황화수소 생성 박테리아 검출을 위한 민감한 시각적 방법

요약

여기에서 우리는 황화비스무트(BS) 침전에 사용되는 수정된 프로토콜로 황화수소 생성 박테리아를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 평가하기 쉽고 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다.

초록

황화수소(_H2S)는 인체 건강에 중요한 역할을 하는 황 함유 아미노산과 단백질의 단백질 분해에서 박테리아에 의해 생성되는 독성 가스입니다. H₂S 생산 시험은 중요한 박테리아 생화학 적 동정 시험 중 하나입니다. 전통적인 방법은 지루하고 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 황 함유 매질에서 중금속 염의 독성 효과로 인해 박테리아 성장이 억제되기 쉬워 종종 부정적인 결과를 초래합니다. 여기에서 우리는 박테리아에서 H₂S를 검출하는 간단하고 민감한 방법을 확립했습니다. 이 방법은 96웰 투명 마이크로타이터 플레이트를 사용하는 황화비스무트(BS) 침전의 수정된 버전입니다. 세균 배양을 L-시스테인을 함유한 비스무트 용액과 합하여 20분 동안 배양한 후 흑색 침전물이 관찰되었습니다. _H2S에 대한 시각적 검출 한계는 0.2mM이었다. 시각적 색상 변화를 기반으로 H₂S 생성 박테리아의 간단하고 처리량이 높으며 신속한 검출이 가능합니다. 요약하면, 이 방법은 박테리아에서_H2S생산을 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

황화수소 생성 박테리아는 황 함유 아미노산과 단백질을 활용하여 황화수소(_H2S)를 생성할 수 있습니다. H₂S의 생산은 일반적으로 그람 음성 장내 세균과 박테리아 및 시트로박터 종, 프로테우스 종, 에드워시엘라 종 및 셰와넬라 종 ¹의 구성원에서 발생합니다. 이 박테리아는 에너지를 얻기 위해 황산염을 황화수소(_H2S)로 환원시키는 능력이 있습니다. 황화수소는 박테리아 약물 내성의 발달과 관련이 있습니다. H 2 S는 활성 산소 종 (ROS)의 독성으로부터 박테리아를 보호하여 항생제 ^2,3의 항균 효과를 길항합니다. _H2S는 또한 항상성 유지에 중요한 생리학적 효과를 갖는다. 초생리학적 수준에서 H₂S는 신체에 심각한 독성을 나타내는 것으로 나타났습니다. 인체에서 H₂S는 다양한 생리 학적 및 병리학 적 과정에 관여하는 가스 신호 분자로서의 또 다른 역할을합니다. _H2S는 심장의 수축기 기능을 조절할 수 있으며 혈관을 이완시키고 혈관 리모델링을 억제하며 심근을 보호하는 데 중요한 생리학적 역할을 합니다 ^4,5. _H2S는 또한 신경계와 소화관을 조절하는데 중요한 역할을 한다 ^6,7. 살균성 항생제에 노출되면 박테리아는 치명적인 활성 산소 종 (ROS)을 생성하여 세포 사멸을 유도한다는 것이 밝혀졌습니다 8,9,10,11.

미생물 실험실 과정에서 일반적인 생화학 적 검사로서 황화수소 검사는 박테리아, 특히 장내 세균과 (Enterobacteriaceae)의 박테리아를 식별하는 중요한 실험입니다. 현재, 황화수소 시험은 일반적으로 시험 할 박테리아를 접종 한 많은 수의 황 함유 아미노산 및 납 아세테이트 배지에 대해 수행됩니다. 배양 기간(2-3일) 후, 결과는 아세트산납 생산으로 인해 배양 배지 또는 아세트산납 종이 스트립이 검게 변하는지 여부를 관찰하여 판단한다¹¹. 그러나 이러한 전통적인 방법은 지루하고 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 황 함유 배지에서 중금속 염의 독성 효과로 인해 박테리아 성장을 억제하는 경향이 있어 종종 부정적인 결과를 초래합니다. H2S12,13의 검출을 위한 비스무트기반 방법이 확립되었다. H₂S는 비스무트와 반응하여 흑색 비스무트 황화물 침전을 형성 할 수 있습니다. 이 생화학적 검사에 대한 개혁을 수행하기 위해서는 박테리아 성장에 부작용이 없는 간단하고 빠른 방법을 확립해야 합니다. 여기에서는 황화비스무트를 기질로 사용하여 시험관 내 환경에서 자란 황화수소 생성 박테리아를 96웰 마이크로타이터 플레이트 형식으로 검출하기 위한 간단한 방법을 설정했습니다.

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프로토콜

1. 박테리아 균주

참고: 이 실험을 위해 살모넬라 파라티피 A, 살모넬라 파라티피 B, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 엔테로코커스 패칼리스, 황색포도상구균, 녹농균 PAO1, 에어로모나스 하이드로필라 YJ-1, 프로테우스 부이가리스 및 폐렴간균을 포함한 9개의 표준 균주가 사용되었습니다(표 1). 살모넬라 파라티피 A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa, 및 Proteus vuigaris는 이전 문헌¹에 요약된 바와 같이_H2S를 생성할 수 있습니다.

1. 세균 배양의 준비
   1. 살모넬라 파라티피 A, 살모넬라 파라티피 B, 엔테로코커스 패칼리스, 황색포도상구균, 녹농균 PAO1, 에어로모나스 하이드로필라 YJ-1 및 폐렴간균의 박테리아 콜로니 1개를 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트에서 LB 배지 100mL로 옮기고 박테리아 농도가 약 1 x 10⁹ cells/mL가 될 때까지 37°C에서 12-16시간 동안 배양합니다(OD₆₀₀ = 1로 표시됨).
   2. 트립티카제 대두 배양액(TSB) 한천 플레이트에서 Fusobacterium nucleatum 및 Proteus vuigaris 의 박테리아 콜로니 1개를 TSB 배지 100mL로 옮기고 박테리아 농도가 약 1 x 10⁹ cells/mL가 될 때까지 37°C에서 24시간 동안 혐기성 배양합니다(OD₆₀₀ = 1로 표시됨).

2._H2S검출 분석

1. 황화수소 생산 시험
   1. 박테리아 배양액 100μL와 새로 제조된 비스무트 용액 100μL(pH 8.0; 10mM 염화비스무트(III), 0.4M 트리에탄올아민-HCl, 20mM 피리독살 5-인산 일수화물, 20mM EDTA 및 40mM L-시스테인)를 96웰 마이크로타이터 플레이트에 혼합하고 37°C에서 20분 동안 배양합니다. 각 박테리아 균주에 대해 분석을 세 번 수행하십시오.
   2. 20분 후 색상 변화를 확인합니다. 용액의 색이 연한 노란색에서 검은 색으로 변하면 박테리아가 H₂S를 생성 할 수 있음을 나타냅니다.이 측정을 3 번 반복하십시오.
2. 방법의 민감도
   1. 상이한 농도의 수황화나트륨(NaHS)을 사용하여 방법의 민감도를 결정한다: 2 mM, 1 mM, 0.8 mM, 0.6 mM, 0.4 mM, 0.2 mM, 0.1 mM 및 0 mM, BS 용액 ¹⁴와 혼합.
   2. 검은색 BS 침전물의 형성을 관찰하여 HS^-/S^2- 의 존재를 결정합니다. 색상 생성 없음(-)에서 가장 어두운 검은색 색상 생성(++++++)까지 시각적 척도를 사용하여 웰의 색상을 채점합니다.

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결과

황화수소 생성 박테리아 검출
_H2S시험의 성능은 표 1에 열거된 바와 같이, 선택된 박테리아 균주의 순수 배양물을 사용하여 조사하였다. 결과는 살모넬라 파라티피 B, 푸소박테리움 뉴클레아툼, 엔테로코커스 패칼리스, 녹농균 및 프로테우스 부이가리스가 검은색 BS 침전물로 H_2S를 생성할 수 있는 반면, 살모넬라 파라티피 A,

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토론

황화수소 생산 시험은 박테리아 균주의 식별 및 분화를위한 기존의 표현형 시험 중 하나입니다. 많은 박테리아 종은 수생수와 같은 자연 환경에서 황화수소를 생성할 수 있습니다. 이러한 박테리아 종에는 살모넬라 종, 시트로박터 종, 프로테우스 종, 슈도모나스 종, 클렙시엘라 종, 대장균의 일부 균주 및 혐기성 클로스트리디아^15,16

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bismuth (III)chloride	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	7787-60-2
EDTA	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd	60-00-4
Enterococcus faecalis	ATCC	19433
Fusobacterium nucleatum	ATCC	25586
Klebsiella pneumoniae	ATCC	43816
L-cysteine	Amresco	52-90-4
Proteus vuigaris	CMCC	49027
Salmonella paratyphi A	CMCC	50001
Salmonella paratyphi B	CMCC	50094
Staphylococcus aureus	ATCC	25923
Triethanolamine-HCl	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.	637-39-8