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요약

본 프로토콜은 외막 소포의 생명공학을 생산, 정제, 생체접합 및 특성화를 포함하는 "플러그 앤 디스플레이" 백신 플랫폼으로 설명합니다.

초록

박테리아 또는 바이러스로부터 얻은 생체 모방 나노 입자는 백신 연구 및 개발에 상당한 관심을 끌었습니다. 외막 소포(OMV)는 평균 성장 동안 주로 그람 음성 박테리아에 의해 분비되며, 나노 크기의 직경과 자가 보조 활성을 가지고 있어 백신 전달에 이상적일 수 있습니다. OMV는 단백질, 핵산 및 소분자에 대한 다면적 전달 시스템으로 기능했습니다. OMV의 생물학적 특성을 최대한 활용하기 위해 생체 공학 대장균 유래 OMV를 운반체로, SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인(RBD)을 항원으로 활용하여 "플러그 앤 디스플레이" 백신 플랫폼을 구축했습니다. 스트렙토코커스 화농성 내의 SpyCatcher (SC) 및 SpyTag (ST) 도메인을 접합체 OMV 및 RBD에 적용하였다. Cytolysin A (ClyA) 유전자는 플라스미드 형질 감염 후 융합 단백질로서 SC 유전자와 함께 번역되어 OMV 표면에 반응 부위를 남겼습니다. 종래의 완충 시스템에서 RBD-ST를 밤새 혼합한 후, OMV와 RBD 사이에 공유 결합이 형성되었다. 따라서, 다가 표시 OMV 백신이 달성되었다. OMV 백신 플랫폼은 다양한 항원으로 대체함으로써 다양한 이종 항원을 효율적으로 표시하여 잠재적으로 전염병 전염병을 신속하게 예방할 수 있습니다. 이 프로토콜은 생산, 정제, 생체 접합 및 특성화를 포함하여 OMV 백신 플랫폼을 구성하는 정확한 방법을 설명합니다.

서문

잠재적인 백신 플랫폼으로서 외막 소포(OMV)는최근 몇 년 동안 점점 더 많은 관심을 끌고 있습니다1,2. 주로 그람 음성 박테리아3에 의해 자연적으로 분비되는 OMV는 일반적으로 20-300 nm4 크기의 지질 이중층으로 구성된 구형 나노 스케일 입자입니다. OMV에는 박테리아 항원 및 병원체 관련 분자 패턴(PAMP)을 포함한 다양한 모 박테리아 구성 요소가 포함되어 있으며, 이는 고체 면역 강화제역할을 합니다5. OMV는 고유한 구성 요소, 천연 소포 구조 및 우수한 유전 공학 변형 부위의 이점을 활용하여 박테리아 백신6, 보조제7, 암 면역 요법 약물8, 약물 전달 벡터9 및 항균 접착제10을 포함한 많은 생물 의학 분야에서 사용하기 위해 개발되었습니다.

2020년부터 전 세계적으로 확산된 SARS-CoV-2 팬데믹은 글로벌 사회에 큰 타격을 입혔습니다. 스파이크 단백질 (S 단백질)의 수용체 결합 도메인 (RBD)은 인간 안지오텐신 전환 효소 2 (ACE2)와 결합 할 수 있으며, 이는 세포11,12,13으로의 바이러스 진입을 매개합니다. 따라서 RBD는 백신 발견14,15,16의 주요 표적인 것으로 보입니다. 그러나, 단량체 RBD는 면역원성이 좋지 않고, 분자량이 작기 때문에 면역계가 인식하기 어렵기 때문에 보조제가 종종 필요하다17.

RBD의 면역원성을 증가시키기 위해, 다가 RBD를 나타내는 OMV가 구축되었다. RBD를 표시하기 위해 OMV를 사용하는 기존 연구는 일반적으로 RBD를 OMV와 융합하여 박테리아18에서 발현됩니다. 그러나 RBD는 바이러스 유래 단백질이며 원핵 생물 발현이 그 활성에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 스트렙토코커스 화농성으로부터 유래된 SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC) 시스템을 사용하여 종래의 완충 시스템19에서 OMV 및 RBD와 공유 이소펩타이드를 형성하였다. SC 도메인은 생체 공학 대장균에 의한 융합 단백질로서 Cytolysin A (ClyA)로 발현되었고, ST는 HEK293F 세포 발현 시스템을 통해 RBD로 발현되었다. OMV-SC 및 RBD-ST를 혼합하고 밤새 배양하였다. 초원심분리 또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 정제 후, OMV-RBD를 수득하였다.

프로토콜

1. 플라스미드 구성

  1. SpyCatcher 서열을 코딩하는 DNA (보충 파일 1)를 BamH I 및 Sal I 부위 사이의 암피실린 내성 pThioHisA-ClyA 플라스미드 (재료 표 참조)에 삽입하여 이전에 발표 된 보고서20에 따라 플라스미드 pThioHisA ClyA-SC를 구축합니다.
  2. 합성된 SpyTag-RBD-Histag 융합 유전자(보충 파일 1)를 BamH I 및 EcoR I 부위 사이의 pcDNA3.1 플라스미드( 재료 표 참조)로 라이게이트하여 이전에 공개된 보고서19에 따라 플라스미드 pcDNA3.1 RBD-ST를 구축합니다.

2. OMV-SC 준비

  1. 아래 단계에 따라 ClyA-SC 변환을 수행합니다.
    1. 50μL의 BL21 적격 균주에 5μL의 pThioHisA ClyA-SC 플라스미드 용액(50ng/μL)을 추가하고 부드럽게 불어넣고 얼음에서 30분 동안 식힙니다.
    2. 용액을 42°C의 수조에 90초 동안 넣은 다음, 즉시 혼합 용액을 얼음 위에 3분 동안 둔다.
    3. 500 μL의 LB 배지를 박테리아 현탁액에 첨가하고, 혼합 후, 37°C에서 220 rpm에서 1시간 동안 배양한다.
    4. 모든 형질전환된 암피실린(100 μg/mL, 재료 표 참조)을 함유하는 LB 한천 플레이트에 플레이트하고 37°C에서 밤새 배양한다.
      참고: 후속 실험에서, 암피실린은 배지에서 동일한 농도로 유지되었다. 그렇지 않으면 박테리아에서 플라스미드가 손실 될 수 있습니다.
  2. OMV-SC 프로덕션의 경우 아래 단계를 수행하십시오.
    1. 플레이트로부터 단일 콜로니를 분리하고(단계 2.1.4.) 20mL의 LB(암피실린 내성) 배지로 37°C에서 220rpm으로 밤새 배양합니다.
    2. 박테리아 용액(단계 2.2.1에서)을 2L 배지에 접종하고 대수 성장 단계(OD600nm 는 0.6 내지 0.8 사이)가 될 때까지 5시간 동안 220rpm, 37°C에서 배양한다.
    3. 박테리아 용액의 600nm에서의 OD가 0.6-0.8에 도달하면 이소프로필 베타-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG, 재료 표 참조)를 추가하여 박테리아 용액의 최종 농도를 0.5mM로 만든 다음 25°C에서 220rpm으로 밤새 배양합니다.
  3. OMV-SC 정제를 수행합니다.
    1. 박테리아 용액을 4°C에서 7,000 x g 에서 30분 동안 원심분리합니다.
    2. 0.22μm 멤브레인 필터로 상청액을 여과한 다음 100kD 한외여과막 또는 중공 섬유 컬럼을 사용하여 농축합니다( 재료 표 참조).
    3. 농축액을 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 여과한 다음 초원심분리기(재료 표 참조)를 사용하여 4°C에서 2시간 동안 150,000 x g로 원심분리하고 피펫으로 상청액을 버립니다.
    4. PBS로 침전물을 재현탁하고 -80 ° C에서 보관하십시오. 이 솔루션은 -80 °C에서 장기 안정성을 유지할 수 있습니다.

3. RBD-ST 준비

  1. 아래 단계에 따라 RBD-ST 형질감염을 수행합니다.
    1. 적절한 진핵생물 발현 시스템 (예를 들어, HEK293F)을 선택하고, 회수 후 세포를 37°C에서 130 rpm으로 밤새 배양한다.
    2. 20μL의 HEK293F 세포 용액을 자동 세포 카운터( 재료 표 참조)에 추가하고 세포 수를 기록하고 농도를 1 x 106 cells/mL로 조정한 다음 37°C에서 130rpm으로 4시간 동안 세포를 배양합니다.
    3. 0.22 μm 멤브레인 필터를 통해 RBD-ST 플라스미드를 여과하고, 최종 부피가 10 mL가 될 때까지 300 μg의 플라스미드를 세포 배양 배지 ( 재료 표 참조)에 첨가하고; 10 초 동안 흔들어주십시오.
    4. PEI(1mg/mL, 재료 표 참조)를 수조에서 65°C로 가열하고 PEI 0.7mL와 세포 배양 배지 9.3mL를 혼합한 다음 간헐적으로 10초 동안 흔듭니다.
      알림: 용액을 세게 흔들지 마십시오. 그렇지 않으면, 생성된 기포가 형질감염 효율에 영향을 미칠 수 있다.
    5. PEI 용액에 플라스미드 용액을 넣고 혼합물을 10초 동안 간헐적으로 흔든 다음 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
    6. 혼합물을 세포 배양 배지 280 mL에 첨가하고 37°C에서 130 rpm으로 5일 동안 배양하였다.
  2. RBD-ST 정제를 수행하십시오.
    1. 세포를 25°C에서 6,000 x g 에서 20분 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 상청액을 수집한다.
    2. 컬럼에 2mL의 Ni-NTA 아가로스( 재료 표 참조)를 채우고 3x PBS로 3x 세척합니다.
    3. 이미다졸( 재료 표 참조)을 세포 상청액에 첨가하여 최종 농도가 20mM이 되도록 하고 세포 상청액을 2x 로드합니다.
    4. 세척을 위해 20 mM의 이미다졸을 함유하는 PBS의 3 컬럼 부피 (CV)를 첨가하고, 세척 분획을 수집한다.
    5. 저농도 내지 고농도(예를 들어, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M)의 이미다졸을 함유하는 3 CV의 PBS로 구배 용리; 각 농도에 대해 2x 용리합니다.
    6. SDS-PAGE21 을 사용하여 다양한 농도 구배에서 RBD-ST를 식별합니다.

4. OMV-RBD 생체접합 및 정제

  1. BCA 방법으로 단백질 농도를 결정하십시오 ( 재료 표 참조).
    1. 표준 BSA 단백질 용액을 2 mg/mL에서 0.0625 mg/mL로 연속 희석하고, 정제된 OMV-SC 및 RBD-ST 10x를 희석한 다음, BCA 작업 용액 A와 B(분석 키트에 제공됨)를 50:1(v/v)의 비율로 혼합합니다.
    2. 희석 된 단백질 용액 (25 μL / 웰)을 첨가하고 BCA 작업 용액 (200 μL / 웰)과 혼합한다. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    3. 각 웰의 562 nm에서 흡광도(OD)를 측정하고 표준곡선22로부터 단백질 농도를 계산한다.
  2. 아래 단계에 따라 OMV-SC 및 RBD-ST의 생체접합을 수행합니다.
    1. PBS에서 OMV-SC와 RBD-ST를 40:1(w/w) 비율로 혼합합니다.
    2. 혼합물을 수직으로 회전시켜 4°C에서 15rpm으로 밤새 블렌딩한다.
      알림: 다른 항원은 다른 비율로 반응 할 수 있습니다. 항원의 특성에 따라 다른 반응 비율을 시도할 수 있습니다.
  3. 반응 효율을 확인합니다.
    1. 10 μL의 OMV-SC, RBD-ST 및 반응 생성물을 준비한다(단계 4.2). 2.5μL의 5x 로딩 버퍼( 재료 표 참조)를 추가하고 샘플을 100°C에서 5분 동안 가열합니다. 샘플을 겔에 넣습니다(10μL/웰). 60V에서 20 분 동안 전기 영동을 수행하고 1 시간 동안 조건을 120V로 변경하십시오.
    2. 단백질을 겔에서 PVDF 웨스턴 블로팅 멤브레인( 재료 표 참조)으로 100V에서 70분 동안 옮깁니다.
    3. 멤브레인을 5% 무지방 분유/TBST에 넣고 1시간 동안 흔듭니다. 그런 다음 흔들면서 세척 당 5 분 동안 TBST로 3 회 세척하십시오.
    4. 멤브레인을 0.1% His-Tag 항체/TBST( 재료 표 참조)에 넣고 1시간 동안 흔든 다음 흔들면서 세척당 5분 동안 TBST로 3회 세척합니다.
    5. 멤브레인을 0.02% 항-마우스 IgG1 항체(HRP)/TBST( 재료 표 참조)에 넣고 40분 동안 흔든 다음 흔들면서 세척당 5분 동안 TBST로 3회 세척합니다.
    6. 강화 된 화학 발광 용액 ( 재료 표 참조)을 추가하고 멤브레인을 노출시킵니다.
  4. OMV-RBD의 정제를 수행합니다.
    1. 반응된 OMV-RBD 용액 1 mL를 10 mL로 희석하고, 희석물을 4°C에서 150,000 x g 에서 2시간 동안 원심분리한다.
    2. 피펫을 사용하여 상청액을 버리고 10mL의 PBS로 잔류물을 현탁합니다. 현탁액을 4°C에서 150,000 x g 에서 2시간 동안 원심분리합니다.
    3. 상청액을 버리고 잔류물을 1mL의 PBS로 현탁시킨다.
      참고: 항원의 용해도가 훨씬 낮으면, 크기-배제 크로마토그래피(19)에 의해 동일한 분리 효과가 달성될 수 있다.

5. 특성화

  1. 동적 광산란(DLS)을 수행합니다.
    1. 샘플을 100μg/mL 농도로 희석하고 샘플 셀에 샘플 1mL를 추가합니다.
    2. "측정 유형"에 대해 "크기", "샘플 재료"에 "단백질", "분산제"에 "물", "온도"에 "25 ° C"를 선택한 다음 샘플을로드하고 자동으로23을 측정합니다.
  2. 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 이미지를 캡처합니다.
    1. 샘플을 100μg/mL로 희석합니다. 200 메쉬 구리 그리드를 가져 와서 20 μL의 샘플을 추가하고 10 분 동안 흡수되도록합니다.
    2. 여과지를 사용하여 용액을 닦아내고 20μL의 3% 우라닐 아세테이트를 지지 필름에 넣고 30초 동안 염색합니다.
    3. 우라닐 아세테이트를 제거하고 실온에서 1시간 동안 필름을 자연 건조시킵니다.
    4. 샘플을 TEM 시스템( 재료 표 참조)에 로드하고 80kV에서 이미지를 캡처합니다.

결과

이 프로토콜의 순서도는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜은 OMV를 백신 플랫폼으로 활용하는 일반적인 접근 방식일 수 있습니다. 항원의 유형에 따라 적절한 발현 시스템을 선택하기 만하면됩니다.

도 2는 실현 가능한 플라스미드 설계 스킴을 제공한다. SC 유전자는 유연한 링커를 통해 ClyA 유전자와 연결되고, ST는 정제 및 검증...

토론

"플러그 앤 디스플레이" 나노입자 백신 플랫폼을 만들기 위해 SC 융합 ClyA는 단백질 발현24의 장점으로 인해 재조합 단백질 생산에 가장 널리 사용되는 모델 중 하나인 BL21(DE3) 균주에서 발현되어 박테리아 증식 과정에서 OMV 표면에 충분한 SC 단편이 표시됩니다. 동시에, 항원과 OMV 사이의 화학적 결합을 위해 ST-융합 표적 항원을 제조하였다. 이 실험 계획의 장점과 향후 적용 전망?...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 충칭 자연 과학 재단의 핵심 프로그램 (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) 및 중국 국립 자연 과학 재단 프로젝트 (No. 31670936, 82041045).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin sodiumSangon BiotechA610028
Automated cell counterCountstarBioTech
BCA protein quantification Kitcwbiocw0014s
ChemiDoc Touching Imaging SystemBio-rad
Danamic Light ScatteringMalvernZetasizer Nano S90
Electrophoresis apparatusCavoyPower BV
EZ-Buffers H 10X TBST BufferSangon BiotechC520009
Goat pAb to mouse IgG1Abcamab97240
High speed freezing centrifugeBioridgeH2500R
His-Tag mouse mAbCell signaling technology2366s
ImidazoleSangon BiotechA600277
Isopropyl beta-D-thiogalactopyranosideSangon BiotechA600118
Ni-NTA His-Bind SuperflowQiagen70691
Non-fat powdered milkSangon BiotechA600669
OPM-293 cell culture mediumOpm biosciences81075-001
pcDNA3.1 RBD-ST plasmidWuhan genecreat biological techenology
Phosphate buffer salineZSGB-bioZLI-9061
Polyethylenimine LinearPolysciences23966-1
Prestained protein ladderThermo26616
pThioHisA ClyA-SC plasmidWuhan genecreat biological techenology
PVDF Western Blotting MembranesRoche03010040001
Quixstand benchtop systems (100 kD hollow fiber column)GE healthcare
SDS-PAGE loading buffer (5x)BeyotimeP0015
Sodium chlorideSangon BiotechA100241
Supersignal west pico PLUS (enhanced chemiluminescence solution)Thermo34577
Suspension instrumentLife TechnologyHula Mixer
Transmission Electron MicroscopeHitachiHT7800
TryptoneOxoidLP0042B
UltracentrifugeBeckman coulterXPN-100
Ultraviolet spectrophotometerHitachiU-3900
Yeast extractSangon BiotechA610961

참고문헌

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