일차 세포와 배양된 세포에서 세포질 및 핵 Long RNA의 제조

요약

현재 프로토콜은 배양된 세포를 사용하여 핵 및 세포질 분획에서 RNA를 분리한 다음 qPCR을 사용하여 검증하는 효율적이고 유연한 방법을 제공합니다. 이것은 다른 RNA 준비 키트를 효과적으로 대체하는 역할을 합니다.

초록

세포 내 구성 요소의 분리는 수년 동안 세포 생물학의 핵심 도구였으며 그 위치가 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대한 유용한 통찰력을 제공할 수 있었습니다. 특히, 핵 및 세포질 RNA의 분리는 암세포와 약물의 새로운 표적을 찾는 맥락에서 중요해졌습니다. 핵-세포질 RNA 추출을 위한 키트를 구입하는 것은 일반적인 실험실 환경에서 필요한 많은 재료를 찾을 수 있는 경우 비용이 많이 들 수 있습니다. 더 비싼 키트나 기타 시간이 많이 소요되는 공정을 대체할 수 있는 본 방법을 사용하면 수제 용해 완충액, 벤치탑 원심분리기 및 RNA 분리 정제 컬럼만 있으면 핵 및 세포질 RNA를 분리할 수 있습니다. 용해 완충액은 핵막의 무결성에 영향을 미치지 않고 세포의 외막을 부드럽게 용해시켜 세포 내 구성 요소를 방출하는 데 사용됩니다. 그런 다음 핵은 용해 용액보다 높은 밀도를 갖기 때문에 간단한 원심분리 단계로 분리할 수 있습니다. 원심분리는 밀도 차이에 따라 이러한 영역을 분리하여 핵의 세포 내 요소를 세포질의 하위 요소와 분리하는 데 사용됩니다. 원심분리를 통해 서로 다른 성분이 분리되면 RNA clean-up kit를 사용하여 RNA 함량을 정제하고 qPCR을 수행하여 분리 품질을 검증하고 서로 다른 분획의 핵 및 세포질 RNA의 양으로 정량화합니다. 통계적으로 유의미한 수준의 분리가 달성되어 프로토콜의 효과를 보여줍니다. 또한, 이 시스템은 다양한 유형의 RNA(총, 작은 RNA 등)의 분리에 적용할 수 있어 세포질-핵 상호작용에 대한 표적 연구를 가능하게 하고 핵과 세포질에 존재하는 RNA의 기능 차이를 이해하는 데 도움이 됩니다.

서문

세포 내 구성 요소로의 세포 분획은 정의된 생화학적 영역의 분리 및 연구를 가능하게 하고 특정 세포 과정의 국소화와 이것이 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 결정하는 데 도움이 됩니다¹. 상이한 세포내 위치로부터 RNA를 분리하면 전사 수준 사건 및 핵과 세포질 사이의 다른 상호작용에 대한 유전적 및 생화학적 분석의 정확성이 향상될 수 있으며, 이는 현재 프로토콜²의 주요 목적이다. 이 프로토콜은 세포질 및 핵 RNA의 분리를 보장하여 핵 수출에서 각각의 역할을 결정하고 핵 및 세포질에서 RNA의 세포 내 국소화가 세포 과정에서의 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하기 위해 개발되었습니다. 일반적인 실험실 환경의 재료를 사용하여 결과의 품질을 위태롭게 하지 않으면서 이전에 확립된 프로토콜보다 더 효과적이고 저렴하게 핵 및 세포질 분획을 달성할 수 있었습니다³.

또한 세포질과 핵 사이의 분자 교환은 이러한 영역을 분리하여 직접 연구할 수 있습니다. 보다 구체적으로, 전사체를 이해하는 것은 발달과 질병을 이해하는 데 필수적입니다. 그러나 RNA는 주어진 시간에 다른 성숙 수준에 있을 수 있으며 다운스트림 분석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 이 프로토콜은 핵 및 세포질 세포 내 분획에서 RNA를 분리하는 기능을 허용하여 RNA 연구에 도움이 될 수 있으며 비암호화 RNA의 국소화 또는 핵 내 스플라이스 접합부 분석과 같은 관심 있는 특정 RNA에 대한 더 나은 이해를 가능하게 합니다.

이 프로토콜은 mRNA, rRNA 및 긴 비암호화 RNA(lncRNA)를 포함한 세포질 및 핵 긴 RNA를 분리하는 데 최적화되어 있으며, 이는 관심 있는 다른 RNA를 분리하도록 변형될 수 있는 활용된 RNA 정제 컬럼의 크기 선택성으로 인해 사용됩니다. 이전에는 mRNA 및 lncRNA와 같은 긴 RNA의 기능이 세포 내 각각의 국소화에 크게 의존했습니다 ^4,5. 따라서 핵에서 세포 내 영역으로의 수출에 대한 연구는 RNA 또는 기타 세포 구성 요소를 수출하는 것이 세포에서 가질 수 있는 역할을 이해하는 데 더 중점을 두게 되었습니다. lncRNA는 번역 및 후속 효과가 다른 형태의 RNA⁶과의 근접성 및 상호 작용에 크게 의존하기 때문에 이에 대한 대표적인 예입니다. 또한, 핵 영역과 세포질 영역 사이의 세포 요소 교환은 다양한 암 치료에 대한 내성 메커니즘과 관련이 있다⁷. 세포 내 구획의 분리는 핵 수출 억제제의 개발을 허용했으며, 이는 다른 치료법에 대한 내성 메커니즘의 효과를 감소시켰다⁸.

핵 및 세포질 RNA를 분리한 후 관심 RNA를 정제하는 단계를 수행합니다. RNA 정제 키트는 실험실에서 흔히 볼 수 있으며 긴 RNA를 정제하고 분리하는 기능을 하기 때문에 이 프로토콜의 목적에 잘 부합합니다. RNA 정제의 경우, 1.8보다 큰 260:280 비율을 생성하는 것은 RNA 염기서열 분석 또는 높은 수준의 순도와 분리가 필요한 기타 유사한 절차를 위한 샘플의 품질을 보장하는 데 매우 중요합니다. 불규칙한 260:280 값은 페놀 오염을 나타내며, 분리가 불량하고 부정확한 결과를 산출합니다⁹.

RNA 정제가 완료되고 260:280 값이 허용 범위 이상인 것으로 확인되면 qPCR을 사용하여 핵 및 세포질 분획의 분리 결과를 검증했습니다. 그렇게 함으로써, 관심 영역에 특이적인 프라이머를 사용하여 핵 및 세포질 분획 수준을 입증했습니다. 이 프로토콜에서, MALAT1 및 TUG1은 각각 핵 및 세포질 마커로서 사용되었다¹⁰. 함께, 그들은 MALAT1을 사용하여 높은 수준의 핵 분획을 입증할 수 있는 반면, 세포질 분획은 낮을 것으로 예상됩니다. 반대로, TUG1이 사용되는 경우, 세포질 분획 수준은 핵 분획 수준보다 높을 것으로 예상된다.

이 프로토콜을 사용하여 세포 내 작용 위치에 따라 RNA를 분리할 수 있었습니다. 이 실험 동안 많은 물질에 대한 광범위한 접근과 용해 완충액 및 밀도 기반 원심분리 기술의 활용으로 인해 다른 RNA 유형 및 기타 세포 구성 요소에 대한 적용 가능성이 널리 퍼져 있습니다. 이는 분리 없이는 구별할 수 없는 위치별 표현 이벤트를 조명하여 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.

프로토콜

K562 세포는 본 연구에 사용된다. 이 프로토콜은 1 x 10^6-5 x 10⁶⁰⁰ 만 셀에 대해 작동하도록 최적화되었습니다. 그러나 볼륨을 적절하게 늘려 더 큰 셀 수량에 맞게 절차를 확장할 수 있습니다.

1. 0.25x 용해 완충액의 제조

1. 표 1A에 제공된 다음 성분을 혼합하여 0.25x 용해 완충액을 준비합니다.
   참고: 샘플에는 약 300μL의 0.25x 용해 완충액이 필요합니다. 권장 부피 = 샘플 수 x 300μL.

2. 핵 및 세포질 분획의 분리

1. 1.5 mL 튜브를 사용하여 2000 x g(실온)에서 5분 동안 원심분리를 통해 세포를 펠렛화합니다. 흡인 피펫을 사용하여 상청액을 버립니다.
   참고: K562 세포는 이 프로토콜 동안 활용되었습니다. 그러나, 상기 프로토콜은 다양한 세포주에 적용될 수 있다.
2. 펠릿을 300μL의 얼음처럼 차가운 0.25x 용해 완충액에 재현탁합니다.
   알림: 2분 동안 얼음에 보관하고 45초마다 튜브를 회전시켜 세포가 적절하게 용해되도록 합니다.
3. 튜브를 최고 속도(12,000 x g)로 4°C에서 2분 동안 회전시킵니다.
4. 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하고 새 1.5mL 튜브에 넣습니다. 이것은 세포질 분획이 될 것입니다. 약 300μL의 세포질 분획이 얻어질 것입니다.
5. 나머지 펠릿은 핵 분획이 될 것입니다. 500 μL의 얼음처럼 차가운 PBS를 펠릿에 첨가하고 실온에서 5분 동안 2,000 x g 에서 원심분리한다.
   참고: 이 단계에서 과도한 DNA가 제거됩니다.

3. RNA 정제 키트를 이용한 RNA 클린업

참고: 이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 RNA 정제 키트를 사용하여 달성되었습니다( 재료 표 참조).

1. 세포질 RNA 샘플과 핵 세포질 샘플을 분리합니다(분획 단계가 서로 다르기 때문에).
   1. 세포질 분획을 분리하려면 1,050μL의 3.5x RLT 용해 완충액( 재료 표 참조)을 추가하고 간략하게 와동시킵니다. 그런 다음 750μL의 90% 에탄올을 추가하고 RNA 클린업 키트에서 컬럼에 로드합니다.
      참고: 용액은 컬럼에 로드하기 전에 잘 혼합되어야 합니다.
   2. 핵 분획을 분리하기 위해 600μL의 3.5x 용해 완충액을 추가하고 와류합니다. 그런 다음 600 μL의 70 % 에탄올을 첨가합니다.
2. 세포질 분획과 핵 분획을 모두 RNA 컬럼에 로드합니다( 재료 표 참조).
   참고: 3단계의 나머지 부분에서는 세포질 및 핵 샘플 모두 동일한 절차를 따릅니다. 그러나 이러한 샘플이 서로 독립적으로 유지되는지 확인합니다.
   1. 세포질 분획과 핵 분획을 모두 RNA 컬럼에 로드하고 실온에서 8,000 x g 에서 30초 동안 회전합니다. 초과 흐름을 버리십시오.
   2. 시판되는 정제 키트(RW1 완충액, 재료 표 참조)로부터 350 μL의 세척 완충액을 추가하고, 다시 회전시키고, 통과된 흐름을 버린다.
   3. DNAse 용액(1U/uL)을 실온에서 15분 동안 추가합니다. 그런 다음 350μL의 세척 버퍼를 추가하고 다시 회전시킨 다음 흐름을 버립니다.
   4. 500 μL의 순한 세척 완충액(RPE, 재료 표 참조)을 추가하고, 다시 회전시키고, 흐름을 버립니다. 500 μL의 순한 세척 완충액을 넣고 다시 탈수하되 2분 동안만 탈수합니다.
   5. 컬럼을 새 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 스핀 컬럼에 물 30μL를 추가합니다. 회전하기 전에 컬럼을 1분 동안 그대로 두십시오.

4. 핵-세포질 분리의 검증

1. cDNA 합성 수행
   1. RNA의 세포내 구획이 추출되고 정제되면 qPCR을 사용하여 구획의 분리를 확인합니다. 이를 위해 먼저 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 키트를 사용하여 RNA를 cDNA로 전환합니다( 재료 표 참조).
   2. 역전사효소 마스터믹스를 준비합니다. 템플릿 RNA를 추가합니다. thermocycler에서 반응을 배양합니다.
      참고: 무작위 헥사머의 경우, 사용된 사이클링 매개변수는 표 2A에 제공된다. 역전사효소 반응을 즉시 사용하거나 -20°C에서 보관한다(표 1B).
2. 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 및 분석을 수행합니다.
   1. cDNA 합성을 DEPC 물( 재료 표 참조)로 희석하여 최종 농도가 20ng/mL가 되도록 합니다.
   2. PCR 마스터 믹스를 사용하여 아래 나열된 수동 지침을 사용하여 각 샘플에 대한 반응을 준비합니다.
   3. 세포질 및 핵 분획을 검출하는 데 필요한 상용 프로브를 확보합니다. MALAT1을 핵 마커로, TUG1을 세포질 마커로 사용합니다( 재료 표 참조).
      참고: MALAT1 및 TUG1에 대한 시퀀스는 표 3에 나와 있습니다.
   4. 개별 표본에 대한 각 기술 반복실험에 대해 각 성분에 3을 곱하여 각 성분의 부피를 계산합니다.
   5. 각각의 핵 및 세포질 샘플에 대해, 각각에 대해 다음의 혼합물을 획득한다: (a) MALAT1을 사용한 핵 분획, (b) MALAT1을 사용한 세포질 분획, (c) TUG1을 사용한 핵 분획, 및 (d) TUG1을 사용한 세포질 분획(표 1C).
   6. 간략하게 소용돌이치면서 용액을 혼합하고 혼합물 20 μL를 광학 반응 플레이트의 각 웰로 옮깁니다( 재료 표 참조).
   7. qPCR에 사용되는 투명 접착 필름으로 플레이트를 덮고( 재료 표 참조) 플레이트를 잠시 원심분리하여 기포를 제거한 다음 실온에서 5분 동안 300 x g 에서 샘플을 회전시킵니다.
   8. 설계 및 해석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 사이클링 매개변수에 대한 표준 곡선을 선택합니다(표 2B).
   9. qPCR 소프트웨어를 사용하여 실행 설정을 선택합니다(보충 그림 1).
   10. 데이터 파일 속성 페이지에서 표 2B에서 방법 및 입력 주기 매개 변수를 선택합니다(보충 그림 2).
   11. 사이클 파라미터를 입력한 후 플레이트 탭을 선택하고 실행할 샘플을 입력합니다(보충 그림 3). 실행 시작을 선택합니다.
       참고: 설명된 단계는 상업적으로 이용 가능한 마스터 믹스를 사용하여 qPCR 기계에서 수행되었습니다( 재료 표 참조).
3. 데이터 분석 수행
   1. 실행이 완료되면 샘플 이름, 타겟 이름 및 정량 주기(Cq)가 포함된 데이터 스프레드시트를 생성합니다(보충 표 1).
   2. MALAT1 샘플로 시작하여 핵 분율을 계산합니다. MALAT1 핵 분획에서 MALAT1 세포질 분획을 뺀다(표 4).
   3. 그런 다음 ΔCq(2^(-value))를 계산합니다(표 5).
   4. MALAT1 샘플을 계속 사용하여 세포질 분획을 계산하고 MALAT1 세포질 분획에서 MALAT1 핵 분획을 뺀 다음 ΔCq(2^(-값))를 계산합니다(표 6).
      참고: ΔCq를 살펴보면 핵 MALAT1 분획(녹색 강조 표시)이 세포질(빨간색 강조 표시)보다 더 큰 MALAT1 마커를 갖는 것으로 관찰되지만, 이제 세포질 분획이 주로 세포질이고 핵 분획이 세포질 오염을 포함하지 않는지 확인하기 위해 확인이 필요합니다.
   5. TUG1 샘플의 경우 위와 동일한 계산을 수행합니다(4.3.2-4.3.4단계)(표 7).
      참고: ΔCq를 살펴보면 세포질 TUG1 분획(녹색 강조 표시)이 핵 분획(빨간색 강조 표시)보다 더 큰 TUG1 마커를 갖는 것으로 관찰되어 세포질 및 핵 분획의 양호한 분리를 확인할 수 있습니다(표 8, 그림 1).

결과

핵 및 세포질 분리가 달성되었는지 확인하기 위해 qPCR을 수행하여 결과를 검증했습니다. 그렇게 함으로써, 관심 영역에 특이적인 프라이머는 핵 및 세포질 분획 수준을 입증하는 데 활용되었습니다. 본 연구에서는 MALAT1과 TUG1을 각각 핵과 세포질 프라이머로 사용하였다. 함께, 그들은 핵 원소에 대한 양성 대조군으로 MALAT1을 사용하여 높은 수준의 핵 분획을 입증할 수 있는 반면, 세포질 분획은 낮...

토론

프로토콜 전반에 걸쳐, 관심 있는 세포주에 가장 효과적이도록 요소를 최적화하기 위한 몇 가지 단계가 취해졌다. 프로토콜 내의 단계는 비교적 간단하지만 프로토콜의 중요한 측면에서 분석 및 사소한 조정이 필요할 수 있습니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 용해 완충액의 농도를 관심 세포주와 세포 표적에 따라 적절한 농도로 수정하는 것입니다. 용해 완충액의 이용은 세포막의 파괴에 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent Tapestation	Agilent	G2991BA	The Agilent TapeStation system is an automated electrophoresis solution for the sample quality control of DNA and RNA samples.
0.5% Nonidet P-40	Thermo-Fischer	28324	Used in the making of lysis buffer
50 mM Tris-Cl pH 8.0	Thermo-Fischer	15568025	Used in the making of lysis buffer
MALAT1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00273907_s1	Utilized for confirmation of Nuclear fraction.
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode	Thermo-Fischer	4326659	The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo-Fischer	4311971	The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate during qPCR
PBS	Gibco	20012-023	Phosphate-buffered saline (PBS) is a balanced salt solution that is used for a variety of cell culture applications, such as washing cells before dissociation, transporting cells or tissue samples, diluting cells for counting, and preparing reagents.
Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit	Qiagen	74106	RNA cleanup kits enable efficient RNA cleanup of enzymatic reactions and cleanup of RNA purified by different methods. Includes RW1, RLT, RW1 buffers mentioned throughout protocol.
QuantStudio 6	Thermo-Fischer	A43180	qPCR software utilized during protocol. Includes Design and Analysis Software for analyzing fractionation samples
RLT Buffer	Qiagen	79216	Lysis Buffer from RNA clean-up kit
RPE Buffer	Qiagen	1018013	Wash Buffer from RNA clean-up kit
RW1 Buffer	Qiagen	1053394	Wash Buffer from RNA clean-up kit
Taqman Gene Expression Assays	Thermo-Fischer	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays represent the largest collection of predesigned assays in the industry with over 2.8 million assays across 32 eukaryotic species and numerous microbes. TaqMan Gene Expression assays enable you to get results fast with no time wasted optimizing SYBR Green primers and no extra time spent running and analyzing melt curves.
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo-Fischer	4305719	TaqMan Universal PCR Master Mix is the ideal reagent solution when you need a master mix for multiple 5' nuclease DNA applications. Applied Biosystems reagents have been validated with TaqMan assays and Applied Biosystems real-time systems to ensure sensitive, accurate, and reliable performance every time.
TUG1 GE Assay	Thermo-Fischer	Hs00215501_m1	Utilized for confirmation of Cytoplasmic fraction.
UltraPure DEPC-Treated Water	Thermo-Fischer	750024	UltraPure DEPC-treated Water is suitable for use with RNA. It is prepared by incubating with 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC), and is then autoclaved to remove the DEPC. Sterile filtered.