간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포체의 농축 방법

요약

여기에서는 최적화된 차등 초원심분리 방법을 통해 간암 조직에서 유래한 작은 세포외 소포의 농축을 설명합니다.

초록

조직에서 유래한 작은 세포외 소포(sEV)는 소스 세포의 기능 상태와 조직의 간질 공간의 특성을 반영할 수 있습니다. 이러한 sEV의 효율적인 농축은 생물학적 기능 연구의 중요한 전제 조건이며 임상 검출 기술 및 치료용 운반체 기술 개발의 핵심입니다. sEV는 일반적으로 심하게 오염되어 있기 때문에 조직에서 분리하기가 어렵습니다. 이 연구는 간암 조직에서 고품질 sEV를 빠르게 농축하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 소화 효소(콜라게나제 D 및 DNase Ι)를 조직과 배양하고, 70μm 세포 여과기를 통한 여과, 차등 초원심분리, 0.22μm 멤브레인 필터를 통한 여과의 4단계 공정을 포함합니다. 차동 초원심분리 단계의 최적화와 여과 단계의 추가로 인해, 이 방법에 의해 얻어진 sEV의 순도는 고전적인 차동 초원심분리에 의해 달성된 것보다 더 높다. 조직 유래 sEV 연구를 위한 중요한 방법론과 지원 데이터를 제공합니다.

서문

작은 세포외 소포체(sEV)는 직경이 약 30nm에서 150nm이며 다양한 세포에서 분비된다¹. 그들은 지질, 단백질, DNA 및 RNA와 같은 중요한 생물학적 분자를 다양한 기관, 조직, 세포 및 세포 내 부분으로 운반하여 조직 세포와 통신하고 국소 또는 먼 미세 환경을 조절할 수 있습니다. 따라서, 그들은 또한 수신자 셀(^2,3)의 동작을 변경할 수 있다. 특정 sEV의 분리 및 정제는 질병의 발달 및 경과 동안 생물학적 거동을 연구하기 위한 필수 전제 조건입니다. 금본위제로 간주되는 차등 초원심분리는 일반적으로 sEV가 일반적으로 상주하는 조직에서 분리하는 데 사용됩니다⁴. 조직 파편, 세포 파편, 큰 소포 및 세포 사멸체는 이 기술로 제거할 수 있으며 sEV만 남습니다.

콜라게나제 D와 DNase I은 세포나 소포의 분자적 특성에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났으며, 두 효소의 특성은 세포외 기질에서 소포의 방출에 기여한다 ⁵. 이 효소는 인간 전이성 흑색종 조직, 결장암 조직 및 결장 점막 조직에서 sEV를 추출하는 데 사용되었습니다 ^5,6,7. 그러나 이러한 방법에서 콜라게나제 D와 DNase I의 농도와 소화 시간이 다르기 때문에 일관성 없는 결론이 도출됩니다. 다른 유형의 sEV가 공침되는 것을 피하기 위해, 연구자들은 여과 및/또는 차등 원심분리를 통해 더 큰 세포밖 소포(직경 0.1 μm 또는 0.2 μm)를 제거했다⁸. 근원 조직에 따라, 다른 분리 및 정제 방법이 요구될 수 있다 ^9,10.

전통적인 차등 초원심분리 방법을 사용하여 간 조직에서 sEV를 추출하면 상등액 표면에 백질층이 생성되지만 그 특성을 결정할 방법이 없습니다. 이전 연구¹¹에서 이 백질층은 sEV의 순도에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌습니다. 기존 방법으로 분리한 샘플의 입자 수와 단백질 농도는 현재 방법보다 높았지만 변동 계수가 컸는데, 이는 많은 오염 물질이 결과의 반복성을 저하시킬 수 있기 때문일 수 있습니다. 즉, 세제를 사용하여(즉, 1% Triton X-100에서 입자의 용해도를 검출), 이 방법으로 얻은 sEV의 순도가 더 크다는 것을 발견했습니다. 따라서 우리는 이 방법을 사용하여 단백체 연구를 위해 대장암 조직에서 파생된 sEV를 분리하고 정제합니다.

현재 간암에서 sEV에 대한 연구는 주로 혈청, 혈장 및 세포 배양의 상층액^12,13,14에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 간암 조직에서 유래한 sEV는 간암의 생리학적 병리 및 주변 미세 환경을 보다 정확하게 반영할 수 있으며 다른 EV의 분해 및 오염을 효과적으로 방지할 수 있습니다^15,16. 차등 초원심분리를 사용하여 이 방법은 수율을 높이고 고품질 sEV를 얻을 수 있어 간암에 대한 추가 연구를 위한 중요한 기반을 제공합니다. 이 방법은 간암 조직이 날카로운 분리에 의해 분리되고 콜라게나제 D와 DNase I에 의해 해리될 수 있도록 합니다. 그런 다음 세포 파편, 큰 소포 및 세포 사멸체는 여과 및 차등 초원심분리에 의해 추가로 제거됩니다. 마지막으로, sEV는 이후 연구를 위해 분리 및 정제됩니다.

프로토콜

인간 간암 조직은 간난 의과 대학 제 1 부속 병원에서 간암 진단을받은 환자로부터 수집되었습니다. 모든 환자는 정보에 입각한 동의서에 서명했으며 인체 조직 샘플 수집은 간난 의과대학 제1부속병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 장비 및 소프트웨어와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 준비

1. 인큐베이터에 전사 탈색 쉐이커를 넣고 온도를 37°C로 설정합니다. 필요한 다른 모든 장비에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.
2. 메스와 집게에 75% 알코올을 뿌려 청소하십시오.
3. 콜라게나제 D 6mg(4mg/mL)과 DNase Ι 24μL(80U/mL)를 측정하여 RPMI-1640 염기성 배지 1.5mL에 첨가하여 소화액을 준비합니다. 첨가제가 완전히 녹을 때까지 부드럽게 뒤집어 혼합하십시오.
4. 미리 70μm 및 0.22μm 세포 여과기를 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 적십니다.
5. 해동 후 간 조직을 고정하기 위해 아이스박스에 100mm 멸균 세포 배양 접시를 놓습니다.
6. 간세포 암종 조직 분리 후 15분 이내에 PBS로 조직 블록 표면의 혈액을 헹구고 조직을 멸균 냉동 튜브로 옮기고 실험이 끝날 때까지 -80°C에서 2주 이상 보관하지 않습니다.

2. 조직 해리

1. 조직 샘플을 -80°C 냉동고에서 꺼내고, 약 400 mg의 조직-2 mm x 2 mm 조각으로 절단-아이스박스 상의 10 cm 세포 배양 접시에 넣는다.
2. 조직을 1.5mL의 소화 용액이 있는 6웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 플레이트를 전이 탈색 쉐이커(20rpm/min)에 올려 놓고 간암 조직의 완전한 해리와 sEV의 방출을 위해 37°C에서 20분 동안 배양합니다.
3. 인큐베이터에서 6웰 플레이트를 꺼내 아이스박스에 놓습니다. 포스파타제 억제제 80μL와 완전 프로테아제 억제제 용액 200μL를 추가하여 소화를 중지합니다.
4. 소화액을 70μm 세포 여과기로 옮기고 천천히 여과하여 큰 조직 파편을 제거합니다. 여과액을 모아 2mL 원심분리기 튜브에 넣습니다.

3. 차동 초원심분리

알림: 4°C에서 모든 원심분리 단계를 수행합니다.

1. 여과액을 500 ×g 에서 10분 동안 원심분리하고 새로운 2mL 원심분리기 튜브에 상층액을 수집합니다. 그런 다음 대부분의 작은 조직 파편을 제거할 수 있습니다.
2. 상층액을 3,000 × g 에서 20 분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다. 피펫 끝이 표면의 흰색 물질에 닿을 때까지 상층액을 새 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
3. 남은 액체를 3,000 × g에서 3 분 동안 원심 분리합니다. 그런 다음 소포 수집을 용이하게 하기 위해 상층액을 흡인합니다. sEV의 순도를 보장하려면 백색 물질이 흡인되지 않는지 확인하십시오.
4. 수집된 상층액을 12,000× g 에서 20분 동안 원심분리하고 상층액 900μL를 4.7mL 초원심분리기 튜브로 옮깁니다. 남은 액체를 12,000× g 에서 3분 동안 원심분리한 다음 두 상층액을 수집하여 동일한 초원심분리기 튜브에 혼합합니다. 튜브를 PBS로 완전히 채웁니다.
5. 상층액을 100,000 × g 에서 60분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 초원심분리기 튜브에 PBS를 채우고 100,000× g 에서 60분 동안 다시 원심분리하여 펠릿을 재현탁합니다. 펠릿을 50μL의 PBS로 재현탁합니다.
6. 1mL 멸균 주사기를 사용하여 sEV 현탁액을 흡인하고 0.22μm 멤브레인 필터를 통해 여과합니다. 600μL 원심분리기 튜브에 여과액을 수집하고 추가 분석을 위해 -80°C에서 보관합니다.

4. 농축 품질 평가

1. 투과 전자 현미경으로 sEV의 형태를 관찰합니다.
   1. 그런 다음 sEV 샘플 10μL을 구리 그물에 떨어뜨리고 실온에서 10분 동안 배양한 다음 흡수지를 사용하여 멸균 증류수로 세척하여 과도한 액체를 제거합니다.
   2. 10 μL의 2 % 우라닐 아세테이트를 구리 그물에 떨어 뜨려 1 분 동안 음성 염색을합니다. 여과지를 사용하여 구리 그물 표면의 액체를 흡수하고 백열등 아래에서 2분 동안 건조시킵니다.
   3. 투과 전자 현미경으로 구리 메쉬를 관찰하고 80kV에서 이미지를 촬영합니다.
2. 나노입자 유세포분석기를 사용하여 sEV의 크기 분포와 순도를 결정합니다.
   1. 기계를 시작하기 전에 품질 관리 200μL, 실리카 나노구 200μL, 초순수 2 x 200μL, 세척액 2 x 200μL, PBS 200μL가 들어 있는 튜브를 준비합니다.
      참고: sEV 샘플을 테스트하기 전에 기기에 대한 품질 관리를 수행하고 입자 크기 표준을 테스트해야 합니다(크기 분포는 동일한 검출 조건에서 직경이 다른 여러 나노 미세 구체[68-155nm]로 생성된 표준 곡선을 사용하여 계산해야 함). QC 비드 및 실리카 나노스피어를 총 부피 200μL의 초순수로 100배 희석하였다.
   2. 세척액(>10mL)의 부피를 확인하고 외장액과 폐액(20-30cm)의 농도 차이를 확인합니다.
   3. 기기의 주 전원 공급 장치를 끕니다. 20초 후 컴퓨터를 켜고 소프트웨어를 실행하기 위해 기기가 제대로 연결되었음을 나타내는 신호음이 울릴 때까지 기다립니다.
   4. 시작을 클릭하여 카메라, 레이저 및 공기 펌프를 켭니다.
   5. Sheath Flow-Start Up을 클릭하고 로딩 플랫폼에 초순수를 놓습니다. 4분(기기 카운트다운) 후 Sample-Boosting | 샘플 언로드.
   6. 30초 후, 블랭크 튜브를 로딩 플랫폼에 놓고 Sample-Boosting | 샘플 언로드. 그런 다음 초순수를 담고 있는 튜브를 로딩 플랫폼에 놓고 동시에 Sample-Boosting | 피복 흐름 퍼지.
   7. Manual Operation(수동 작동)을 클릭하고 입자 농축 튜브를 로딩 플랫폼에 놓습니다. 그런 다음 1분 동안 Sample-Boosting을 클릭하고 동시에 "SAMP. Inf."
   8. Sample-Samp링을 클릭하고 SPCM을 클릭하여 감지기를 켭니다.
      알림: 이 시점에서 실시간 신호 파형을 볼 수 있습니다.
   9. 자동 S 를 클릭하십시오.amp링을 클릭하고 S에 1.0 을 입력합니다. amp링을 SET 하여 압력을 1KPa로 고정합니다. 도구 모음 에서 를 클릭하고 Large Signal을 선택합니다.
   10. 레이저의 수평 위치를 조정하고 레이저를 2μm로 설정합니다. 그런 다음 L 또는 R 을 클릭하여 신호가 강하고 균일한지 확인합니다.
   11. 기록 시간을 클릭하여 데이터를 수집하면 완료되면 자동으로 버퍼로 이동합니다. 그런 다음 데이터를 Naf 파일에 저장하고 Sample-Unload를 클릭합니다.
   12. 세척 용액 튜브를 로딩 플랫폼에 놓고 Sample-Boosting을 클릭하고 1분 후 Sample-Unload를 클릭합니다. 초순수를 사용하여 모세관 팁에 남아 있는 세척액을 제거합니다.
   13. 입자 크기의 표준 튜브를 로딩 플랫폼에 놓고 Sample-Boosting 을 1분 동안 클릭합니다.
   14. "SAMP . Inf"를 클릭하고 Sample-Sampling을 클릭합니다. 그런 다음 도구 모음 을 클릭하고 Small Signal을 선택합니다.
   15. 기록 시간을 클릭하여 데이터를 수집하면 완료되면 자동으로 버퍼로 이동합니다. 그런 다음 데이터를 Naf 파일에 저장하고 Sample-Unload를 클릭합니다.
   16. 세척 용액 튜브를 로딩 플랫폼에 놓고 Sample-Boosting을 클릭한 다음 1분 후 Sample-Unload 를 클릭합니다. 초순수를 사용하여 모세관 팁에 남아 있는 세척액을 제거합니다.
   17. 로딩 플랫폼에 PBS 튜브를 놓습니다. Sample-Boosting 을 1분 동안 클릭합니다.
   18. "SAMP . Inf"를 클릭하고 Sample-Sampling을 클릭합니다. 그런 다음 도구 모음 을 클릭하고 Small Signal을 선택합니다.
   19. 기록 시간을 클릭하여 데이터를 수집하면 완료되면 자동으로 버퍼로 이동합니다. 데이터를 Naf 파일에 저장하고 Sample-Unload를 클릭합니다.
   20. 세척 용액 튜브를 로딩 플랫폼에 놓고 1분 후 Sample-Boosting 및 Sample-Unload를 클릭합니다. 초순수를 사용하여 모세관 팁에 남아 있는 세척액을 제거합니다.
   21. 4.2.17-4.2.20 단계에서 설명한 대로 샘플 정보를 확인하십시오. PBS(단계 4.2.17)를 sEV 샘플로 변경하고 데이터를 분석합니다.
3. 웨스턴 블롯으로 sEV를 추가로 식별합니다.
   1. 제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 정량 키트를 사용하여 sEV 및 조직의 단백질 농도를 결정합니다.
   2. 이러한 정량적 결과를 기반으로 sEV의 로딩 부피(예: 웰당 단백질 5μg)를 계산합니다. 로딩 버퍼를 1:4 비율로 추가하고 혼합물을 소용돌이칩니다.
   3. 100°C 금속조(dry thermostat)에서 10분 동안 변성시킨 후, 60V에서 80분 동안 12% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 단백질을 분리하였다.
   4. 전달 완충액(25mM Tris, 192mM 글리신, 20% 메탄올)을 사용하여 2시간 동안 220mA에서 0.22μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인으로 겔을 옮깁니다.
   5. 실온에서 1시간 동안 Tris-buffered saline Tween(TBST)에 5% 탈지분유로 멤브레인을 차단하고 1차 항체(토끼 단클론 항-인간 CD9 항체, 토끼 단클론 항-인간 CD63 항체, 토끼 단클론 항-인간 TSG101 항체, 마우스 단일클론 항-인간 GM130 항체)와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 1 차 항체를 5 % 무 지방 우유에 1 : 1,000으로 희석하십시오.
   6. TBST로 3회 세척한 후 실온에서 1시간 동안 양 고추 냉이 과산화효소(HRP) 접합 2차 항체로 막을 배양합니다.
   7. ECL 블로팅 기질을 사용하여 HRP 결합 항체를 검출한 후 이미지를 수집 및 분석합니다.

결과

인간 간암 조직의 sEV는 간암 환자의 진단, 치료 및 예후에 중요한 역할을 했습니다. 이 방법은 일반적인 실험실 장비를 사용하여 간암 조직에서 파생된 sEV를 분리하고 정제했습니다. 이것은 sEV 연구에 대한 방법론적 지원을 제공할 수 있습니다. 그림 2는 간암 조직에서 sEV를 농축하는 일반적인 과정을 보여줍니다. 조직의 세포간 공간에 있는 sEV는 조직 절단과 효소 가수분해?...

토론

이 프로토콜은 간암 조직에서 sEV를 추출하는 반복 가능한 방법을 설명합니다. 고품질 sEV는 날카로운 조직 분리, 소화 효소 처리, 차등 초원심분리, 0.22μm 필터 멤브레인 여과 및 정제를 통해 얻을 수 있습니다. 다운스트림 분석의 경우 sEV의 고순도를 보장하는 것이 매우 중요합니다. 차등 원심 분리 과정에서 상청액 표면에 백색 물질 층 (알려지지 않은 조성)이 나타납니다. 이 층은 sEV를 오염시킬 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Membrane Filter Unit	Millex	SLGPR33RB
1 mL Sterile syringe	Hubei Xianming Medical Instrument Company	YL01329
2% Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400-2
4.7 mL Centrifuge Tube	Beckman Coulter	361621
6-well Cell cuture plate	LABSELECT	11110
50 mL Beaker	Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company	CF2100800
70 µm Cell strainer	Biosharp	BS-70-XBS
100 mm Cell culture dish	CELL TER	CS016-0128
600 µL Centrifuge tube	Axygen	MCT060C
BCA protein quantification kit	Thermo Fisher	RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL	Beckman	A95761
BioRad Mini trans-blot	Bio-Rad	1703930
BioRad Mini-Protean	Bio-Rad	1645050
CD63 Antibody	Abcam	ab134045
CD9 Antibody	Abcam	ab263019
Centrifuge 5430R	Eppendorf	5428HQ527333
Cleaning Solution	NanoFCM	C1801
Collagenase D	Roche	11088866001
Copper net	Henan Zhongjingkeyi Technology Company	DJZCM-15-N1
Dry Thermostat	Hangzhou allsheng instruments company	AS-01030-00
FITC Anti Human CD9 Antibody	Elabscience	E-AB-F1086C
Glycine	Solarbio	G8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody	Proteintech	SA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody	Proteintech	SA00001-2
Methanol	Shanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometer	NanoFCM INC	FNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP)	Roche	4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS)	Servicebio	G4202
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Solarbio	ISEQ00010
QC Beads	NanoFCM	QS2502
RPMI-1640 basic medium	Biological Industries	C11875500BT
Scalpel	Guangzhou Kehua Trading Company	NN-0623-1
Silica Nanospheres	NanoFCM	S16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8	Kylin-Bell	E0018
Transmission Electron Microscope	Thermo Scientific	Talos L120C
Tris	Solarbio	T8060
TSG101 Antibody	Proteintech	28283-1-AP
Tweezer	Guangzhou Lige Technology Company	LG01-105-4X