 Cryo-EM 2D 및 3D 데이터 수집에 적합한 얇은 샘플을 얻고^{이미지 처리를 용이}하게 하기 위해 개발되었습니다1. 이 프로토콜은 다른 유형의 다층 샘플뿐만 아니라 Z 단위의 두께를 늘리지 않고 그리드에서 두 샘플 유형의 높은 샘플 농도를 달성하는 데에도 적합합니다.

샘플 층을 하나의 층으로 감소시키는 것은 역주입 방법⁽²) 상에서 실질적으로 연장되고 변형되는 프로토콜에서 모세관 압력과 전단력의 조합을 적용함으로써 달성된다. 첫 번째 블로팅 단계는 백 주입 방법에서 20-25μm 여과지 기공 크기가 아닌 서브 마이크론에서 블로팅하는 동안 다층 샘플의 양쪽에 탄소 필름과 그리드 바를 단단히 샌드위치하고 부착시킵니다. 개별 층의 분리 또는 박리는 그리드가 트레할로스 드롭에 수직으로 눌려지면 샌드위치 된 층을 강제로 분리 할 때 발생하여 탄소 필름이 그리드 막대에서 멀어집니다 (그림 1). 그리드 바와의 원래 접촉점에서 멀리 떨어진 탄소 필름의 위치 변경은 그리드가 서브 마이크론 여과지에서 다시 한번 블롯 될 때 다음 단계에서 발생합니다. 이러한 단계의 반복 횟수는 특정 샘플에 대해 최적화할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜을 사용하여 Z의 응집을 피하면서 샘플 농도를 높일 수 있습니다. 그리드 바 및 탄소 필름에 대한 부착과 강제 분리에 의존하기 때문에 이 접근법은 특정 섬세하거나 불안정한 단백질 및 단백질 복합체와 같은 매우 깨지기 쉬운 분자에는 적합하지 않을 수 있습니다.

필 블롯 기술은 특수 장비나 값비싼 소모품이 필요하지 않습니다. 그러나 특정 샘플에 대한 적용 가능성은 생물학적 매개 변수에 대한 신중한 고려가 필요합니다. 평탄도를 보장하기 위해 탄소 필름이 필요하기 때문에 2D 결정의 경우 결정이 더 쉽지만 필 블롯 기술을 통한 조작은 샘플의 생물학적 무결성 또는 결정 순서에 영향을 미칠 수 있습니다. 단일 입자에 대한 필 블롯 기술의 적합성은 탄소 필름이 필요하고 조작에 안정적인 것으로 제한되며 테스트 될 수 있습니다. 층 사이에 중요한 생물학적 상호 작용이있는 표본은 이러한 상호 작용의 중단으로 인해 필 블롯 기술의 도움으로 특성화에 적합하지 않을 수 있습니다.

필 블롯 기술("필 블롯")은 실온에서 TEM에 의한 음성 염색 또는 염색되지 않은 샘플로 테스트 및 스크리닝함으로써 가장 빠르게 최적화됩니다. 최적의 필 블롯 반복 횟수가 확인되면 유리화 전에 두께를 제어하는 시간을 결정할 수 있습니다.

프로토콜

1. 필 블롯 기술의 준비 단계

알림: 준비하려면 다음 항목을 서로 인접하게 배치해야 합니다.

1. 20-25 μm 기공 크기 여과지 두 장을 쌓습니다( 재료 표 참조).
2. ~8cm x 10cm 길이의 파라핀 필름을 여과지 옆에 놓고 용지가 위를 향하도록 합니다.
3. 두 개의 추가 #4 여과지 위에 서브미크론 여과지를 놓습니다(그림 1-1).
4. 구부러진 다리가 위를 향하고 곧은 다리가 아래를 향하도록 모세관 방지 집게를 놓습니다. 그런 다음 매끄럽고 반짝이는 면이 위로 오도록 600메쉬 그리드를 선택합니다. 깨끗한 그리드가 다른 품목과 접촉하지 않도록 집게를 페트리 접시 또는 기타 융기된 표면에 놓습니다.
5. 파라핀 필름에서 용지를 제거하고 측면(~5mm)을 당겨 작은 테두리를 만듭니다. 파라핀 필름의 한쪽 짧은 면과 파라핀 필름에서 ~1cm 떨어진 4% 트레할로스 용액 150μL 방울 2개를 피펫팅합니다.
6. 별도의 벤치 또는 바닥에 작은 폴리스티렌 폼 용기에 액체 질소를 붓습니다 ( 재료 표 참조).
   주의 : 동상 물림을 피하기 위해 장갑과 안면 보호대를 사용하여 올바른 취급에 대한 교육을 받으십시오.
7. 작은 Cryo-EM 그리드 용기를 액체 질소에 넣고 보풀이 없는 물티슈로 폴리스티렌 폼 용기를 덮습니다.

2. 그리드에 탄소 필름 배치

1. Dumont #5 집게( 재료 표 참조)를 사용하여 트레할로스 용액 방울 중 하나에서 운모의 한쪽을 아래쪽(~20°-40°)으로 약간 아래쪽으로 만져 운모에서 탄소 필름을 띄우고 운모를 아래쪽으로 이동하여 물의 장력이 탄소 필름에서 천천히 해제되도록 합니다. 탄소 필름이 물방울 표면에 떠 있으면 운모를 방출하십시오.
2. 균열 형태의 손상이있는 탄소를 사용하지 않도록 탄소 필름을 육안으로 검사하십시오.
3. 모세관 방지 집게가 고정한 그리드를 비스듬히 (~20°-30°) 인접한 위치의 트레할로스 방울에 삽입한 다음 탄소 필름 아래 중앙에 삽입합니다. 탄소 필름을 들어 올립니다(그림 1-2).
4. 그리드를 동일한 방향으로 유지하고 드롭의 표면 장력을 깨지 않고 트레할로스 두 번째 방울의 표면 위로 천천히 내려 그리드 테두리를 거친 쪽으로 감았을 수 있는 불필요한 탄소 필름을 제거합니다.

3. 다층 2D 결정을 단층으로 분리

1. 모세관 방지 집게(재료 표 참조)를 회전시키고 그리드의 탄소 면이 아래를 향하도록 페트리 접시에 놓습니다(그림 1-3).
2. 1.3 μL의 샘플을 그리드 상단의 약간의 트레할로스 메니스커스에 피펫팅한다. 용액을 ~8-10회 피펫팅하여 트레할로스와 샘플을 그리드의 양쪽에 혼합하고 분배합니다.
3. 용액을 1분 동안 인큐베이션하는 동안, 하나 이상의 트레할로스 용액 1.7 μL 방울을 파라핀 필름 상에 피펫팅한다.
4. 탄소 필름이 위를 향하도록 그리드를 원래 위치로 다시 돌립니다.
5. 모세관 방지 집게를 사용하여 그리드를 서브미크론 여과지에 누릅니다(그림 1-4). 용액이 여과지에 흡수되고 탄소 필름이 평평하게 놓이면 그리드를 들어 올리고 트레할로스 용액의 1.7μL 방울 위로 수직으로 이동하기 전에 3초 동안 기다립니다(그림 1-5).
   알림: 고도로 쌓인 샘플에 대해 이 단계를 여러 번 반복하거나 다음 단계에서 유리화를 위해 그리드가 준비됩니다.
6. 두 개의 여과지에 격자를 닦은 다음 여과지에서 격자를 들어 올립니다(그림 1-6). 습도 및 시료 버퍼에 따라 약 13초 후, 그리드를 작은 스티로폼 용기의 액체 질소에 넣고 그리드를 Cryo-EM 그리드 용기에 넣거나 Cryo-EM 스크리닝 또는 데이터 수집을 위해 직접 옮깁니다.
   참고: 프로토콜을 신속하게 최적화하려면 이 단계에서 박리 얼룩이 있는 그리드를 액체 질소에 넣지 말고 부정적으로 얼룩지게 합니다. 그리드에 1% 우라닐 아세테이트 3μL를 적용하여 샘플을 부정적으로 염색하고 그리드를 30초 동안 배양한 다음 20-25μm 공극 크기 여과지의 찢어진 조각으로 얼룩지게합니다. 트레할로스, 탄닌 또는 포도당으로 유리화된 2D 결정 그리드는 트레할로스, 탄닌 및 포도당이 수동 급락에 사용되는 속도로 결정질 얼음의 형성을 방지하기 때문에 유리화를 위해 일상적으로 손으로 떨어^진다2.

결과

성공적인 필 블롯 실험은 종종 고농도의 단일 샘플 층을 생성합니다. 대부분의 그리드 사각형의 일부 영역에는 여전히 여러 레이어가 포함될 것으로 예상되며, 특히 필 블롯 단계의 반복 횟수가 적습니다. 그러나 대부분의 그리드 사각형에는 인간 류코트리엔 C₄ 합성 효소 (그림 2) 및 리포좀 (3.2 단계, 그림 3에 추가됨)의 2D 결정에서 관찰 된 바?...

토론

필 블롯은 Cryo-EM 데이터 수집 및 이미지 처리를 위해 다층 2D 결정 및 유사한 샘플의 적층 및 두께를 극복하는 강력한 방법입니다. 필 블롯 사용에 대한 결정은 샘플의 생물학적 파라미터를 기반으로 하며 3D Cryo-EM 모델을 사용할 수 있게 되면 평가도 필요합니다. 접촉의 생물학적 중요성과 접촉 영역의 잠재적 유연성은이 평가에서 특히 중요합니다.

필 블롯의 수는 처음에는 표...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
600-mesh grids	SPI	2060-C-XA
Anti-capillary forceps	Ted Pella	510-5
Carbon to coat mica
Cryo-EM			Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV.  High-resolution data is collected at 300 kV.
Dumpont #5 forceps	Ted Pella	5622
Grid box for cryo-EM storage	Ted Pella	160-40
Kim Wipes
Liquid nitrogen
Mica	Ted Pella	56	The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid.  The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots.
Negative stain			1-2% uranyl acetate is suitable for many samples.  Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted.
Parafilm
Polystyrene container			Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil.
Submicron filter paper	MilliporeSigma	DAWP04700
Transmission electron microscope	JEOL	JEM-1400	Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids.
Trehalose			Prepare 4% trehalose solution.
Whatman #4 filter paper	MilliporeSigma	WHA1004150	This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol.