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요약

본 프로토콜은 뉴런 K-Cl 공동 수송체 KCC2의 기능 및 활성을 연구하기 위한 웨스턴 블로팅 기술의 적용을 강조합니다. 상기 프로토콜은 웨스턴 블로팅을 통한 키나아제 조절 부위 Thr906/1007에서의 KCC2 인산화의 조사를 기술한다. 또한 KCC2 활성을 확인하는 추가 방법이이 텍스트에서 간략하게 강조 표시됩니다.

초록

염화칼륨 공동 수송 체 2 (KCC2)는 양이온-염화물 공동 수송 체 (CCC)의 용질 담체 패밀리 12 (SLC12)의 구성원이며, 뉴런에서만 발견되며 Cl- 항상성의 적절한 기능과 결과적으로 기능적 GABA 성 억제에 필수적입니다. KCC2의 적절한 조절 실패는 해롭고 간질을 포함한 여러 신경계 질환의 유병률과 관련이 있습니다. KCC2의 규제와 관련된 메커니즘을 이해하는 것과 관련하여 상당한 진전이 있었으며, 연구자가 그 기능과 활동을 연구 할 수있는 기술 개발에 대한 인증을 받았습니다. 직접(키나아제 조절 부위 인산화 평가) 또는 간접(GABA 활성 관찰 및 모니터링) 조사를 통해 . 여기에서 프로토콜은 웨스턴 블로팅 기술을 사용하여 키나아제 조절 부위(Thr906 및 Thr1007)에서 KCC2 인산화를 조사하는 방법을 강조합니다. 루비듐 이온 및 탈륨 이온 흡수 분석과 같은 KCC2 활성을 직접 측정하는 데 사용되는 다른 고전적인 방법이 있습니다. 패치 클램프 전기 생리학과 같은 추가 기술이 GABA 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 따라서, 세포 내 염화물 이온 항상성의 평가에 의해 통보 된 활성화 및 / 또는 비활성화 된 KCC2를 간접적으로 반영한다. 이러한 추가 기술 중 몇 가지가이 원고에서 간략하게 논의 될 것입니다.

서문

염화칼륨 공동 수송 체 2 (KCC2)는 뉴런에서만 발견되는 양이온-염화물 공동 수송 체 (CCC)의 용질 담체 패밀리 12 (SLC12)의 구성원이며 Cl- 항상성의 적절한 기능과 결과적으로 기능적 GABA 성 억제 1,2,3,4에 필수적입니다. KCC2에 의한 4-6 mM에서의 낮은 뉴런 내 Cl- 농도 ([Cl-] i)의 유지는 뇌 및 척수에서 γ- 아미노 부티르산 (GABA) / 글리신 과분극 및 시냅스 억제를 촉진한다5. KCC2의 적절한 조절 실패는 간질4을 포함한 여러 신경계 질환의 유병률과 관련이 있습니다. 또한, 감소된 KCC2-매개 Cl- 압출 및 손상된 과분극 GABAA 및/또는 글리신 수용체 매개 전류는 간질, 신경병증성 통증 및 경직과 관련이 있습니다6,7. 뉴런 KCC2는 미성숙 뉴런에서 탈분극된 GABA 활성의 유지를 용이하게 하는 비-라이신(WNK)-STE20/SPS1 관련 프롤린/알라닌 풍부(SPAK)/산화 스트레스 반응성(OSR) 키나아제 신호 전달 복합체1에 의해 C-말단 세포 내 도메인 내의 주요 조절 잔기의 인산화를 통해 음성으로 조절됩니다. . WNK-SPAK/OSR1은 트레오닌 잔기 906 및 1007(Thr906/Thr1007)을 인산화하고, 이어서 KCC2의 mRNA 유전자 발현을 하향조절하여 결과적으로 생리적 기능을 저하시킨다8,10. 그러나 더 중요한 것은 WNK-SPAK/OSR1 키나아제 복합체가 KCC2 발현 1,2,4,11,12를 인산화 및 억제하는 것으로 알려져 있으며, Thr906/Thr1007을 인산화하는 키나아제 복합체 신호전달 경로의 억제가 KCC2 mRNA 유전자13,14,15의 발현 증가와 관련이 있다는 것은 이미 사실입니다. . 단백질 인산화를 통한 신경 KCC2 및 Na+-K+-2Cl- 공수송체 1(NKCC1) 발현의 조절은 수반 작용하고 반대 패턴 1,4,16으로 작용한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

KCC2의 규제와 관련된 메커니즘에 대한 이해와 관련하여 일관되고 상당한 진전이 있었으며, 연구자가 그 기능과 활동을 연구 할 수있는 기술 개발에 대한 인증을 받았습니다. 직접(키나아제 조절 부위 인산화 평가) 또는 간접(GABA 활성 관찰 및 모니터링) 조사를 통해 . 여기에 제시된 프로토콜은 키나아제 조절 부위 Thr906/1007에서 공수송체의 인산화를 조사함으로써 뉴런 K+-Cl- 공동 수송체 KCC2의 기능과 활성을 연구하기 위한 웨스턴 블로팅 기술의 적용을 강조합니다.

웨스턴 블롯은 조직 또는 세포의 샘플에서 관심있는 특정 단백질을 검출하는 데 사용되는 방법입니다. 이 방법은 먼저 전기 영동을 통해 단백질을 크기별로 분리합니다. 그런 다음 단백질은 특정 항체를 사용하여 표적 단백질을 표시하기 전에 고체 지지체(일반적으로 막)로 전기영동적으로 전달됩니다. 항체는 비색, 화학발광 또는 형광 방법을 사용하여 검출되는 상이한 태그 또는 형광단-접합된 항체에 접합된다. 이를 통해 단백질 혼합물에서 특정 표적 단백질을 검출 할 수 있습니다. 이 기술은 KCC1 의 인특이적 부위를 특성화하는 데 사용되었으며 KCC3 Thr991/Thr1048 인산화17을 억제하는 키나아제 억제제를 식별하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜을 따르면 세포/조직 용해물에서 전체 및 인산화된 KCC2를 특이적으로 검출할 수 있습니다. 원칙적으로이 기술에 의한 단백질 접합 항체의 검출은 생리적 조절과 관련된 분자 메커니즘을 밝히는 KCC2의 인 부위에서의 협력 활동에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이되므로 매우 중요합니다. 전체 단백질 발현의 정량 분석은 KCC2의 기능 및 활성을 대표한다. 루비듐 이온 및 탈륨 이온 흡수 분석과 같은 KCC2 활성을 직접 측정하는 데 사용되는 다른 고전적인 방법이 있습니다. 패치 클램프 전기 생리학과 같은 추가 기술이 GABA 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 따라서, 세포 내 염화물 이온 항상성의 평가에 의해 통보 된 활성화 및 / 또는 비활성화 된 KCC2를 간접적으로 반영한다.

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프로토콜

참고: 프로토콜은 관심 있는 특정 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블로팅 방법을 설명합니다.

1. 세포 배양 및 형질감염

  1. 세포 배양 절차 전에 비드 배스(37°C)에서 모든 시약을 가온한다. 10 % 태아 소 혈청, 2mM L- 글루타민 각각 1 %, 100x 비 필수 아미노산, 100mM 나트륨 피루 베이트 및 100 단위 / mL 페니실린-스트렙토 마이신이 보충 된 배양 배지 인 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)를 준비합니다.
  2. 래트 KCC2b 인간 배아 신장 293 세포(HEK293rnKCC2b)18 를 비드 배스(37°C)에서 완전히 형질감염시켰다. 극저온 튜브에서 5mL의 새 배지가 들어 있는 원심분리 튜브로 세포를 옮깁니다. 셀을 1200 ×g에서 3-5 분 동안 돌립니다.
  3. 흡인기 피펫(진공 펌프에 고정)을 사용하여 상청액을 흡입하고 10mL의 새 배지를 추가하여 세포를 다시 부유시킵니다. 세포 현탁액을 10cm 접시에 옮깁니다.
  4. 접시를 인큐베이터에 넣고 가습 된 5 % CO2 분위기에서 37 °С에서 48 시간 동안 자라게합니다. 건강한 세포 성장을 보장하기 위해 잠복기를 모니터링합니다. 배양 기간 후에 90% 이상의 합류에 도달한 세포를 추가로 분할합니다.
  5. 세포 접시에서 오래된 배지를 흡인하고 2mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 헹굽니다. 트립신 2mL를 넣고 실온에서 약 1-2분 동안 배양합니다.
  6. 2mL의 완전 배지를 사용하여 접시에서 트립신 세포를 부드럽게 씻습니다. 새 접시에 새 배지 9mL를 추가하고 기존 접시의 용액 1mL를 새 접시에 각각 추가합니다. 분할 된 세포 접시를 48 시간 동안 인큐베이터로 다시 옮겨 90 % 컨플루언시≥ 얻습니다.
  7. 세포를 용해 완충액에서 세포를 수확하기 전에 대조군으로 디메틸 설폭사이드(DMSO), 8μM 스타우로스포린 또는 0.5mM N-에틸말레이미드(NEM)로 15분 동안 처리합니다.

2. 세포 용해물 및 로딩 시료의 제조

  1. 배양 접시에서 배지를 흡인합니다 (형질 주입 절차에서). 세포 배양물을 얼음 위에 놓고 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척합니다.
  2. PBS를 흡인 한 다음 50mM 트리스-HCl (pH 7.5), 1mM 에틸렌 글리콜 비스 (β- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N, N', N'- 테트라 아세트산 (EGTA), 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 50 mM 불화 나트륨, 5 mM 피로 인산 나트륨, 10 mM 나트륨 -β- 글리세로 포스페이트, 1 mM 나트륨 오르토 바나 데이트, 1 % (w / v) 트리톤 X-100, 0.27 M 자당, 1 mM 벤즈아민, 0.1 % (v / v) 2- 메르 캅토 에탄올 및 2 mM 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF)를 접시에 넣습니다.
    참고: 세포 수확 중 용해 완충액의 부피는 접시 크기에 따라 다릅니다(예: 1 x 107 cells/100mm dish/150 cm2 플라스크당 1mL의 용해 완충액이 적합하고 5 x 106 cells/60 mm dish/75 cm2 플라스크당 0.5mL가 적합합니다.
  3. 차가운 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 접시 바닥에서 세포를 긁어낸 다음 피펫을 사용하여 셀 현탁액을 이미 얼음 위에 있는 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 4 ° C에서 30 분 동안 튜브를 지속적으로 교반하십시오.
  4. 세포 용해물을 16,000 x g 의 차가운 원심분리기(4°C)에서 20분 동안 돌리고 원심분리기에서 튜브를 부드럽게 제거한 다음 얼음 위에 놓습니다. 상청액을 미리 냉각 된 신선한 튜브에 모으고 펠릿을 버립니다.
    참고: 셀 유형에 따라 원심분리력과 시간을 변경해야 할 수도 있습니다. 그러나 일반적인 지침은 16,000 x g 에서 20분 동안 원심분리할 것을 권장합니다. 그러나 이것은 모든 실험에 대해 결정되어야합니다. 예를 들어, 백혈구와 같은 섬세한 세포는 매우 가벼운 원심분리 속도가 필요합니다.

3. 세포 용해물로부터 면역침전제의 제조

  1. 피펫 300 μL의 단백질-G-세파로스를 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 용액을 500 x g 에서 2분 동안 돌리고 상청액을 버립니다.
  2. 500μL의 PBS를 넣고 용액을 잘 와동시킵니다. 용액을 500 x g 에서 2분 동안 돌리고 상청액을 버립니다. 이 단계를 반복하십시오.
  3. 1mg의 항 -KCC2 Thr906 및 항 -KCC2 Thr1007 항체를 200μL의 단백질 G- 세파 로스 비드와 혼합하고 PBS로 부피를 500μL로 구성합니다. 진동 플랫폼 또는 회전 휠에서 4°C에서 2시간 동안 흔듭니다. PBS로 2 번 씻으십시오.
  4. 전체 세포 용해물에 대해 단백질 정량을 수행하고 세척된 비드에 1mg의 세포 용해물을 추가합니다. 종단 간 회전 장치에서 4 ° C에서 2 시간 동안 부드럽게 배양합니다. 비드를 스핀다운하고 150mM 염화나트륨(NaCl)이 포함된 PBS로 3배 세척합니다.
  5. 면역침전제(비드)를 200μL의 PBS로 3x 세척합니다. 최종 펠릿을 100μL의 1x 리튬 도데실 설페이트(LDS) 샘플 버퍼에 재현탁합니다.
  6. 실온에서 로터 셰이커에서 튜브를 5분 동안 흔들고 75°C의 가열 블록에서 10분 동안 배양합니다. 로딩 샘플을 11,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하고 겔 로딩을 위해 상청액을 사용합니다.

4. 웨스턴 블롯 수행

  1. 주조 장치를 조립하고 새로 준비된 8% 분리 젤(레시피/준비는 표 1 참조)을 부어 주조 유리 상단에서 약 2cm의 공간을 허용하는 겔을 주조합니다. 200μL의 절대 이소프로판올을 설정에 추가하고 실온에서 60분 동안 그대로 둡니다.
    참고: 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 위한 폴리아크릴아미드 겔 제조법은 관심 단백질의 크기에 따라 다릅니다(표 2). 따라서 원하는 젤 비율을 결정하기 전에 단백질 크기를 기록해 두십시오.
  2. 피펫을 사용하여 이소프로판올을 제거하고 약 200μL의 증류수로 젤을 조심스럽게 헹굽니다. 새로 준비한 6% 스태킹 젤(레시피/준비는 표 1 참조)을 추가하여 주조 설정에서 약 2cm 공간을 채웁니다. 잘 빗에 부드럽게 끼우고 실온에서 30 분 동안 방치하십시오.
  3. 주조 된 젤을 전기 영동 탱크에 고정하십시오.
  4. 트리스 염기 30.3g, 글리신 144.1g 및 SDS 10g을 증류수 1000mL에 용해시켜 10x 전달 완충액을 제조합니다. 890mL의 증류수에 10mL의 10% SDS와 100mL의 10x 전달 완충액을 추가하여 1x 실행 완충액을 준비합니다.
  5. 1x 실행 버퍼를 탱크에 붓습니다. 5μL의 분자량 마커를 첫 번째 웰에 넣고 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE 젤의 각 웰에 로드합니다(사용된 빗 크기에 따라 18-30μL 사이). 빈 우물을 1x LDS로 채우고 90V에서 약 120-120분 동안 젤을 실행합니다.
  6. 58.2g의 트리스 염기와 29.3g의 글리신을 1000mL의 증류수에 녹여 10x 전달 완충액을 준비합니다. 20 % 메탄올을 함유 한 1x 전달 완충액으로 니트로 셀룰로오스 막을 활성화하십시오. 전달 버퍼로 젤과 멤브레인을 헹구고 준비 스택에 부드럽게 펼칩니다.
    참고: 실행 중인 버퍼 및 이송 버퍼의 pH는 필요한 최적의 pH에 있어야 하므로 조정할 필요가 없습니다. 또한 시간을 절약하기 위해 실험 전에 이러한 완충액을 준비하고 실온에서 보관하는 것이 좋습니다.
  7. 음극(검은색 프레임/끝) - 샌드위치 폼 - 여과지 - 헹군 SDS-PAGE 젤 - 헹군 니트로셀룰로오스 멤브레인 - 여과지 - 샌드위치 폼 - 양극(빨간색 프레임) 순서로 전송할 샌드위치를 정렬합니다. 조립 된 샌드위치를 이송 탱크에 쌓고 90 분 동안 90 V 또는 30 분 동안 360 V에서 작동합니다.

5. 항체 염색 및 이미지 개발

  1. 멤브레인을 제거하고 건조시킵니다. 0.1% 1x Tween 20(1x TBS-T)을 함유하는 트리스-완충 식염수 중 5% 탈지유로 만든 블로킹 완충액을 사용하여 실온에서 1시간 동안 막을 차단한다.
  2. 1차 항체 8,15,19 및 베타-액틴(로딩 대조군)의 적절한 희석액과 함께 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 밤새 차단 완충액에서 배양합니다. 멤브레인을 1x TBS-T를 각각 5분 동안 세 번 세척하여 세척합니다.
    참고: 베타-액틴, 알파-튜불린 또는 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소 항체와 같은 로딩 대조군과 함께 분리된 막의 배양은 후속 정량화 동안 다른 웨스턴 블로팅 결과를 정상화하기 위한 것입니다. 각 1차 항체에 대한 권장 희석액은 제조업체 매뉴얼에서 확인할 수 있습니다.
  3. 세척된 멤브레인을 블로킹 완충액에서 5000배 희석한 2차 항체와 함께 실온에서 60분 동안 인큐베이션한다. 다시 멤브레인을 1x TBS-T에서 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
    참고: 1차 항체가 제기된 종에 대해 2차 항체를 올려야 하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 총 KCC2의 1 차 항체가 마우스 항 -KCC2 인 경우 항 마우스에 대한 2 차 항체를 사용해야합니다.
  4. 세척된 멤브레인을 이미징 보드에 놓습니다. 동일한 부피의 각 강화 화학발광(ECL) 시약을 혼합하고 혼합 용액을 멤브레인에 부드럽게 펴 신호를 발생시킵니다.

6. 이미징 시스템 및 데이터 정량화를 이용한 이미지 획득

  1. 이미징 보드를 이미징 시스템의 적절한 구획으로 옮겨 이미징합니다. 이미지 처리를 위해 컴퓨터에서 이미징 소프트웨어를 엽니다.
  2. 도구 모음에서 새 프로토콜을 클릭하고 단일 채널을 선택합니다. 젤 이미징/적용 대화 상자에서 선택을 클릭하고 블롯으로 스크롤한 다음 Chemi Hi 감도 또는 Chemi Hi 해상도를 선택합니다. 그런 다음 신호 누적 설정을 클릭하여 획득할 이미지의 지속 시간과 수를 설정합니다.
  3. 프로토콜 설정에서 젤 배치를 클릭하고 필요한 경우 이미징 시스템에서 젤 을 조정합니다. 프로토콜 실행을 클릭하여 이미지를 가져옵니다.
  4. 이미징 카탈로그 상자 아래에서 획득한 이미지 중 하나를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 이미지를 컴퓨터에 저장합니다. 원하는 이미지로 이동하고 실행 대화 상자에서 이미지 선택 및 계속 을 클릭합니다.
  5. 이미지 변환 아이콘을 클릭하여 이미지의 대비와 픽셀 채도를 조정합니다. 일반 도구 모음에서 스크린 샷 아이콘을 클릭하여 원하는 이미지 형식에 따라 이미지를 컴퓨터에 저장합니다.
  6. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 밴드 밀도를 측정하고 적절한 통계 도구를 사용하여 분석합니다.

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결과

여기서, 도 1에 제시된 대표적인 결과는 웨스턴 블로팅 기법을 사용하여 KCC2b(HEKrnKCC2b)18을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포주에서 KCC2 및 NKCC1의 WNK-SPAK/OSR1 매개 인산화에 대한 스타우로스포린과 NEM의 영향을 조사하였다. 대표적인 결과에 대한 포괄적인 세부 사항은 Zhang et al.15에서 논의됩니다. NEM과 유사하게, 스타우로스포?...

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토론

KCC2를 포함하는 뉴런에서 발현되는 CCC의 SLC12의 활성을 측정하기 위해 많은 방법이 사용되었습니다. 이러한 기술 중 다수는 다양한 질병 관련 돌연변이에서 이러한 수송체의 기능적 관련성과 구조-기능 패턴 분석에 대한 과학적 지식을 향상시키는 것으로 입증되었습니다. 비판적으로, 다양한 방법(21)에 대한 장점과 주의사항이 있다. 그러나 위에서 설명한 프로토콜은 KCC2의 기능...

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공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 영국 왕립 학회 (보조금 번호 IEC \ NSFC \ 201094) 및 Commonwealth Ph.D. 장학금.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
40% acrylamideSigma-AldrichA2917Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per SulfateSigma-Aldrich248614Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAKDundee UniversityS670BUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2Dundee UniversityS700CUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940Thermo Fisher ScientificPA5-95678Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007Dundee UniversityS961CUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906Dundee UniversityS959CUsed as primary antibody for western blotting
anti-mouseCell Signalling technology66002Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1Dundee UniversityS841BUsed as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212Dundee UniversityS763BUsed as primary antibody for western blotting
anti-rabbitCell Signalling technologyC29F4Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheepabcamab6900Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAKDundee UniversityS669DUsed as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin IIISigma-AldrichT8578Used as primary antibody for western blotting
BenzamineMerck UK135828Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford CoomasieThermo Scientific1856209Used for lysate protein quantification
Casting apparatusAtto WSE-1165WUsed to run SDS-page electrophoresis
CentrifugeEppendorf5804Used in lysate preparation
CentrifugeVWRMicroStar 17RUsed for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100MLUsed for cell culture experiment
Dried Skimmed MilkMarvelN/AUsed to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucoseSigma-AldrichD6429Used for cell culture
ECL reagentPerkin ElmerORTT755/2655Used to develop image for western blotting
EDTAFisher ScientificD/0700/53Used as component of lysis buffer
EGTASigma-Aldriche4378Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power SupplyBioRadPowerPAC HCTo supply power to run SDS-page electrophoresis
EthanolThermoFisherE/0650DF/17Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivatedMerck Life Sciences UKF9665Used for cell culture
FumehoodWalkerA7277Used for cell culture
Gel Blotting - WhatmanGE Healthcare 10426981Used in western blotting to make transfer sandwich
GlycineSigma-Aldrich15527Used to make buffers
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc., USAVersion 6.0Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HClAcros Organics10647282Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating blockGrantQBT1Used to heat WB loading samples
HEK293 cellsMerck UK12022001-1VLCell line for culture experiment
ImageJ SoftwareWayne Rasband and Contributors; NIH, USA ImageJ 1.53eUsed to measure band intensities from western blotting images
Imaging systemBioRadChemiDoc MPUsed to take western blotting images
IncubatorLEECLEEC precision 190DUsed for cell culture
IsopropanolHoneywell24137Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solutionSigma-AldrichG7513Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)NovexNP0008Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid Merck Life Sciences UKM7145Used for cell culture
MicrocentrifugeEppendorf5418Used for preparing lysates for WB
Microplate readerBioRadiMarkUsed for lysate protein concentration readout
Microsoft PowerpointMicrosoft, USAPowerPoint2016Used to edit western blotting images
Molecular Weight MarkerBioRad1610373Used for western blotting
N-ethylmaleimideThermo Fisher Scientific23030Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membraneFisher Scientific45004091Used for western blotting
Penicillin-StreptomycinGibco15140122Used for cell culture
pH MeterMettler ToledoSeven compact s210Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer SalineSigma-AldrichD8537Used for cell culture
PKCδ pThr505Cell Signalling technology9374Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein GGeneronPG50-00-0002Used for immunoprecipitation
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653Used as component of wash buffer
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL5750Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadateSigma-AldrichS6508Used as component of lysis buffer
Sodium PyruvateSigma-AldrichS8636Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphateMerck UKG9422Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)Scientific Laboratory Supplies, UKS4400-1MGUsed for cell culture experiment
SucroseScientifc Laboratory SuppliesS0389Used as component of lysis buffer
TEMEDSigma-AldrichT7024Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer ChamberBioRad1658005EDUUsed in western blotting to transfer protein on membrane
TrisSigma-AldrichT6066Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA SolutionMerck Life Sciences UKT4049Used for cell culture
Tween-20Sigma-AldrichP3179Used as make TBS-T buffer
Vacuum pumpCharles AustenDymax 5Used for cell culture
VortexScientific IndustriesK-550-GEUsed in sample preparation
Vortex mixerScientific Industries LtdVortex-Genie  K-550-GEUsed of mixing resolved sample
Water bathGrant Instruments Ltd. (JB Academy)JBA5Used to incubate solutions

참고문헌

  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
  2. Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776(2017).
  3. Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
  4. Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
  5. Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
  6. Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
  7. Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142(2020).
  8. Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65(2015).
  9. Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  10. Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
  11. Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
  12. Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
  13. AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78(2020).
  15. Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967(2020).
  16. Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3(2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986(2016).
  18. Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
  19. Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  20. Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
  21. Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
  22. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  23. Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
  24. Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
  25. Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820(2019).
  26. Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
  27. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429(2012).
  28. Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
  29. Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992(2011).
  30. Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
  31. Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
  32. Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
  33. Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255(2015).
  34. Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
  35. Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
  36. Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
  37. Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
  38. Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
  39. Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
  40. Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032(2021).
  41. Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10(2016).
  42. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
  43. Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
  44. Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
  45. Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).

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