양극성 전극을 사용하여 편도체의 전기적 점화에 의한 측두엽 간질 마우스 모델 생성

요약

편도체는 측두엽 간질에서 중요한 역할을 하며, 이 간질은 이 구조에서 유래하고 전파됩니다. 이 기사는 기록 및 자극 기능을 모두 갖춘 심부 뇌 전극의 제조에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 편도체에서 유래하는 내측 측두엽 간질 모델을 소개합니다.

초록

편도체는 발작의 가장 흔한 기원 중 하나이며, 편도체 마우스 모델은 간질의 설명에 필수적입니다. 그러나 실험 프로토콜을 자세히 설명한 연구는 거의 없습니다. 이 논문은 양극성 전극 제조 방법의 도입과 함께 편도체 전기 점화 간질 모델 제작의 전체 과정을 보여줍니다. 이 전극은 자극과 기록을 모두 할 수 있어 자극 및 기록을 위해 별도의 전극을 이식하여 발생하는 뇌 손상을 줄일 수 있습니다. 장기 뇌파도(EEG) 기록 목적을 위해 슬립 링을 사용하여 케이블 엉킴 및 낙하로 인한 기록 중단을 제거했습니다.

기저외측 편도체(AP: 1.67 mm, L: 2.7 mm, V: 4.9 mm)를 19.83 ± 5.742회 주기적으로 자극(60Hz, 15분마다 1초) 한 후, 6마리의 마우스에서 완전한 점화가 관찰되었습니다(라신 척도로 분류된 3개의 연속 등급 V 에피소드의 유도로 정의됨). 전체 점화 과정에서 두개내 EEG가 기록되었으며, 점화 후 20-70초 동안 지속되는 편도체에서 간질 분비물이 관찰되었습니다. 따라서 이것은 편도체에서 유래한 간질을 모델링하기 위한 강력한 프로토콜이며 이 방법은 측두엽 간질에서 편도체의 역할을 밝히는 데 적합합니다. 이 연구는 근심 측두엽 간질 및 새로운 항간질제의 메커니즘에 대한 향후 연구에 기여합니다.

서문

측두엽 간질(TLE)은 가장 흔한 유형의 간질이며 약물 내성 간질로 전환될 위험이 높습니다. 선택적 편도체(amygdalohippocampectomy)와 같은 수술은 TLE에 대한 효과적인 치료법이며, 이 질환의 간질 발생 및 ictogenesis는 아직 조사 중이다 ^1,2. TLE의 발병기전은 해마뿐만 아니라 편도체에서도 광범위하게 발생하는 것으로 나타났습니다 ^3,4. 예를 들어, 편도체 경화증과 편도체 비대는 모두 TLE 발작의 원인으로 자주 보고되었다 ^5,6. 편도체의 중요성은 과소평가될 수 없습니다. 편도체 모델은 간질 형성 연구에 필수적이며 이 모델에 대한 명확한 설명이 시급히 필요합니다.

동물 모델에서 발작을 유도하기 위해 몇 가지 접근법이 제안되었습니다. 과거에는 초기 단계에서 경련 약물을 복강 주사했다⁷. 이 방법은 편리했지만 간질 병소의 위치는 불확실했습니다. 정위 기술과 상세한 동물 뇌 지도의 발달로 국소화 문제를 해결하기 위해 두개내 약물 주입이 적용되었다⁸. 그러나 급성기의 중증 발작에 대한 개입 부족으로 사망률이 높았고 만성 자발 발작은 불안정한 간질 및 발작 빈도 ^9,10의 문제를 동반했습니다. 마지막으로 전기 점화 방법이 개발되었습니다. 이 방법은 주기적으로 특정 뇌 영역을 여러 번 자극하여, 발작 위치와 발병 시간을 명확히 조절하여 발작을 유도할 수 있게 한다¹¹.

이 방법의 장점은 전극의 두개내 이식이 최소 침습적이라는 것이다¹². 또한, 발작의 중증도는 자극의 종료에 의해 제어되어 발작으로 인한 사망률을 줄입니다. 이러한 변경은 이전 접근 방식의 단점을 해결했습니다. 특히, 이 모델은 인간의 발작을 적절하게 모방할 수 있으며, SE를 빠르게 유도하는 능력 때문에 간질 상태(status epilepticus, SE) 연구에 특히 적합하다¹³. 또한 항간질제 스크리닝(anti-epileptic drug screening⁾¹⁴ 및 간질의 기전에 관한 연구에도 사용될 수 있다. 마지막으로, 편도체는 기억 조절, 보상 처리, 감정과 밀접한 관련이 있다는 것은 잘 알려져 있다¹⁵. 이러한 정신 기능 장애는 간질 환자에게서 자주 발생하므로, 간질의 정서적 문제를 연구하는 데는 편도체 간질 모델이 더 나은 선택이 될 수 있다¹⁶.

프로토콜

이 실험은 수도 의과 대학 Xuanwu 병원의 실험 동물 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 마우스는 Capital Medical University, Xuanwu Hospital의 동물 실험실에 보관되었습니다. 이 프로토콜은 네 부분으로 나뉩니다. 처음 두 부분에서는 전극과 EEG 기록/자극 장비를 연결하는 슬립 링을 사용하여 전극과 전기 회로를 구축하는 방법을 소개합니다. 세 번째 부분에서는 전극 이식의 작동 방법을 설명하고 네 번째 부분에서는 편도체 간질 모델에 사용되는 EEG 기록 및 자극 매개변수를 제시합니다.

1. 전극의 제작

1. 3cm 길이의 테프론 코팅 텅스텐 와이어 2개(베어 직경: 76.2μm), 같은 길이의 은선 1개(베어 직경: 127μm), 2 x 2 게이지 행 핀 1세트.
2. 라이터를 사용하여 각 텅스텐 와이어의 한쪽 끝을 태워 절연 코팅의 5mm를 제거합니다.
   알림: 절연체가 제거된 텅스텐 와이어가 검게 변합니다. 텅스텐 와이어의이 부분을 상단이라고합니다.
3. 초미세 다중 가닥 와이어 부분을 벗겨내고 어두워지기 시작하는 아래쪽에서 위쪽 끝까지 감싸고 위쪽으로 계속합니다. 한쪽 끝을 꼬집고 다른 쪽 끝을 부드럽게 비틀어 이 극세 와이어(부드러운 질감이 있음)를 텅스텐 와이어와 결합하면 두 재료를 쉽게 얽힐 수 있습니다.
4. 부드럽게 당겨 단단히 감겨 있는지 확인하고 과도한 극세선을 잘라냅니다. 공정 전반에 걸쳐 텅스텐 와이어를 똑바로 유지하십시오.
5. 행 핀을 cl에 고정amp핀의 긴 면이 바깥쪽을 향하도록 용접 테이블의 경우. 주사기 바늘을 사용하여 솔더 페이스트를 집어 핀에 바릅니다. 용접 토치를 320°C로 가열합니다. 토치 팁으로 무연 주석 와이어를 녹이고 번지십시오.
6. 텅스텐 와이어의 상단을 행 핀의 한 바늘과 겹치고 토치의 땜납을 사용하여 텅스텐 와이어를 핀에 접착합니다.
   알림: 극세 와이어의 도움 없이 핀으로 텅스텐 와이어를 직접 용접하는 것은 매우 어려울 것입니다.
7. 다른 텅스텐 와이어와 다른 은와이어를 같은 방식으로 행 핀에 용접하여 각 와이어가 바늘에 해당하도록 합니다(그림 1,i 참조).
8. 두 개의 열수축 튜브를 텅스텐 와이어의 상단보다 약간 길게 자릅니다. 두 개의 텅스텐 와이어의 솔더 조인트에 올려 놓고 전도성 부분이 튜브에 완전히 덮여 있는지 확인하여 두 개의 텅스텐 와이어의 회로가 직렬로 배치되지 않도록합니다.
   알림: 3개의 전선이 있지만 그 중 2개가 절연되어 있으면 3개의 전선이 직렬로 연결되지 않습니다. 은색 와이어에 튜브를 추가할 수도 있습니다.
9. 용접 테이블 클램프에서 전극을 제거하고 수축 튜브를 가열할 때 전극의 모양이 떨어지기 쉽기 때문에 약간 더 많은 힘을 가하는 열전도율 클램프를 사용하여 큰 펜치로 전극을 부드럽게 잡습니다.
10. 공기 덕트를 켜고 온도가 320°C에 도달할 때까지 가열합니다. 열수축 튜브가 조여질 때까지 몇 초 동안 불어줍니다(그림 1,ii 참조).
11. 용접 과정에서 바늘이 플라스틱 본체에서 분리되면 핫멜트 접착제로 용접 부분과 플라스틱 본체를 접합합니다(그림 1,iii 참조). 인터페이스 삽입에 영향을 줄 수 있으므로 인터페이스에 번지지 않도록 주의하십시오.
12. 두 개의 텅스텐 와이어를 잡고 끝을 분리하여 함께 비틀십시오(그림 1,iv 참조). 꼬인 텅스텐 와이어를 길이가 약 10mm로 잘라서 끝 부분의 간격이 0.5mm를 초과하지 않도록 합니다.
    참고: 이 단계는 전극 길이를 유연하게 조정할 수 있도록 전극 이식 전에 수행할 수도 있습니다.
13. 글루건을 가열하고 전극 주위에 접착제를 고르게 도포합니다.
14. 멀티 미터로 전극 확인 : 멀티 미터의 한 막대를 행 핀의 용접되지 않은면에 놓고 텅스텐 와이어 또는 은색 와이어의 끝을 다른 막대에 부드럽게 대고 회로가 매끄러 운지 확인하십시오. 선이 직렬로 배치되지 않았는지 확인하십시오.

2. 슬립 링 연결 및 회로 설명

알림: 마우스의 전극을 자유롭게 움직이는 상태에서 케이블을 통해 EEG 장치에 연결하면 마우스가 움직이고 회전할 때 케이블이 엉킬 수 있습니다. 이로 인해 케이블이 더 짧아져 결국 마우스가 움직이지 못하거나 케이블이 머리에서 떨어지게 됩니다. 여기에 설명된 방법에서는 케이블이 떨어지는 것을 방지하기 위해 4채널 슬립 링이 도입됩니다. 4개의 채널은 그림 1B에서 4가지 색상으로 표시됩니다.

1. 양쪽 끝에서 절연 스킨을 5mm 벗겨내어 내부의 금속 와이어를 노출시킵니다.
2. 각 고정자 와이어에 열수축 튜브 섹션을 추가합니다.
3. EEG 장치 커넥터 플러그로 각 와이어를 용접합니다.
4. 열수축 튜브를 뜨거운 공기로 수축시킵니다.
5. 각 로터 와이어에 열수축 튜브 섹션을 추가합니다.
6. 빨간색과 주황색 와이어의 전도성 부분을 함께 나사로 고정하고 행 핀에 맞도록 헤더의 조인트에 용접합니다.
7. 헤더의 다른 두 와이어를 각 조인트에 용접합니다.
   알림: 은선에 해당하는 갈색 채널은 접지를 위해 EEG 장치에 연결됩니다. 빨간색과 주황색 채널은 동일한 텅스텐 와이어에서 신호를 수신하고 주황색 채널은 EEG 장치의 참조 역할을 합니다. 빨간색 채널의 신호는 의미가 없지만 전류 자극을 형성하려면 검은색 채널과 공존해야 합니다. 검은 색 채널의 신호는 뇌의 실제 전기 신호입니다. 다른 회로는 다른 장치에 맞게 다중 채널 슬립 링으로 설계할 수 있습니다.

3. 이식 수술

1. 마리
   1. 수술을 위해 체중 24-26g의 8주 된 C57BL/6 야생형 수컷 마우스를 사용하십시오.
   2. 온도 조절 환경(22 ± 1 °C)에서 12시간 명암 주기(광도: 8:00-20:00)로 수용하고 물과 사료를 임 의로 제공합니다.
   3. 수술 중 동물을 따뜻하게 유지하기 위해 여분의 열 매트를 사용하십시오.
   4. 수술 후 진통제의 첫 번째 투여로 멜록시캄을 피하주사(10mg/kg)한다. 그런 다음 동물을 별도의 케이지에 넣어 회복을 최적화합니다. 수술 후 첫 주 동안 동물의 식단에 meloxicam을 첨가하십시오.
   5. 실험 후, 마우스의 좌심실에 4 % 파라 포름 알데히드를 마취하에 주입하고, 전극 표적의 조직 학적 검증을 위해 뇌 조직을 수집한다.
2. 마우스의 무게를 측정하고 1% 펜토바르비탈 용액을 복강내 주사하여 마취시킨다. 드릴 비트, 전극, 치과용 시멘트 등을 포함하여 사용할 모든 수술 기구와 소모품을 오토클레이빙으로 소독하십시오.
3. 마우스가 완전히 마취되면 면도기로 눈에서 귀 부분까지 머리카락을 면도하십시오.
4. 스테레오탁스 프레임에 마우스를 고정하십시오. 앞니를 앞니를 앞니에 넣고 양쪽 이어바를 귀에 똑같이 깊숙이 삽입합니다. 수술 중 밝은 빛으로 인한 건조와 실명을 예방하기 위해 에리스로마이신 눈 연고를 눈에 바르십시오.
5. iodophor와 75 % 알코올을 번갈아 가며 3 번 면봉으로 원을 그리며 수술 부위를 소독하십시오. 그런 다음 이 절개 부위의 중앙에서 앞으로 시상 절개를 하고 절개 부위 양쪽의 피부를 잘라내어 삼각형 창을 만듭니다.
6. 작은면 조각을 공에 넣고 3 % 과산화수소로 적시십시오. 전방 및 후방 천문이 선명하게 보일 때까지 노출된 부위를 작은 면봉으로 부드럽게 문질러 두개골에 부착된 연조직을 제거합니다.
7. 전방 및 후방 천문이 수평 위치에 있도록 전방 및 후방 높이를 조정합니다. 앞쪽 천문의 위치를 축의 원점으로 생각하십시오.
8. 드릴을 사용하여 왼쪽 소뇌 두개골에 스테인리스 스틸 나사를 고정하여 평평한 표면을 만듭니다. 나사가 두개골에서 반쯤 돌출되어 있는지 확인하십시오.
9. 편도체 점화의 좌표가 브레그마에서 뒤쪽 -1.67mm, 측면 -2.7mm, 복부 -4.9mm인지 확인합니다. 이 지점을 찾아 표시하도록 정체 장치를 조정합니다.
10. 직경 0.5mm의 두개골 드릴로 표시된 지점에 구멍을 뚫습니다.
11. 전극을 정위 장치의 위치 지정 막대에 고정하고 전극을 구멍 위에 수직으로 놓고 위치를 -4.9mm로 천천히 떨어뜨립니다. 작동 중 전극 본체가 흔들리지 않도록 주의하면서 나사에 은선을 세 번 감습니다.
12. 치과용 시멘트를 혼합하여 전극과 두개골 표면에 부드럽게 바릅니다. 치과용 시멘트가 굳으면 고정전극을 둘러싸고 있는 시멘트가 원뿔형이 될 때까지 외부를 개질한다.
13. 시멘트가 경화되면 정체 장치에서 전극을 분리하십시오. 동물의 통증으로 인한 불편함을 완화하기 위해 meloxicam 10mg/kg을 피하 투여합니다. 수술 후 첫 주에 진통 효과를 위해 동물성 식품에 meloxicam을 투여하십시오. 마우스를 제거하고 케이지에 다시 넣고 다른 마우스와 분리하여 보관합니다.

4. 전기 점화

1. 수술 후 회복을 허용하고 염증이 가라앉을 수 있도록 불을 붙이기 전에 수술 후 최소 1주일 동안 마우스를 쉬게 합니다.
   참고: 일반적으로 적절하게 회복되지 않은 마우스는 점화에 잘 반응하지 않습니다.
2. 마우스 머리의 전극과 EEG 장치를 연결하는 슬립 링 케이블이 있는 맞춤형 상자에 마우스를 넣습니다. 상자 뚜껑에 있는 구멍을 통해 케이블을 연결하고 마우스가 자유롭게 움직일 수 있도록 상자에 남아 있는 길이를 조정합니다.
3. EEG 장치를 켜고 제대로 작동하는지 확인하십시오. 1초 동안 60Hz에서 1ms 단상 구형파 펄스를 전달하도록 자극기를 설정합니다.
4. 첫 번째 자극에 대해 50μA의 전류 강도로 시작합니다. 고주파 스파이크를 특징으로하는 방전 후 EEG를 모니터링하십시오. 방전 후 관찰되지 않으면 다음 자극에 25μA를 추가하고 방전 후 관찰되고 5초 동안 지속될 때까지 10분마다 이 과정을 계속합니다.
   참고: 실험에 방전이 필요하지 않은 경우 4.4단계를 건너뛸 수 있습니다. 300μA는 점화에 충분히 강합니다.
5. 4.3단계에서 결정된 전류 강도로 마우스를 15분마다, 하루에 20회 이상 자극하지 마십시오.
6. 자극에 대한 행동 반응을 모니터링하십시오.
   참고: 3회 연속 V등급 에피소드의 발생은 라신 등급 표준¹⁷과 결합된 완전한 점화로 간주됩니다.

결과

전극과 회로는 EEG를 기록하고 자극으로 기능할 수 있도록 합니다(그림 1). 이 설정은 전극을 별도로 이식, 기록 및 자극하는 복잡성을 피하고 뇌 조직의 손상을 최소화합니다. 슬립 링을 적용하면 모든 유형의 장치와 전극을 연결할 수 있습니다.

건강한 성인 수컷 C57BL/6 마우스 6마리에 전극 이식 수술을 시행하였고, 수술 2주 후에 전기자극을 실시하였다....

토론

간질은 여러 증상과 다양한 원인을 가진 질병 그룹이다¹⁸. 모든 유형의 간질에 단일 모델을 사용할 수는 없으며 연구자는 특정 연구에 적합한 모델을 선택해야 합니다. 본 연구는 전극 제조의 가장 접근하기 쉬운 방법 중 하나를 소개합니다. 이 방법의 다양한 부분은 다양한 실험 조건에 적응하도록 조정할 수 있습니다.

이 방법은 자극 및 기록 기능을 모두 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488-conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	invitrogen	A-21206
c-Fos antibody		ab222699
Cranial drill	SANS	SA302
dental cement	NISSIN
EEG recording and stimulation equipment	Neuracle Technology (Changzhou) Co., Ltd	NSHHFS-210803
lead-free tin wire	BAKON
Pin header/Female header	XIANMISI		spacing of 1.27 mm
Silver wire	A-M systems	786000
Slip ring	Senring Electronics Co.,Ltd	SNM008-04
Tungsten wire	A-M systems	796000
ultrafine multi-stand wire	Shenzhen Chengxing wire and cable	UL10064-FEP
welding equipment	BAKON	BK881