디지털 액적 PCR을 사용한 원형 RNA의 정량화

요약

이 프로토콜은 발산 프라이머를 사용하여 세포에서 원형 RNA(circRNA) 수준을 정밀하게 정량하기 위한 디지털 액적 PCR(dd-PCR)의 자세한 방법을 설명합니다.

초록

디지털 액적 중합효소 연쇄 반응(dd-PCR)은 가장 민감한 정량화 방법 중 하나입니다. 반응을 거의 20,000개의 유중수 방울로 분획하고 개별 액적에서 PCR이 발생합니다. dd-PCR은 기존의 실시간 qPCR에 비해 낮은 존재비 표적 검출의 정확도 향상, 정량화를 위한 참조 유전자 생략, 샘플에 대한 기술 복제 제거, 샘플의 억제제에 대한 높은 복원력 표시 등 몇 가지 장점이 있습니다. 최근 dd-PCR은 유전자 발현 분석 및 진단을 위해 표적 DNA 또는 RNA를 정확하게 정량화하는 가장 보편적 인 방법 중 하나가되었습니다. 원형 RNA(circRNA)는 5' 및 3' 말단이 없는 최근에 발견된 공유 결합 폐쇄 RNA 분자의 대가족입니다. 그들은 RNA 결합 단백질과 마이크로 RNA의 스폰지 역할을하여 유전자 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다. 또한 circRNA는 체액으로 분비되며 엑소뉴클레아제에 대한 내성으로 인해 질병 진단을 위한 바이오마커 역할을 합니다. 이 기사는 발산 프라이머 설계, RNA 추출, cDNA 합성 및 dd-PCR 분석을 수행하여 세포의 특정 원형 RNA(circRNA) 수준을 정확하게 정량화하는 방법을 보여주는 것을 목표로 합니다. 결론적으로, 우리는 dd-PCR을 사용하여 circRNA의 정확한 정량화를 입증합니다.

서문

RNA 시퀀싱 기술과 새로운 계산 알고리즘의 최근 발전은 원형 RNA(circRNA⁾¹라고 하는 성장하는 비코딩 RNA 계열의 새로운 구성원을 발견했습니다. 이름에서 알 수 있듯이 circRNA는 자유 끝이 없는 단일 가닥 RNA 분자 계열입니다. 이들은 백스플라이싱이라고 하는 비표준 헤드-투-테일 스플라이싱에 의해 형성되며, 여기서 상류 스플라이스 수용체 부위는 다운스트림 스플라이스 공여체 부위와 공유적으로 결합하여 안정적인 RNA 원 ^1,2를 형성합니다. 이 과정은 순환된 엑손의 상류 및 하류에 존재하는 거꾸로 된 Alu 반복 요소를 포함한 여러 요인에 의해 매개되거나 일부 스플라이싱 인자 또는 RNA 결합 단백질(RBP^)2,3에 의해 매개될 수 있습니다. 엑소닉 또는 인트론 서열에서만 생성된 원형 RNA는 엑소닉 circRNA 및 원형 인트론 RNA 또는 ci-RNA로 분류되는 반면, 일부 엑소닉 circRNA는 인트론을 유지하며 엑손-인트론 circRNA(EIcircRNA)라고 합니다.^3,4. circRNA의 기능은 스폰지 miRNA 및/또는 RBP, 전사 조절 및 펩티드 3,5,6,7로 번역하여 세포 기능을 조절하는 것을 포함하여 다면적입니다. 여러 보고서에서 다양한 질병 및 생리적 과정에서 circRNA의 중요성을 강조했습니다⁸. 또한, 조직 특이적 발현 패턴 및 엑소뉴클레아제 소화에 대한 내성은 질병 진단을 위한 기능적 바이오마커가 되며 적절한^{치료 표적으로도} 사용될 수 있다8. 건강과 질병을 조절하는 데있어 그 중요성을 고려할 때, circRNA 발현의 정확한 정량화는 시간의 필요성입니다.

생물학적^샘플에서 circRNA를 정량화하기 위해 여러 생화학적 방법이 개발되었습니다9. circRNA 정량화에 가장 편리하고 널리 사용되는 방법 중 하나는 역전사 후 발산 프라이머 쌍¹⁰을 사용하는 정량적 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)입니다. 그러나 대부분의 circRNA는 선형 mRNA에 비해 존재량이 적기 때문에 정량화하기가 어렵습니다¹¹. 이 문제를 극복하기 위해 우리는 디지털 액적 PCR (dd-PCR)을 사용하여 주어진 샘플에서 circRNA의 수를 정확하게 정량화하고자했습니다. dd-PCR은 미세 유체 원리를 따르는 고급 PCR 기술입니다. 오일에 여러 개의 수성 방울을 생성하고 PCR은 개별 반응⁽¹²)으로서 각 액적에서 발생합니다. 반응은 개별 액적에서 발생하고 액적 판독기를 사용하여 분석되며, 이는 관심 유전자¹²에 대한 양성 또는 음성 액적의 수를 제공합니다. 주어진 샘플에 단 하나의 사본만 있는 경우에도 관심 유전자를 정확하게 정량화하는 가장 민감한 기술입니다. 억제제에 대한 민감도 감소, 정밀도 향상 및 정량화를 위한 참조 유전자 생략은 기존 qPCR^13,14,15보다 유리합니다. 관심 유전자의 절대 정량화를위한 연구 및 진단 도구로 널리 사용되었습니다^16,17. 여기에서는 발산 프라이머를 사용하여 마우스 C2C12 근관을 분화하고 마우스 C2C12 근아세포를 증식시키는 데 있어 circRNA 정량화를 위한 상세한 dd-PCR 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

RNA는 RNase에 민감합니다. 따라서 모든 시약, 기기 및 작업 공간은 RNase가 없어야 하며 주의해서 취급해야 합니다.

1. circRNA에 대한 발산 프라이머 설계(그림 1 참조)

1. BEDTools를 사용하여 circRNA 주석 데이터에서 또는 UCSC 게놈 브라우저에서 백스플라이스 접합 좌표^18,19 사이에 존재하는 엑손/인트론 서열을 결합하여 성숙 서열을 검색합니다.
2. 전체 circRNA 서열 길이의 마지막 100개 뉴클레오티드를 circRNA 서열 10의 처음 100개 뉴클레오티드에 결합시켜²⁰⁰개 뉴클레오티드 길이의 PCR 주형 서열을 제조한다.
   참고 : circRNA 길이가 200 뉴클레오티드 미만이면 두 개의 동일한 반으로 나누고 후반부부터 전반부 초까지 뉴클레오티드를 결합합니다.
3. Primer3 웹 도구를 사용하고 길이²⁰에서 120-180 뉴클레오티드 범위의 PCR 산물 길이를 설정하여 프라이머 설계에 위의 템플릿 서열을 사용합니다.
4. Primer3의 기본 설정을 Tm 및 프라이머 길이와 같은 다른 매개변수에 사용합니다. circBnc2에 대한 프라이머 서열은 표 1에 열거되어 있다.
5. 합성을 위한 발산 프라이머 서열을 모든 올리고 합성 회사로부터 주문하십시오.

2. RNA 분리

참고: 시판되는 키트 또는 사내 RNA 분리 방법을 사용하여 마우스 C2C12 세포에서 총 RNA를 분리합니다. 여기에 사용된 사내 RNA 분리 방법은 앞서 설명하였다²¹. 자성 실리카 비드는 이전에 공개된 프로토콜⁽²²)을 사용하여 실험실에서 제조된다. 이러한 마그네틱 비드는 다양한 공급업체에서도 조달할 수 있습니다.

1. RNA 분리를 위해 약 5 x 10⁶ 개의 증식하는 C2C12 근원세포 세포와 4일 분화된 C2C12 myotube 1개가 들어 있는 10cm 접시 1개를 가져갑니다.
2. 세포를 10mL의 1x PBS로 3회 세척하고 피펫을 사용하여 PBS를 버립니다.
3. 세포 스크레이퍼를 사용하여 1mL의 1x PBS에서 세포를 긁어내고 4°C에서 750 x g에서 5분 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 PBS를 버립니다.
4. RNA 분리 시약(RIR) 1mL를 추가하고 격렬한 피펫팅으로 세포를 용해시킵니다²¹.
5. 200 μL (RIR 부피의 1/5)의 클로로포름과 15 초 동안 와류를 추가합니다. 튜브를 4°C에서 12,000 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.
6. 상부 수층 400μL를 취하여 실리카 컬럼에 담고 실온에서 12,000 x g 에서 1분간 원심분리한다. 플로우 스루를 새 튜브로 가져와 600 μL의 100 % 에탄올을 첨가하십시오.
7. 20μL의 자성 실리카 비드를 추가하고 튜브를 25°C 및 1,200rpm으로 설정된 열혼합기에 5분 동안 놓습니다.
   참고: 비드 부피는 용해를 위해 취해진 초기 세포 수에 따라 증가하거나 감소될 수 있습니다. 마그네틱 실리카 비드는 상업 공급 업체에서 조달 할 수 있습니다.
8. 튜브를 마그네틱 스탠드에 30초 동안 또는 용액이 투명해질 때까지 놓습니다. 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오.
9. 자성 실리카 비드를 90% 에탄올을 함유하는 500μL의 세척 완충액에 재현탁시킨다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 30초 동안 놓습니다. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 두 번 돌려 구슬을 씻습니다. 비드가 자석 쪽으로 가라앉도록 하고 피펫을 사용하여 버퍼를 버립니다.
10. 2.9단계를 두 번 반복합니다. 세척 후 튜브를 짧게 돌리고 마그네틱 스탠드에 30초 동안 다시 놓습니다. 남은 세척액을 폐기하십시오. 튜브를 50°C에서 3분 동안 열믹서에서 자연 건조하여 뚜껑을 열어 둡니다.
11. 뉴클레아제가 없는 물 20μL를 추가하고 비드를 재현탁합니다.
    참고: RNA 용리 부피를 10μL까지 줄여 RNA 농도를 확장할 수 있습니다.
12. 튜브를 실온에서 2-3분 동안 두십시오. 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 30초 동안 그대로 두십시오. 분광 광도계를 사용하여 양 및 품질 평가를 위해 용해 된 RNA를 새 튜브에 수집합니다.
    참고: RNA는 장기 보관을 위해 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 최적의 결과를 얻으려면 다음날 cDNA 합성 단계를 진행하는 것이 좋습니다.

3. cDNA 합성

1. 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정하고 cDNA 합성을 위해 RNA 1μg을 취합니다.
2. 1μg의 총 RNA와 1μL의 dNTP 믹스(dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP의 각 10mM), 4μL의 5x 역전사효소(RT) 버퍼, 2μL의 10x RT 랜덤 프라이머, 0.25μL의 역전사효소효소(200U/μL) 및 0.5μL의 RNase 억제제(40U/μL)를 혼합하고 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 최대 20μL의 부피를 구성합니다.
   참고: 역전사효소 부피는 cDNA 합성을 위해 취한 초기 RNA 농도에 따라 변경될 수 있습니다.
3. 튜브를 탭하여 반응을 혼합하고 짧게 회전합니다. 튜브를 25 ° C에서 10 분 동안 놓은 다음 50 ° C에서 1 시간 동안 놓습니다.
4. 효소를 비활성화하려면 튜브를 85°C에 5분 동안 두십시오.
5. 튜브를 2분 동안 얼음으로 식히고 튜브에 뉴클레아제가 없는 물 480μL를 추가하여 cDNA 농도를 2ng/μL로 만듭니다.
   참고: cDNA는 -20°C에서 보관하거나 dd-PCR 분석에 즉시 사용할 수 있습니다.

4. 디지털 액적 PCR (dd-PCR) 워크 플로우

참고: dd-PCR의 워크플로우에는 샘플 준비부터 시작하여 액적 생성, PCR 증폭, 액적 계수 및 데이터 분석이 이어지는 여러 단계가 포함됩니다. dd-PCR은 제품의 절대 정량화를 포함하고 표준 곡선이 필요하지 않으므로 각 단계는 정확한 데이터 생성에 중요합니다. 따라서, dd-PCR의 각각의 상이한 단계가 이하에 설명되었다.

1. 상기 dd-PCR 반응물의 제조.
   1. 음성 제어 튜브 및 NTC(비템플릿 제어) 튜브와 함께 0.2mL PCR 튜브 또는 스트립에 22μL의 PCR 반응을 설정합니다.
      참고: 서로 다른 circRNA의 검출을 위한 각각의 서로 다른 발산 프라이머 쌍은 테스트 샘플과 함께 NTC 반응을 가져야 합니다.
   2. 11μL의 dd-PCR 마스터 믹스(예: 에바그린 슈퍼믹스)와 11μL의 뉴클레아제가 없는 물을 추가하여 음성 대조군 반응 튜브를 설정합니다.
      알림: dd-PCR 마스터 믹스를 실온에서 해동한 다음 짧은 와동을 일으켜 균일한 혼합물을 만듭니다. 동일한 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 cDNA 희석에 사용된 음성 대조군 반응 튜브와 NTC 튜브를 설정합니다.
   3. 11μL의 dd-PCR 마스터 믹스, 5.5μL 1μM 농도의 circRNA 특이적 정방향 및 역방향 프라이머 믹스, 5.5μL의 뉴클레아제가 없는 물을 추가하여 NTC 반응 튜브를 설정합니다.
      참고: 100 μM 스톡의 정방향 및 역방향 원형 RNA 특이적 발산 프라이머를 희석하고 혼합하여 1 μM 작동 농도의 정방향 및 역방향 circRNA 프라이머 믹스를 제조하고; 따라서, 최종 프라이머 농도는 22 μL 반응에서 250 nM이다.
   4. 11μL의 dd-PCR 마스터 믹스, 5.5μL의 circRNA 특이적 1μM 농도의 정방향 및 역방향 프라이머 믹스, 5.5μL의 cDNA(2ng/μL)를 추가하여 테스트 반응 튜브를 설정합니다.
   5. 와류는 완전히 이어 모든 반응 튜브를 간단히 원심분리하여 튜브 바닥에서 균일한 반응 혼합물을 얻습니다.
2. 액적 생성.
   1. 20 μL의 PCR 혼합물을 0.2 mL PCR 튜브에서 액적 발생기 카트리지의 샘플 웰로 옮깁니다.
   2. 다중 채널 피펫을 사용하여 액적 발생기 카트리지의 유정에 70μL의 액적 생성 오일을 조심스럽게 추가합니다.
      알림: 사용하기 전에 액적 생성 오일을 실온에서 15분 동안 배양하십시오.
   3. 물방울 발생기 카트리지를 고무 개스킷으로 덮고 액적 발생기 기계에 넣어 카트리지의 액적 우물에서 생성된 샘플-오일 액적 혼합물을 얻습니다.
3. PCR 증폭.
   1. 다중 채널 피펫을 사용하여 40μL의 샘플-오일 액적 혼합물을 액적 발생기 카트리지의 액적 웰에서 96웰 PCR 플레이트로 옮깁니다.
      알림: dd-PCR 96-웰 플레이트로 옮기는 동안 액적이 깨지지 않도록 다중 채널 피펫의 팁을 통해 웰과 각도를 이루면서 샘플-오일 액적 혼합물을 조심스럽게 옮깁니다.
   2. 알루미늄 호일 실러로 96웰 PCR 플레이트를 밀봉하고 80°C로 예열된 플레이트 실러 기계 블록에 넣고 PCR 플레이트를 밀봉하기 위한 씰을 클릭합니다.
   3. 이제 플레이트를 dd-PCR 열 순환기에 놓고 뚜껑 온도를 105°C로 설정하고 램프 속도를 2°C/s로 설정하여 표 2 에 언급된 대로 프로그램을 설정합니다.
4. 물방울 계산.
   1. PCR이 끝나면 플레이트 홀더가 액적을 계수하기 위한 올바른 위치에 있는 상태에서 플레이트를 dd-PCR 액적 카운터 기계에 놓습니다.
   2. 액적 분석 소프트웨어를 열고 샘플 정보에 대한 입력을 제공하여 실행을 설정합니다.
   3. 설정 옵션을 클릭하십시오. 그런 다음 템플릿 옵션을 클릭하여 새 템플릿을 엽니다.
   4. 시료명(cDNA 사용 또는 음성대조군 또는 NTC), 표적명(circRNA 프라이머명) 및 유형(불명), 실험유형(ABS(절대정량) 및 슈퍼믹스(dd-PCR 에바그린 슈퍼믹스) 등 실험의 세부 사항을 넣어 각 웰을 정의합니다.
   5. 마지막으로 템플릿을 저장하고 실행 옵션을 클릭하여 실행을 시작하고 행 또는 열별로 계산을 선택합니다. 기계가 액적 계수를 완료하도록 허용하며, 이는 약 1분/웰이 소요됩니다.
   6. 분석 버튼을 클릭하여 액적 판독 완료 후 데이터를 분석 합니다.
   7. 1D 진폭 버튼을 클릭하여 양수 및 음수 방울을 확인합니다.
   8. 음의 물방울에서 양성 방울을 분리하려면 동일한 표적을 가진 모든 샘플에 대해 공통 임계 선을 설정하십시오.
      참고: 각 샘플의 총 방울은 절대 정량화를 위해 10,000 이상이어야 합니다. NTC는 양의 액적 수를 나타내지 않아야 합니다. NTC에서 양성 액적의 존재는 시약의 오염 또는 프라이머 이량 체의 증폭을 나타냅니다. 양성 방울이 NTC에 프라이머 이량 체 또는 비특이적 생성물을 가지고 있는지 여부를 알아내는 것은 어렵습니다. 프라이머를 확인하고 dd-PCR을 포함한 모든 PCR에 대한 일반적인 관행으로 시약의 오염을 피하는 것이 좋습니다.
   9. 내보내기 버튼을 클릭하여 circRNA 카운트 데이터를 .csv 파일로 내보냅니다. 내보낸 데이터는 각 샘플에 존재하는 circRNA의 수를 보여줍니다.
   10. 각 반응에 사용된 cDNA의 총량을 고려하여 RNA 나노그램당 각 샘플의 circRNA 수를 수동으로 계산합니다.

결과

각 샘플에서 circRNA의 절대 수는 내보낸 dd-PCR 데이터로부터 유도할 수 있다. 실시간 정량 PCR 분석은 분화된 C2C12 근관에서 circBnc2 의 차등 발현을 제안했습니다(데이터는 나타내지 않음). 여기에서, 우리는 증식하는 C2C12 근원 세포 및 근관에서 circBnc2 의 절대 복제 수를 확인하고 싶었습니다. circBnc2 의 발현은 두 가지 조건에서 비교되기 때문에 동일한 시약과 절차를 사용하여 RNA ...

토론

CircRNA 연구는 지난 10년 동안 고처리량 시퀀싱 기술의 발견으로 성장했습니다. 결과적으로, 그것은 미래의 RNA 치료제를위한 잠재적 인 분자로 간주되었습니다. 또한, 암 및 심혈관 질환 ^4,8을 비롯한 여러 질환에서 바이오마커로 작용하는 것으로 알려져 있다. 그러나 circRNA의 식별은 존재도가 낮고 모 mRNA⁹와 구별되는 특정 백스플라이스...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentifuge tube	Tarson	500010
0.2 ml tube strips with cap	Tarson	610020, 510073
Filter Tips	Tarson	528104
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977023
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Cell scrapper	HiMedia	TCP223
Chloroform	SRL	96764
DNA diluent	HiMedia	MB228
Random primers	Thermo Fisher Scientific	48190011
dNTP set	Thermo Fisher Scientific	R0181
Murine RNase inhibitor	NEB	M0314S
Maxima reverse transcriptase	Thermo Fisher Scientific	EP0743
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix	Bio-Rad	1864033
Droplet generation oil for Evagreen	Bio-Rad	1864006
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio-Rad	1814040
DG8 Cartridges and Gaskets	Bio-Rad	1864007
DG8 Cartridge holder	Bio-Rad	1863051
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad	12001925
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad	1814000
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad	1851197
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	1864003
Quantasoft Software	Bio-Rad	1864011
Silica column	Umbrella Life Science	38220090
UCSC Genome Browser		https://genome.ucsc.edu/
Primer 3		https://primer3.ut.ee/