자기 공명 유도 고강도 집속 초음파 생성 온열요법: 쥐 횡문근육종 모델에서 실현 가능한 치료 방법

요약

여기에 제시된 프로토콜은 횡문근육종 마우스 모델에서 온도에 민감한 리포솜에서 약물 방출을 유발하기 위해 자기 공명 유도 고강도 집속 초음파에 의해 생성된 제어된 온열요법을 사용하는 프로토콜입니다.

초록

자기 공명 유도 고강도 집속 초음파(MRgHIFU)는 국소 온열요법을 생성하기 위해 확립된 방법입니다. 실시간 이미징 및 음향 에너지 변조를 감안할 때 이 방식을 통해 정의된 영역 내에서 정밀한 온도 제어가 가능합니다. 온열요법 생성과 같은 이 비침습적, 비이온화 기술을 사용하여 온도에 민감한 리포솜 운반체에서 약물을 방출하는 많은 열 응용 분야가 연구되고 있습니다. 이러한 약물에는 독소루비신과 같은 화학 요법이 포함될 수 있으며, 용량 제한 전신 부작용, 즉 심장 독성으로 인해 표적 방출이 필요합니다. 독소루비신은 다양한 악성 종양 치료의 주류이며 재발성 또는 재발성 횡문근육종(RMS)에 일반적으로 사용됩니다. RMS는 소아 및 젊은 성인에서 가장 흔한 고형 연조직 두개외 종양입니다. 공격적인 복합 요법에도 불구하고 RMS 생존율은 지난 30년 동안 동일하게 유지되었습니다. 이러한 미충족 수요를 해결하기 위한 솔루션을 탐색하기 위해 약물 방출을 위한 온열요법의 공급원으로 MRgHIFU를 사용하여 면역적격 동계 RMS 마우스 모델에서 온도민감성 리포솜 독소루비신(TLD)의 방출을 평가하기 위한 실험 프로토콜이 개발되었습니다.

서문

횡문근육종(RMS)은 소아와 젊은 성인에게 가장 흔하게 발생하는 골격근 종양이다¹. 국소 질환은 종종 화학 요법, 전리 방사선 및 수술을 포함한 복합 치료로 치료됩니다. 다제 화학요법의 사용은 소아 환자에서 더 많이 사용되며, 성인 환자에 비해 예후가 개선되었다². 그러나 지속적인 연구 노력에도 불구하고 5 년 생존율은 가장 공격적인 형태의 질병에서 약 30 %에 머물러 있습니다 ^3,4. 화학 요법 표준 치료는 빈크리스틴, 시클로포스파미드 및 악티노마이신 D를 포함하는 다제 요법입니다. 재발성 또는 재발성 질환의 경우 표준(유리) 독소루비신(FD) 및 이포스파미드¹을 포함한 대체 화학 요법이 사용됩니다. 이 모든 화학 요법은 전신 독성을 가지고 있지만, 독소루비신의 심장 독성은 평생 용량 제한 ^5-7을 부과합니다. 종양에 전달되는 약물의 양을 증가시키고 전신 독성을 최소화하기 위해, 리포솜 캡슐화를 포함하는 대체 제형이 개발되었다. 이들은 유방암 및 간세포 암종의 치료를 위해 승인된 비온민감성 독소루비신 또는 임상 시험이 진행 중인 온도감응성 독소루비신일 수 있다 8,9,10,11,12,13. 다발성 소포 리포솜 및 리간드 표적 리포솜과 같은 리포솜 캡슐화 약물을 전달하기 위한 대체 방법이 평가되었으며 종양 치료에 대한 가능성을 보여줍니다⁹. 이 연구에서, 열의 추가는 약물 방출을 포함한 다인성 영향을 미친다¹⁴. 자기공명유도 고강도 집속 초음파(MRgHIFU)와 온도민감성 리포솜 독소루비신(TLD)으로 생성된 온열요법(HT)의 조합은 용량 제한 독성을 최소화하고 종양에 대한 면역 반응을 잠재적으로 증가시키면서 RMS를 치료하기 위해 이 독성이 있지만 효과적인 약물을 사용하기 위한 새로운 복합 치료 접근법입니다.

독소루비신은 >39 °C의 온도에서 TLD에서 빠르게 방출되며, 이는 평균 인체 온도 37 °C보다 훨씬 높지만 조직 손상이나 절제를 유발할 만큼 높지는 않습니다. 이것은 43 °C에서 발생하기 시작하지만, 온도가 60 °C에 가까워질수록 더 빠르게 발생한다¹⁵. 생체 내에서 HT를 생성하기 위해 레이저, 마이크로파, 고주파 절제, 집속 초음파 등 다양한 방법이 사용되어 왔으며, 그 중 다수는 침습적 가열 방법이다¹⁶. MRgHIFU는 현장 표적 조직 내에서 정확한 온도 설정을 용이하게 하는 비침습적이고 비이온화 가열 방법입니다. 자기 공명(MR) 영상은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 치료 전반에 걸쳐 조직의 체온 측정을 계산할 수 있는 실시간 영상을 결정적으로 제공합니다. 이어서, 이 데이터는 원하는 온도 설정점(¹⁷)에 도달하고 유지하기 위해 실시간으로 초음파 요법을 제어하는데 사용될 수 있다. MRgHIFU는 다양한 조직 유형에서 테스트되었으며, 경미한 HT에서 절제에 이르기까지 광범위한 체온 치료에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 임상적으로 고통스러운 뼈 전이를 성공적으로 치료할 수 있다¹⁸. 또한, HT는 종양 미세환경 19,20,21,22에서 종양 세포독성을 유발하고, 단백질 발현을 조절하며^, 면역 반응을 변화시키는 것으로 나타났다. 한 연구에서는 시너지 효과가 있는 R1 쥐 모델²³에서 경미한 HT와 TLD를 결합한 후 MRgHIFU로 절제하여 종양 코어에 괴사를 일으키고 말초에 약물을 전달했습니다. 전통적으로 방사선 요법은 종양 세포를 손상시키고 국소 질병 재발을 줄이기 위한 보조 요법으로 사용되었습니다. 그러나 평생 투여 및 표적 이탈 손상으로 인해 사용이 제한됩니다¹. 따라서 HT는 동일한 독성이나 제한 없이 동일한 효과 중 일부를 일으킬 수 있다는 점에서 독특합니다.

RMS에 대한 전임상 동물 모델에는 면역저하 숙주에서 동유전자 면역적격 모델 및 환자 유래 이종이식(PDX)이 포함됩니다. 면역저하 모델은 인간 종양의 성장을 허용하지만, 적절한 종양 미세환경이 부족하고 면역 반응을 연구하는 능력에 한계가 있다²⁴. FGFR4 활성화 돌연변이는 불량한 예후에 대한 유망한 마커이며 성인 및 소아 RMS ^1,25에서 잠재적인 치료 표적입니다. 글래디(Gladdy) 연구실에서 개발된 동유전자 RMS 모델에서, 종양은 종양에 대한 선천성 및 적응성 면역 반응을 발달시키는 면역적격 숙주에서 성장할 수 있다²⁶. HT가 면역 반응에 영향을 미치기 때문에 쥐 면역 반응의 변화를 관찰하는 것이 이 종양 모델의 중요한 이점입니다. FD와 비교하여 TLD에 대한 종양 반응과 화학 요법 및 HT 모두에 대한 종양의 면역 반응의 변화를 모두 테스트하기 위해 MRgHIFU 및 TLD를 사용하여 생체 내에서 동계 쥐 RMS 종양을 치료하기 위한 프로토콜이 개발되고 채택되었으며, 이는 이 연구의 초점입니다.

프로토콜

연구는 표현유전체학 센터(TCP) 및 UHN(University Health Network) 동물 자원 센터(ARC) 동물 연구 시설의 감독 수의사 아래 승인된 동물 사용 프로토콜이 있는 동물 관리 위원회에 따라 수행되었습니다. 동물과 관련된 MRgHIFU를 제외한 모든 절차는 동물이 외부 공기 또는 감염되기 쉬운 감염에 대한 노출을 최소화하기 위해 생물학적 안전 캐비닛(BSC)에서 수행되었습니다.

1. 마우스 사육

참고: 총 65마리의 마우스(균주 B6.129S2-Trp53tm1Tyj/J)가 파일럿 연구에 포함되었습니다(수컷: n = 23; 암컷: n = 42). 수컷과 암컷 마우스 모두 7-9 주령에 사용되었다. 그들의 새끼는 젖을 떼고 유전자형을 분석했으며 p53 이형 접합 마우스를 실험에 사용했습니다.

1. 번식 케이지를 만들기 위해 각 수컷 마우스와 함께 두 마리의 암컷 마우스를 수용합니다. 태어날 때부터 새끼의 나이를 세십시오(출생 = 0일).
2. 10 일째에 귀 노치로 새끼를 식별하십시오. 세포주 주입 전에 유전형 분석을 위해 꼬리 절단을 수집합니다.

2. 마우스 유전형 분석

1. 제조업체의 지침에 따라 상업용 DNA 추출 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 수집된 2mm 꼬리 잘라낸 부분에서 DNA를 추출합니다.
2. 분광 광도계에서 260-280 nm의 흡광도를 측정하여 DNA 농도와 순도를 결정합니다 ( 재료 표 참조).
3. 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하십시오.
   1. 필요한 샘플 수에 대해 12.5:0.25:10.75(μL) 비율로 상용 PCR 믹스(Taq 중합효소, dNTP 및_MgCl2 포함, 재료 표 참조), 프라이머 및 dH2O를 포함하는 마스터 믹스를 만듭니다. 각 PCR 튜브에 1μL의 DNA 샘플을 추가하고 dH_2O, null 샘플(p53 돌연변이에 대해 동형접합성), 이형접합체 샘플(p53 돌연변이에 대해 이형접합체) 및 야생형(정상 p53에 대해 동형접합체) 샘플을 PCR 대조군으로 포함합니다.
   2. 마스터 믹스 24 μL를 DNA가 들어 있는 각 PCR 튜브에 추가합니다. 각 PCR 튜브의 용액을 위아래로 피펫팅하여 마스터 믹스 전체에 DNA를 분배합니다.
   3. 반응 튜브를 열 사이클러에 넣고 다음 사양에 따라 사이클한다: 95°C에서 2분, 95°C에서 15초, 60°C에서 15초, 및 72°C에서 1분 동안 40 사이클을 유지한 다음, 겔 상에서 분석할 준비가 될 때까지 4°C에서 유지한다.
4. 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 PCR 산물을 분석한다.
   1. TAE 중의 아가로스를 가열하고 용해될 때까지 혼합함으로써 2% 겔 (50 mL의 1x TAE 및 1 g의 아가로스)을 제조하였다. 냉각되고 여전히 액체일 때 2.5μL의 DNA 겔 염색을 아가로스에 첨가하고 혼합합니다. 빗으로 젤 상자에 젤을 던지십시오. 겔을 전기영동 장치( 재료 표 참조)에 넣고 1x TAE로 덮습니다.
   2. 겔에 10μL의 1kB DNA Ladder를 로드합니다. 각 샘플 12.5μL를 로드합니다. 135V에서 25분 동안 젤을 실행합니다.
   3. 제조업체의 지침에 따라 젤 이미저에서 사용된 DNA 겔 염색에 대한 적절한 설정을 사용하여 젤을 이미지화합니다( 재료 표 참조).

3. 종양 모델 준비(그림 1)

1. M25FV24C 세포주(계대 12-15)를 75 mL 플라스크에서, 37°C 및 5%_CO2에서 완전한 성장 배지(첨가제: 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 2 mM L-알라닐-L-글루타민 디펩티드를 함유한 Dulbecco's Modified Eagle Medium[DMEM])에서 주입일 1주 전에 성장시킨다. 세포가 ~80% 합류하면 배지를 흡인하고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 5mL로 세포를 1x 세척합니다.
   참고: M25FV24C는 소아 및 성인 RMS ^1,26에서 관찰되는 돌연변이 FGFR4^V550E를 과발현하도록 조작된 쥐 세포주입니다.
2. 0.25% 트립신 용액 0.5mL를 플레이트 측면에 첨가하여 세포를 들어 올리고 실온에서 2-3분 동안 용기를 배양합니다. 세포가 분리된 것처럼 보이면 실온에서 2.5mL의 완전한 성장 배지를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 10 μL 샘플 분취액을 사용하여 혈구계 및 트립판 블루 배제를 사용하여 생존 세포의 세포 농도를 결정합니다.
3. 주입을 위한 정확한 부피의 DPBS-현탁 세포를 준비하고 1.5mL 미세원심분리 튜브에 넣는다: 원심분리에 대한 부피 = (마우스의 수 × 마우스당 세포의 수)/(세포의 농도), 여기서 마우스의 수 = 주입될 마우스의 수 + 에러에 대한 10개의 여분의 마우스, 및 마우스당 세포의 수 = 10⁴.
4. 153 x g에서 5분 동안 원심분리기. 세포 펠렛을 적절한 부피(마우스당 10μL× 마우스수)의 묘-주입 완충액(F10 배지 + 0.5% FBS)에 재현탁하고 이 현탁액을 준비한 후 1시간 이내에 마우스를 주입합니다.

4. 근육세포 주입

참고: M25FV24C 세포는 생후 4주에서 6주 사이에 생쥐의 오른쪽 뒷다리에 주입됩니다. 4주에 주사하면 HT 분산을 위한 주변 조직이 적기 때문에 치료하기 더 어려울 수 있는 종양이 있는 작은 마우스가 생성됩니다. 6주가 될 때까지 기다리면 더 큰 마우스가 생성되어 종양을 더 쉽게 치료할 수 있습니다.

1. 흡인 전에 세포 현탁액을 여러 번 뒤집어 용액 내에서 세포가 고르게 분포되도록 돕습니다. 마이크로리터 주사기를 사용하여 10 μL(10⁴ 세포)를 흡인합니다( 재료 표 참조). 마우스를 긁습니다. 일단 제지되면 뒷다리를 뻗어 꼬리 허벅지 근육에 접근할 수 있습니다. 클리퍼를 사용하여 다리를 면도하고 70 % 에탄올로 닦으십시오.
2. M25FV24C 세포 현탁액(10μL, 10⁴ 세포)을 26s G 바늘이 있는 기밀 마이크로리터 주사기를 사용하여 4-6주령 마우스의 오른쪽 뒷다리 허벅지 근육에 주입합니다.
   알림: 바늘은 좌골 신경에 부딪히지 않도록 주의하면서 대퇴골과 평행하게 무릎을 향해 삽입해야 합니다. 뒷다리의 근육량이 작기 때문에 바늘의 끝 부분 (약 2mm) 만 삽입하십시오.
3. 꾸준한 동작으로 용액을 투여하십시오. 바늘을 제거하고 출혈이 발생하지 않는지 확인하십시오. 마우스를 두 번째 케이지로 되돌립니다.
4. 매일 동물을 평가하고 촉진을 통해 종양 성장에 대해 뒷다리를 모니터링하십시오. 직경 1.5cm를 초과하는 종양 크기, 종양 궤양 또는 질병의 전신 징후(모낭 발기, 구부정한 자세, 비활동 또는 음식이나 물 섭취 감소)와 같은 초기 종료점 중 하나라도 발생하면 이산화탄소를 사용하여 마우스를 안락사시킵니다.

5. MRI 스캔 스크리닝

1. 다음 매개변수에 따라 이소플루란을 사용하여 발을 쥐어짜는 움직임이 없는 수준까지 마우스를 마취합니다: 1.5LPM에서 4%로 챔버에서 유도한 다음 MRI 스캐너 썰매의 노즈 콘으로 옮기고 0.75LPM에서 1.5%-2%의 노즈 콘에서 이소플루란 유지 관리를 계속합니다. 호흡 모니터를 부착합니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용하십시오.
2. MRI 스캐너를 사용하여 마취된 마우스를 이미지화합니다( 재료 표 참조). T2 강조 이미지(획득 Ax_Screen, 표 1)에서 면내 치수와 종양이 그 안에 나타나는 축 슬라이스의 수를 기록해 둡니다. 초음파가 들어가는 허벅지의 대퇴골과 측면 표면을 기준으로 종양의 위치를 확인하십시오.
   참고: 종양은 반대쪽에서 비대칭인 근육 내의 고강도 덩어리로 나타납니다. 다중 치료에 적합한 시작 종양 크기는 급성 또는 생존 연구의 경우 2mm x 2mm x 2mm입니다. 훨씬 더 크면 종양이 3주 치료를 완료하기 전에 크기 종점에 도달하기 때문에 급성 연구에만 좋습니다. HIFU 치료에 대한 제외 기준은 다음과 같습니다: 대퇴골 주위를 감싸고, 대퇴골에 너무 가깝고, 마우스에서 너무 뒤쪽에 있고, 대퇴골 내측에, 직장에 너무 가깝습니다.
3. 스캐너에서 마우스를 제거하고 기준 무게를 구합니다. 전기 면도기로 마취 상태에서 마우스를 몸 중앙에서 발까지 면도합니다.
   참고: 이상적으로는 면도는 치료 1일 전에 하는 것이 이상적인데, 이는 마우스가 제모 크림이 더 효율적으로 작동할 수 있도록 그루밍을 수행할 수 있기 때문입니다.
4. 케이지의 한쪽 끝 아래에 있는 가열 패드를 사용하여 BSC에서 마우스를 복구합니다. 흉골 누운 자세를 회복하면 마우스를 케이지로 되돌립니다.

6. 실험: HIFU 처리일 동물제제

1. 소구경 HIFU( 재료 표 참조) 시스템을 준비하려면 발전기를 켜고 멤브레인이 변환기 아래로 확장될 때까지 변환기에 충분한 탈이온수를 채우되 마우스를 압축할 정도로 단단하지는 않습니다. 매체에서 용존 산소를 제거하기 위해 30분 동안 변환기 회로의 물을 탈기합니다.
2. 연관된 컴퓨터 시스템을 준비합니다.
   1. 제어 컴퓨터를 켜고 이더넷을 통해 HIFU 발생기에 연결되고 USB를 통해 열 프로브 디스플레이에 연결되어 있는지 확인합니다. 소프트웨어를 시작하고 홈을 클릭하여 마우스를 삽입하기 전에 변환기를 홈으로 이동합니다.
   2. 광섬유 열 프로브 보정: 기준 실내 온도를 가져오고 MRI 방의 온도 변화를 확인합니다. 자기장 강도로 인한 각 프로브의 온도 드리프트 크기에 유의하십시오. 스캐닝 중 온도 보정을 위해 드리프트 튜브 온도 프로브를 가돌리늄으로 채워진 유리관에 삽입하고 드리프트 튜브를 테이프로 고정합니다.
      알림: 기준 실내 온도(드리프트 튜브)는 소프트웨어의 GUI에서 온도 측정 매개변수로 수동으로 추가됩니다. 관심 영역(ROI)은 온도 드리프트를 감지하기 위해 MR 이미지의 드리프트 튜브 내에 설정되며 온도계 이미지를 자동으로 수정합니다.
   3. 주입할 약물을 1mL 주사기에 넣고 자동 전달 펌프에 넣습니다( 재료 표 참조). 자동 전달 펌프의 수동 전달 버튼을 눌러 약물이 라인을 완전히 채울 때까지 마우스의 꼬리 정맥 카테터에 연결될 라인을 프라이밍합니다.
   4. 열 램프를 사용하여 마취실로 옮기기 전에 케이지에 있는 마우스를 ~20분 동안 따뜻하게 합니다.
      참고: 예열은 혈관 확장을 촉진하며, 이는 마우스가 마취되자마자 발생하고 카테터 배치에 도움이 됩니다.
3. 이소플루란(유도: 1.5LPM에서 4%, 유지: 0.75LPM에서 1.5%-2%)으로 마우스를 마취하고 노즈콘으로 옮깁니다. 마취 상태에서 깜박임 반사의 부족으로 인한 손상을 방지하기 위해 각막 윤활제를 눈에 바르십시오.
4. 오른쪽 뒷다리 전체를 포함하여 면도 부위에 제모 크림을 바르고 제조업체의 제모 지침을 따르십시오.
   알림: 마우스를 열 l 아래에 놓으십시오.amp 마취 상태에서 제모하는 동안 체온 조절을 돕기 위해 BSC에 있는 동안.
5. 따뜻한 물로 탈모 크림을 씻어 낸 후 디지털 저울로 마우스의 무게를 측정하고 약물 투여를 기록합니다.
6. MRI 슬레드의 MRI 호환 노즈콘으로 마우스를 이동합니다. MRI를 준비하는 동안 마우스를 따뜻하게 유지하기 위해 마우스에 열 램프를 놓습니다. 썰매의 3D 프린팅 마우스 홀더 안에 종양이 없는 면이 아래로 향하고 종양 상부가 있는 측면 욕창 위치에 마우스를 놓습니다(보충 그림 1 및 그림 2). 종양의 적절한 위치를 확인하십시오(즉, 코일의 중앙에 수평 및 수직으로, 초음파 변환기에 의한 압축을 설명하기 위해 마우스 홀더의 가장자리 바로 위에 높이가 있음).
   참고: 필요한 경우 압축된 초음파 젤 패드 세그먼트를 잘라 마우스 아래에 놓고 홀더 바닥을 라이닝하고 종양을 홀더 상단까지 수평을 맞추는 두께로 만듭니다.
7. 관련되지 않은 다리를 종양 다리에서 멀리 밀어 넣거나 종양 다리를 구부린 상태에서 뻗습니다. 발이 종양 및 초음파 빔 경로의 근거리 또는 원거리에 있지 않은지 확인하십시오. 열 램프를 꼬리에서 15cm 떨어진 곳에 배치하여 꼬리 정맥에 카테터를 삽입할 수 있도록 따뜻하게 합니다.
8. 식도 온도 프로브를 삽입합니다.
   1. 식도 탐침을 코 콘에 끼우고 마우스의 목을 문지릅니다. 마우스 코를 위로 기울여 머리를 뻗어 입에서 배까지 직선으로 선을 만듭니다. 열 탐침을 혀 위의 약 0.5cm 마우스 식도로 밀어 넣고 마우스 코 주위의 노즈 콘을 교체합니다. 썰매 상단에 식도 프로브와 노즈 콘을 고정합니다.
      알림: 기관에 부적절하게 삽입될 수 있으므로 삽입 직후 호흡 곤란의 징후를 모니터링하십시오.
9. 직장 온도 프로브를 삽입합니다.
   알림: 직장 및 식도 온도 프로브는 서로 3°C 이내여야 합니다.
10. 연결 케이블이 있는 호흡 모니터를 마우스 머리 쪽으로 놓아 초음파 변환기의 배치를 방해하지 않도록 합니다. 테이프로 고정합니다.
11. 27G 나비 바늘 꼬리 정맥 카테터를 20μL의 데드 스페이스와 테이프로 마이크로튜브에 부착된 측면 꼬리 정맥에 삽입합니다. 테이핑 후 카테터가 여전히 잘 세척되고 있는지 확인하십시오.
12. 두 사람이 사용하여 준비된 마우스, 마우스 썰매, 마취 라인, 호흡 라인, 꼬리 정맥 카테터 및 열 프로브 코드를 MRI 스캐너에 넣고 MRI 썰매 홀더에 넣습니다.
13. HIFU 소프트웨어( 재료 표 참조) 작업자가 초기 정렬을 위해 육안 검사를 통해 트랜스듀서의 반월판을 종양 바로 위로 이동하도록 합니다²⁷. 종양 위의 털이 없는 피부에 눈 윤활제 또는 탈기된 초음파 젤을 바르고 HIFU 변환기를 종양 부위에 연결합니다.
14. 자동 펌프에서 꼬리 정맥 카테터로 약물 전달 라인을 연결합니다. 꼬리 정맥 선과 연결 선의 사각 공간의 양을 계산하십시오. MRI 레일의 마우스 HIFU 슬레드를 MRI 중앙으로 밀어 넣습니다.
15. 약물의 종류와 농도, 동물의 무게에 따라 펌프에 주입되는 약물의 양을 설정하고 데드 스페이스의 양을 추가합니다. 펌프를 주입 속도를 200μL/min으로 설정합니다.
    참고: 이 연구에서 FD와 TLD는 2mg/mL의 농도와 5mg/kg 체중의 용량으로 사용되었습니다.
16. 기준 열 프로브 온도를 기록합니다.
17. 공기 대류 온난화 장치( 재료 표 참조)를 가장 따뜻한 설정에 놓습니다. 공기를 불어넣는 튜브가 MRI 구멍 중앙에 있는 마우스 쪽으로 향하게 하고 테이프로 고정합니다. 온난화 장치는 나중에 초음파 처리 중에 마우스의 과열을 방지하기 위해 가장 낮은 설정(32°C)으로 바뀝니다.
18. 측량 MR 영상(Ax_Loc, Sag_Loc; 표 1) 깊이를 포함한 초음파 처리 표적화를위한 종양 위치를 결정합니다. HIFU 소프트웨어를 사용하여 이미지에서 측정한 원하는 이동 거리를 삽입한 다음 화살표 방향을 클릭하여 이동하여 그에 따라 변환기 위치를 조정합니다(그림 3A). 또한 드리프트 튜브의 위치를 기록해 두십시오. 필요에 따라 반복합니다.
19. Test_Shot 온도계 획득 중에 간단한 5초 x 50mV 진폭 연속 '테스트 샷' 초음파 처리를 수행하여 관상 평면에서 변환기의 초점 위치를 결정합니다(표 1).
20. MR 측량 이미지를 HIFU 소프트웨어 내 초점의 관상 보기에 맞춥니다. 뼈 구조 및 직장과 관련된 종양 위치에 대한 이미지를 검토하고 필요에 따라 변환기 위치를 수정합니다.
21. 9회 반복 열 이미징(표 1) 동안 테스트 샷 초음파 처리를 반복하여 최소한의 타겟 이탈 가열로 종양 부피에 균일하고 정확한 가열이 있는지 확인합니다. 슬라이스 위치, 변환기 위치 및 조향 깊이를 조정하고 필요에 따라 반복적인 "테스트 샷"으로 가열 성능을 확인합니다.
22. HIFU 처리 모니터링 소프트웨어를 사용하여 이동 거리를 측정한 다음 프로그램에서 그리드 좌표를 변경하여 최종 가열 프로파일 내에서 체온 모니터링을 위한 ROI를 정의합니다. 드리프트 수정을 위해 드리프트 튜브 주위에 ROI를 설정합니다. 체온 측정을 위해 직장 프로브 온도를 기준으로 기준 온도를 입력합니다. HIFU 시스템은 HIFU 치료 초음파 처리 및 온도 측정 모니터링을 시작하는 데 사용됩니다.
23. 소프트웨어에서 20분 온열요법 치료 사양을 열고 참조 MR 이미지가 수집되고 체온 측정이 시작되면 초음파 처리를 시작합니다.
24. 내장된 PID(Proportional-Integrative-Derivative) 컨트롤러 소프트웨어를 사용하여 열 이미징(표 3) 중에 1분 처리(그림 1B)를 수행합니다. ROI의 온도가 원하는 온도(40°C)로 따뜻해진 후 1.5분에 선택된 약물을 주입합니다.
25. 치료 내내 심부 온도를 모니터링합니다. 치료 중 직장 온도가 급격히 상승하는 경우 10분 또는 20분 치료 기간 동안 직장 온난화를 피하기 위해 마우스 체위 변경이 필요할 수 있습니다. 직장 온도가 >40 °C로 상승하면 치료를 중단하십시오.

7. 실험: 급성 연구를 위한 마우스 모델 이미징 및 초음파 처리 절차

1. 치료 완료 후 MRI 보어에서 마우스를 제거하여 꼬리 정맥 카테터 삽입 부위에서 지혈을 보장합니다. 마우스를 BSC로 옮기고 지속적인 마취를 위해 노즈 콘에 놓습니다.
2. 팔다리가 구속되고 심장이 노출된 파란색 흡수 패드에 마우스를 등에 대고 놓습니다.
3. 심장 천자를 통한 출혈을 통해 생쥐를 안락사시킨 후 심장을 제거합니다. 즉시 혈액을 채취하여 10,621 x g 에서 10분 동안 혈장 분리를 위해 원심분리합니다.
4. 부검을 수행하고 분석에 필요한 장기를 보관하십시오. 장기를 액체 질소로 동결하고 -80 °C에서 액체 질소 탱크에 몇 달 또는 장기간 보관합니다.
5. 9배 초과(w/w)의 탈이온수를 추가하고 비드 비트 균질화기를 사용하여 조직을 분해하여 종양 조직을 기계적으로 균질화합니다. 300mg/mL 질산은 75μL, 10mM 황산 75μL, 1:1 이소프로판올:클로로포름 2.5mL를 순차적으로 첨가하여 균질화된 조직 600μL에서 독소루비신을 추출합니다. 20분 동안 소용돌이치고 -20°C에서 밤새 보관합니다.
6. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)용 샘플을 준비하기 위해 7.5단계의 용액을 4,500 x g에서 원심분리하고 유기 용매 층을 제거한 다음 질소 가스 흐름 하에서 이소프로판올:클로로포름을 건조시킵니다. 100μL의 2:1 MeOH:H₂O에 재현탁합니다. HPLC-MS/MS²⁸을 사용하여 독소루비신 농도를 측정합니다.

8. 실험: 생존 연구를 위한 마우스 모델 이미징 및 초음파 처리 절차

참고: 생존 연구를 위해 HIFU 치료일 동물 준비 절차(단계 6.1-6.25)를 따르십시오.

1. 치료 완료 후 마우스를 열 램프 아래에 놓아 회복할 수 있도록 하고 흉골 누운 자세를 회복할 때까지 호흡과 움직임을 모니터링합니다. 그런 다음 동물을 새장으로 되돌립니다.
   알림: 케이지의 절반이 열 램프와 일치하는지 확인하십시오.amp, 동물의 열 조절은 마취 및 HT 치료의 영향을 받습니다.
2. 행동, 섭식 패턴 및 호흡수에 대해 매일 마우스를 모니터링하여 고통의 징후가 있는지 확인합니다.
3. 연속 3주 동안 6.1-6.25단계에 따라 매주 한 번 치료를 수행합니다.
4. 매주 두 번, 종양 측정을 위해 마우스의 MRI 이미징을 수행합니다. 치료 중 몇 주 동안 매주 한 번의 MRI 스캔과 한 번의 초음파를 수행하십시오. 치료가 완료된 후 격주로 초음파 영상을 실시합니다.
5. 일련의 치료를 완료한 후 60일 후에 또는 인도적 종점에 도달했을 때(종양 크기 >1.5cm3 또는 종양의 이환율) 마우스를 안락사시킨 다음 분석을 위해 종양 및 장기 제거를 통한 부검을 실시합니다.

결과

MRgHIFU 생성 온열요법 프로토콜을 사용하여, 뒷다리의 종양은 치료 기간 동안 원하는 설정 온도로 일관되게 가열될 수 있었습니다(도 4 는 대표적인 치료를 보여줍니다, 10 또는 20분, n=65). 성공적인 치료를 고려하기 위해서는 ROI가 치료 내내 39°C 이상으로 유지되어야 했으며, 치료 전반에 걸쳐 <6°C 변동이 있었고 표적 외 조직이 가열되지 않아야 했습니다. 또한, 심부 온도는 ?...

토론

본원에서 개발된 프로토콜은 경미한 HT 치료를 위해 MRgHIFU를 사용하여 뒷다리 종양을 표적으로 삼고 생체 내에서 리포솜으로부터 캡슐화된 약물을 방출하는 데 사용되었습니다. 파일럿 연구 동안 이 프로토콜에서 몇 가지 중요한 단계가 발생했으며 이러한 중요한 단계를 최적화하면 파일럿 연구에 비해 치료 성공률이 향상되었습니다. 첫 번째는 초음파 처리 할 부위의 머리카락을 완전히 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22363204
1kb plus DNA Ladder	Froggabio	DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix)	Wisent	801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec	Bruker	T184931	70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler	Biorad	1851148
Clippers	Whal Peanut	8655
Compressed ultrasound gel	Aquaflex	HF54-004
Convection heating device	3M Bair Hugger	70200791401
Depiliatory cream	Nair	61700222611	Shopper's Drug Mart
DMEM	Wisent	219-065-LK
DNeasy extraction kit	Qiagen	69504
DPBS	Wisent	311-420-CL
Drug injection system	Harvard Apparatus	PY2 70-2131	PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant	Optixcare	50-218-8442
F10 Media	Wisent	318-050-CL
FBS	Wisent	081-105
Froggarose	FroggaBio	A87
Gel Molecular Imager	BioRad	GelDocXR
Glutamax	Wisent	609-065-EL
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100	Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G)	SAI infusion	PE-20-100
Isoflurane	Sigma	792632
M25FV24C Cell line	Gladdy Lab	N/A
Microliter Syringe	Hamilton	01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR	Biorad	170-8170
Mouse holder	The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine	N/A	Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm.
MyRun Machine	Cosmo Bio Co Ltd	CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000-GL
p53 primers	Eurofins	N/A	Custom Primers
PCR tubes	Diamed	SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin	Wisent	450-200-EL
Proteus software	Pichardo lab	N/A
Respiratory monitoring system	SAII	Model 1030	MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS	Image Guided Therapy	N/A	LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter  25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 - 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency  2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe	ThermoFisher Scientific	S33102
TAE	Wisent	811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" )	Terumo Medical Corp	15253
Thermal probes	Rugged Monitoring	L201-08
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin	Wisent	325-052-EL
Ultrasound Gel	Aquasonic	PLI 01-08