녹아웃 마우스의 심장 수리 및 리모델링을 연구하기 위한 심근 경색의 실험적 모델

요약

여기에서는 심근경색의 실험적 모델, 심장 리모델링 및 기능을 연구하기 위한 심장초음파검사법, 피로시리우스 적색 및 로다민 염색 절편에서 섬유증 및 비대를 정량화하는 절차, Masson's trichrome으로 염색된 슬라이스의 경색 크기 및 팽창 지수에 대해 설명합니다.

초록

심혈관 질환은 서구 국가에서 가장 흔한 사망 원인이며, 급성 심근 경색(MI)이 가장 흔한 형태입니다. 이 논문은 MI의 실험 동물 모델에서 심장 치유 및 리모델링의 시간적 진화에서 갈렉틴 3(Gal-3)의 역할을 연구하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

설명된 절차에는 수컷 C57BL/6J(대조군) 및 Gal-3 녹아웃(KO) 마우스에서 영구 관상동맥 결찰을 사용한 MI의 실험적 모델, 생체 내에서 심장 리모델링 및 수축기 기능을 연구하기 위한 심초음파검사 절차, 단면적(MCSA)에 의한 근세포 비대를 연구하기 위한 피크로시리우스 적색 염색 및 로다민 접합 렉틴 염색 절편을 사용한 간질성 심근 섬유증의 조직학적 평가, 및 Masson의 트리크롬 및 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드로 염색된 슬라이스의 플라니메트리에 의한 경색 크기 및 심장 리모델링(흉터 얇아짐, 중격 두께 및 확장 지수)의 정량화. 갈-3 MI가 있는 KO 마우스는 심장 재형성이 중단되고 흉터 얇아짐 비율과 팽창 지수가 증가한 것으로 나타났습니다. MI가 발병했을 때, 심근 기능과 심장 재형성도 심각한 영향을 받았다. MI 후 4주째에 경색된 Gal-3 KO 마우스에서 섬유증의 자연적 진화도 영향을 받았습니다.

요약하면, MI의 실험 모델은 Gal-3 및 기타 동물 모델의 유전자 결실을 가진 마우스에서 심장 복구 및 리모델링의 시간적 진화를 연구하는 데 적합한 모델입니다. Gal-3 의 결핍은 심장 복구의 역학에 영향을 미치고 MI 후 심장 리모델링 및 기능의 진화를 방해합니다.

서문

심근경색(MI)은 가장 흔한 형태의 심혈관 질환입니다. MI 후 심근은 MI 경색 영역의 치유, 심실 리모델링(VR) 및 심근 기능 장애¹을 포함하여 일련의 형태학적 및 기능적 변화를 겪습니다. MI의 치유는 섬유성 흉터의 형성으로 끝나는 깊은 염증성 침윤과 관련된 역동적이고 잘 조직된 과정입니다 ^2,3. 마우스에서 MI의 실험 모델은 현재 병리학적 조건 ^4,5 하에서 심장 리모델링을 연구하는 데 사용되며, 영구적인 관상동맥 결찰을 유도하기 위한 재현 가능하고 효과적인 절차를 개발하기 위해서는 정확한 수술 프로토콜에 대한 인식이 필수적입니다. 이 방법은 MI의 치유와 좌심실 리모델링(LVR)의 시간적 진화 및 MI와 관련된 심장 기능 장애와의 관련성을 연구하는 데 필요합니다.

갈렉틴(Galectin)은 세포 내 리간드(intracellular ligands), 막 수용체(membrane receptor) 및 세포 외 당단백질(extracellular glycoprotein)에 있는 특정 탄수화물을 인식하는 렉틴(lectin) 그룹입니다. 갈렉틴 3(Gal-3)은 세포 표면의 당접합체(glycoconjugates)에서 N-글리칸과 O-글리칸의 인식 및 가교를 통해 작용하는 이 과의 구성원으로, 면역 체계에서 널리 발현됩니다⁶. 이전 연구에서는 심혈관 질환에서 염증 및 섬유증 조절자로서 Gal-3의 역할을 조사했습니다 7,8,9,10,11,12. 염증은 리모델링의 진화에 현저한 영향을 미칠 수 있기 때문에 치유 중 염증의 조절 인자를 표적으로 삼는 것이 매우 중요하기 때문에, 우리는 MI 후 심실 리모델링의 시간적 진화를 연구하기 위한 프로토콜과 Gal-3의 유전적 돌연변이가 MI의 치유의 시간적 진화를 어떻게 수정하고 마우스의 심장 리모델링 및 기능에 영향을 미치는지를 결정하기 위한 단계와 방법을 설명하고자 했습니다.

프로토콜

참고: 이 프로토콜에 설명된 모든 실험은 부에노스아이레스 대학의 동물 관리 및 연구 위원회(CICUAL)의 승인을 받았으며, 이는 미국 국립 연구 위원회(National Research Council, 미국) 위원회의 실험실 동물 보호 및 사용 가이드 업데이트 위원회(Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)¹³에 따라 승인되었습니다. 실험을 위해 체중이 30-35g인 수컷, 연령 일치 C57BL/6J 및 Gal-3 KO 마우스(8-10주령)를 사용하여 수술을 더 잘 조작할 수 있습니다. 동물이 자유자재로 물과 음식에 접근할 수 있도록 합니다. Gal-3 KO 마우스는 대조군 C57BL/6J 마우스와 동일한 생물 자원 시설에서 C57BL/6J 배경에서 사육되었습니다.

1. 수술 부위 및 기구

1. 수술을 시작하기 전에 인공호흡기가 전원에 연결되어 있고 올바르게 작동하는지 확인하십시오. 마취액이 충분한지 확인하십시오. 수술 당일에 사용할 동물의 수를 계산하여 용액을 준비합니다.
2. 스테인리스 가위, 마이크로 가위, 크고 작은 바늘용 바늘 홀더, 견인기, 매우 날카롭고 구부러진 집게, 톱니 모양의 집게 및 조직 집게를 포함한 모든 수술 기구가 멸균되었는지 확인합니다. 70% 에탄올로 작업 영역을 청소하십시오.
3. 잠재적인 출혈을 즉시 소작할 수 있도록 작은 면봉, 히솝 및 거즈를 사용할 수 있는지 확인하십시오.
4. 왼쪽 하행 관상 동맥(LDA)의 결찰을 위한 10-0에서 7-0 실리콘 코팅, 꼰 실크 봉합사, 흉부 봉합을 위한 나일론 봉합사, 피부를 닫기 위한 린넨 실을 준비하십시오.

2. 마취 및 삽관

1. 마취 용량을 결정하기 위해 마우스의 무게를 측정합니다.
2. 스티로폼 베이스로 둘러싸인 가열 패드를 40°C로 예열합니다.
3. 케타민(65mg/kg), 자일라진(13mg/kg) 및 아세프로마진(1.5mg/kg)을 함유한 용액을 체중 0.1mL/10g의 근육 투여로 마우스에 마취합니다.
4. 마우스가 마취된 후 수술 절차를 시작하기 전에 손가락으로 발을 누르는 것과 같이 약간 고통스러운 자극을 유도하여 마취 깊이를 확인합니다. 동물이 자극에 반응하면 마취 깊이를 조정하십시오.
5. 마우스를 등쪽 욕창에 놓고 다리를 가열 패드 위의 작업 베이스에 테이프로 붙여 쌍안 실체 현미경 아래에 놓습니다. 작업 베이스에 부착된 상악 치아를 잡고 있는 실로 목을 과도하게 확장합니다.
6. 그런 다음 삽관 부분의 경우 목의 최소 절개를 통해 기관 고리를 노출^{시키고 설치류} 인공호흡기(일회 호흡량: 250mL/뇌졸중)에 연결된 20G 정맥 카테터로 이를 통해 34-38 사이클/분의 호흡 빈도로 전달합니다.
7. 동물을 측면 욕창에 놓고 네 번째 또는 다섯 번째 늑간 공간에서 왼쪽 측면 개흉술을 수행합니다. 동물의 피부를 절개하십시오. 아래 근육을 관찰하고 조심스럽게 벌려 흉벽에서 분리하여 늑간 공간을 명확하게 볼 수 있습니다. 이 시점에서 동물이 인공호흡기에 제대로 연결되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 매우 날카로운 집게로 구멍을 뚫어 늑간 공간을 엽니다.
   참고: LDA는 위에서 언급한 늑간 공간의 자유 좌심실(LV) 벽을 따라 식별할 수 있어야 합니다.
8. 심낭 절제술을 시행하고 관상 동맥과 관상 동맥 및 왼쪽 귓바퀴 아래의 LDA 파급 효과를 대조하여 LDA를 확인합니다. 그런 다음 8-0을 사용하여 LDA의 합자를 수행합니다. 귓바퀴 가장자리에서 ~ 2mm의 실크 실. 마지막으로, 6-0 실크 실을 사용하여 갈비뼈를 여러 겹으로 닫아 내부에 기흉이 없는지 확인하고(인공호흡기로 폐를 확장시켜 조심스럽게 이 작업을 수행함) 피부를 닫기 전에 근육에 접근하거나 봉합합니다.
9. 피부가 닫히면 복부 욕창의 인공호흡기에서 마우스를 천천히 분리하고 호흡 빈도가 회복되면 기관내관을 제거합니다. 동물이 마취에서 회복하도록 조용한 환경에서, 가급적이면 27 °C의 안정적인 실온에서 회복하십시오.
10. 동물이 마취에서 회복되고 팔다리를 움직이기 시작하고 정상적인 호흡 빈도가 회복될 때까지 기다립니다. 그런 다음 프로토콜이 끝날 때까지 개별 케이지에 수용합니다.
11. 대조군 또는 가짜 작동 동물에 대해 동일한 절차를 수행하되 LDA의 합자 없이 수행합니다.

3. 설계 연구

1. MI 후 치유 및 심실 리모델링의 시간적 진화를 테스트하기 위해 마우스를 다음 그룹으로 무작위 배정합니다.
   1. MI 진화 1주일 후 심실 리모델링의 초기 단계를 연구하기 위해, 마우스를 다음 그룹에 할당한다: 1) C57 Sham (1주); 2) 갈-3 KO 샴 (1주); 3) C57 MI (1주); 4) Gal-3 KO MI (1주).
   2. MI 4주에서 심실 리모델링의 후기 단계를 연구하기 위해, 마우스를 다음 그룹에 할당한다: 5) C57 Sham (4주); 6) Gal-3 KO Sham (4주); 7) C57 MI (4주); 8) Gal-3 KO MI (4주).

4. 심초음파검사

참고: 마우스 심초음파의 경우 벽 직경과 캐비티 크기를 적절하게 시각화하기 위해 10MHz 이상의 선형 변환기를 사용해야 합니다. 이 절차는 1.15mL/kg의 복강내(IP) 아베르틴을 사용한 마취 하에 또는 의식이 있는 동물에서 수행할 수 있습니다. 그러나 후자는 조작으로 인한 스트레스와 불안으로 인해 MI가 있는 마우스에서 혼란스러운 결과를 초래할 수 있습니다.

1. 마우스를 마취하려면 마우스를 들어 올려 손바닥을 향해 등을 대고 뒤집어 복부 표면에 닿습니다. 그 자세에서 동물과 피하 바늘 사이에 45° 각도로 IP 마취제를 주입합니다.
2. 마우스가 마취되면 가슴을 면도하고 미리 예열된 발열 패드 위에 마우스를 놓고 등쪽 욕창 위치에 놓습니다. parasternal 장축 및 단축 보기를 얻으려면 변환기를 90° 이동합니다. 올바른 축 보기가 얻어지면 커서를 유두 근육 수준에 놓고 2D M 모드 키를 눌러 이미지를 캡처한 다음 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 다음 매개변수를 측정합니다.
   1. 벽 두께(LVWT), 수축기(S) 및 이완기(D)의 LV 영역, 좌심실 이완기 영역(LVDA) 및 좌심실 수축기 영역(LVSA)을 포함한 LV 치수를 최소 3회 이상 측정합니다.
   2. 또한, 앞서 설명한 바와 같이 식 (1^), 식 (2) 및 식 (3)을 사용하여 박출률(EF, %), 단축 분율(SF, %) 및 심질량(보정되지 않은 큐브로 가정)으로 심실 기능을 계산합니다.
      SF (%) = ([LVEDD - LVESD]/LVEDD) × 100 (1)
      EF (%) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100 (2)
      LV 질량 = 1.055 × ([IVST + LVEDD + PWT]³− [LVEDD]³) (3)
      여기서 LVEDD는 좌심실 이완기 말단 직경, LVESD는 좌심실 수축기 직경, IVST는 뇌실 내 두께, PWT는 후벽 두께입니다.

5. 조직학 평가

1. 부검하는 동안 흉부를 좌우로 열고 흉부를 둘러싼 모든 구조를 절단하여 동물의 심장을 추출합니다. 티슈 페이퍼를 사용하여 부드러운 압력을 가하여 구멍 내부에 있는 혈전을 청소합니다.
2. 실험실용 정밀 저울로 심장을 수확하고 무게를 잰다. 실온에서 최소 72시간 동안 10% 포름알데히드에 담그십시오. 칼날을 사용하여 1mm 두께의 가로 조각으로 심장의 정점에서 바닥까지 수동으로 자르고 파라핀에 삽입하여 조각을 가공합니다. 마이크로톰으로 5μm 두께의 파라핀이 포함된 부분을 연속적으로 절단합니다.
3. 슬라이드 사이에 각 절편을 배치하고 헤마톡실린 및 에오신 (H&E), Masson의 삼색, 로다민 접합 렉틴 염색 절편 또는 Picrosirius red^15,16으로 염색합니다.
   1. 적절한 광현미경을 사용하여 형태 측정, 섬유증 및 MCSA 정량화를 위해 400x에서 디지털화된 이미지를 촬영합니다. 현미경이 디지털 카메라에 연결되어 있고 이미지 분석 소프트웨어가 있는 컴퓨터에 연결되어 있는지 확인합니다. 각 형태 측정 분석에 대해 이미지가 섹션당 400회(중격, 경색 영역 및 원격 영역)에서 최소 10개의 고출력 필드가 있고 필드가 겹치지 않는 동일한 영역에 있는지 확인합니다.
      1. MCSA를 측정하려면 심장 근세포의 위치를 알고 있어야 하며, 가로로 절단되고 최소 3개의 인근 모세혈관으로 둘러싸인 근세포만 계수해야 합니다.
      2. Picrosirius 붉게 염색된 절편에서 흉터와 중격 부위를 식별하고 두 부위의 간질 콜라겐을 이미지화합니다. 분석 소프트웨어에 이미지를 업로드하고 임계값 탭을 열어 모든 양성 및 음성 콜라겐 영역을 강조 표시합니다.데이터를 얻으려면 측정 탭을 누르고 결과를 저장하십시오. 영역당 콜라겐의 백분율을 계산하려면 방정식 (4)를 사용하고 콜라겐 양성 영역을 추가하고 다른 곳에서 설명한 대로 콜라겐 양성 영역을 포함한 총 조직으로 나눕니다^15,16.
         콜라겐(%) = Picrosirius red area/total tissue area (4)
      3. 파라핀 함유 샘플의 로다민 접합 렉틴 염색 절편에서 얻은 디지털화된 이미지에서 MCSA를 정량화합니다. 올바른 이미지를 얻으려면 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세포막을 둘러싼 근세포의 빨간색 윤곽을 추적하십시오. 영역 탭을 선택하고 윤곽선을 추적한 다음 측정 탭 기능을 누릅니다. 마지막으로 셀 영역¹⁶의 결과를 저장합니다.

6. 심장 리모델링을 평가하기 위한 경색 크기 및 플라니메트리의 정량적 측정

1. 심근 경색 크기, 벽 두께, 심내막 및 심외 둘레의 길이를 광학 현미경(4x)과 적절한 소프트웨어로 얻은 Masson의 삼색 염색 절편의 조직학적 이미지에서 플라니메트리를 사용하여 측정합니다.
   1. 경색 크기를 정량화하려면 경색 영역(파란색)과 원격 영역(빨간색)을 식별합니다. 경색 구역과 심내막 및 외막 쪽에서 원격 구역의 전체 길이를 추적하고 측정합니다. 심내막 및 심외막 추적의 평균을 총 LV 둘레에 대한 백분율로 계산합니다¹⁷.
   2. 마찬가지로, 심장 중간 부분의 흉터 두께(5개의 등거리 측정의 평균)와 중격 두께(3개의 등거리 측정의 평균)를 측정하고, 이러한 측정값을 사용하여 흉터 두께 비율(방정식 [5])과 확장 지수(방정식 [6]¹⁸)를 결정합니다.
      참고: 모든 값은 스프레드시트에 기록할 수 있습니다.
      흉터 두께 비율 = 흉터 두께/격막 두께(5)
      팽창 지수 = (LV 캐비티 면적/총 LV 면적) ×(격막 두께/흉터 두께) (6)
      참고: 리모델링은 팽창을 수정하여 경색 크기를 과소 평가하거나 과대 평가할 수 있으므로 24시간에 경색 크기를 측정하기 위한 파일럿 실험을 수행한 후 안락사를 수행하는 데 약간의 시간이 필요할 수 있습니다. 이 경우, MI 시술에 사용된 것과 동일한 IP 마취액으로 동물을 마취한다.
2. 동물을 등쪽 욕창에 넣고 앞에서 설명한 대로 삽관합니다. 동물이 마취되면 xiphoid apophysis에서 겨드랑이 구멍까지 피부, 근육 및 늑골에 도달하는 깊은 대각선 절개를 만듭니다.
3. 대동맥궁을 분리하고, 상행 대동맥에 작은 구멍을 뚫고, 카테터를 삽입하여 심장을 에반의 푸른색으로 관류시킵니다. 그런 다음 동물의 얼룩진 심장을 수동으로 제거하고 날카로운 칼날로 정점에서 바닥까지 자릅니다. 심장 조각을 1% 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)와 아이소톤 인산염 완충액(pH 7.4)에 넣고 37°C에서 30분 ⁴ 동안 배양하여 동물이 경색 크기 면에서 비슷한지 확인합니다.

결과

MI 후 생존과 부검
4주에 걸친 추적 관찰 결과, C57 마우스의 17%(4/23)와 Gal-3 KO 마우스의 40%(8/20)가 죽은 채로 발견되었습니다. 부검이 수행되었습니다. 죽은 Gal-3 KO 마우스는 C57 마우스보다 더 큰 심장을 보였으며(그림 1), C57 마우스의 38%가 Gal-3 KO 마우스의 32%에 비해 심장 파열과 직접적인 관련이 있는 거시적 흉혈을 ?...

토론

영구 관상동맥 결찰에 의한 MI의 실험 모델은 심장 복구 및 리모델링의 다양한 병태생리학적 메커니즘을 연구하는 데 사용됩니다 ^5,14,17. 이 논문은 심장 복구의 시간적 진화와 MI 후 심실 리모델링에 미치는 영향을 연구하기 위해 현재 이 실험실에서 사용되는 다양한 방법을 요약합니다^14,...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-0 silk suture	Ethicon
C57BL/6J mice	Department of Bioresources of the Faculty of Veterinary of the University of Buenos Aires, Argentina
Forceps
Hardvard 386 respirator	Hardvard company
Heating pad			maintain animal's temperature during surgery
Image Pro-Plus 6.0	Media Cybernetics		Image Analysis Software
Ketamine	Holiday
Masson Trichrome	BIOPUR
Picrosirius red	BIOPUR
Retractors
Rodent Ventilator Model 683	Harvard Apparatus		Mechanical ventilator
Scissors
Stereoscopic magnifying glass	Arcano
Vivid 7 machine (General Electric Medical Systems, Horten, Norway)	General Electric		Any tracking software can be utilized with this protocol
WGA no. RL-1022, Vector Laboratories, Burlingame	Vector Laboratories
Xylazine	Pro-Ser