마우스 자발성 자가면역 갑상선염 모델 생성

요약

하시모토 갑상선염의 여러 유형의 동물 모델이 확립되었으며, NOD 마우스의 자발성 자가면역 갑상선염도 확립되었습니다. H-2h4 마우스는 HT 유도를 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 모델입니다. 이 기사에서는 이 접근 방식을 설명하고 SAT 쥐 모델을 더 잘 이해하기 위해 병리학적 과정을 평가합니다.

초록

최근 몇 년 동안 하시모토 갑상선염(HT)은 가장 흔한 자가면역 갑상선 질환이 되었습니다. 그것은 림프구 침윤과 특정 혈청자가 항체의 검출을 특징으로합니다. 잠재적인 메커니즘은 아직 명확하지 않지만 하시모토 갑상선염의 위험은 유전적 및 환경적 요인과 관련이 있습니다. 현재 실험적 자가면역 갑상선염(EAT) 및 자발성 자가면역 갑상선염(SAT)을 포함하여 여러 유형의 자가면역 갑상선염 모델이 있습니다.

생쥐의 EAT는 티로글로불린(Tg)과 결합된 지질다당류(LPS)로 면역화되거나 완전 프로인트 보조제(CFA)로 보충되는 HT의 일반적인 모델입니다. EAT 마우스 모델은 많은 유형의 마우스에서 널리 확립되어 있습니다. 그러나, 질환 진행은 Tg 항체 반응과 연관될 가능성이 더 높으며, 이는 상이한 실험에서 다를 수 있다.

SAT는 NOD의 HT 연구에도 널리 사용됩니다. H-2h4 마우스. 고개를 끄덕입니다. H2h4 마우스는 B10과 함께 비만하지 않은 당뇨병(NOD) 마우스의 교배로부터 얻은 새로운 균주이다. A(4R), 이는 요오드 공급 유무에 관계없이 HT에 대해 유의하게 유도됩니다. 유도하는 동안 NOD. H-2h4 마우스는 갑상선 여포 조직에 림프구 침윤을 동반하는 높은 수준의 TgAb를 가지고 있습니다. 그러나 이러한 유형의 마우스 모델의 경우 요오드 유도 동안 병리학적 과정을 종합적으로 평가하는 연구는 거의 없습니다.

본 연구에서는 HT 연구를 위한 SAT 마우스 모델을 확립하고, 장기간의 요오드 유도 후 병리학적 변화 과정을 평가한다. 이 모델을 통해 연구자들은 HT의 병리학적 발달을 더 잘 이해하고 HT에 대한 새로운 치료 방법을 선별할 수 있습니다.

서문

하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis, HT)은 만성 림프구성 갑상선염 또는 자가면역성 갑상선염으로도 알려져 있으며, 1912년에 처음 보고되었다¹. HT는 림프구 침윤과 갑상선 여포 조직 손상을 특징으로 합니다. 실험실 검사는 주로 항갑상선글로불린 항체(TgAb) 및 항갑상선 과산화효소 항체(TPOAb)를 포함한 갑상선 특이적 항체의 증가로 나타납니다^.2. HT의 발병률은 0.4%-1.5% 범위로 모든 갑상선 질환의 20%-25%를 차지하며 이 값은 최근 몇 년 동안 증가했습니다³. 또한 많은 연구에서 HT가 유두상 갑상선 암종(PTC)의 종양 발생 및 재발과 관련이 있다고 보고했습니다^.4,5; 잠재적 메커니즘은 여전히 논란의 여지가 있습니다. 자가면역성 갑상선염은 여성 불임의 중요한 요인이기도^{하다 6}. 따라서 HT의 발병기전이 명확해야 하며, 이를 위해서는 안정적이고 단순한 동물 모델이 필수적입니다.

HT의 병인을 연구하기 위해 본 연구에서 실험적 자가면역 갑상선염(EAT)과 자발성 자가면역 갑상선염(SAT)을 포함하여 두 가지 주요 종류의 쥐 모델이 사용되었습니다 ^7,8. 감수성 마우스를 특정 갑상선 항원(조갑상선, 정제된 티로글로불린[TG], 갑상선 과산화효소[TPO], 재조합 TPO 엑토도메인 및 선택된 TPO 펩티드 포함)으로 면역화하여 EAT 쥐 모델을 확립했습니다. 또한, 지질다당류(LPS), 완전 프로인트 보조제(CFA) 및 다른 특이한 보조제를 포함하는 보조제는 또한 면역 관용(9,10,11,12,13,14,15,16,17)을 분해하기 위해 면역화 동안 사용된다.

SAT 모델은 NOD를 기반으로 하는 자가면역성 갑상선염의 자발적 발달을 연구하는 중요한 모델입니다. H-2h4 마우스. 고개를 끄덕입니다. H-2h4 마우스는 NOD와 B10의 교배로부터 얻은 새로운 균주이다. A(4R) 마우스, 자가면역 갑상선염 감수성 유전자 IAk^18,19를 사용하여 NOD에 대한 다중 백크로스. 끄덕이다. H-2h4 마우스는 당뇨병이 발생하지 않지만 자가면역 갑상선염과 쇼그렌 증후군(SS) 발병률이 높습니다¹⁹. 연구에 따르면 세포 내 접착 분자-1(ICAM-1)은 NOD의 갑상선 조직에서 고도로 발현됩니다. 3-4주령의 H-2H4 마우스. 또한, 요오드 섭취가 증가함에 따라 티로 글로불린 분자의 면역 원성이 향상되어 단핵구 침윤 과정에서 중요한 역할을하는 ICAM-1의 발현을 더욱 상향 조절한다²¹. 이 모델은 요오드 용량과 질병 중증도 사이의 관계를 확인하면서 자가면역 과정을 시뮬레이션합니다. 확립 된 방법은 안정적이며 성공 확률이 높습니다. SAT 모델은 수년 동안 자가면역성 갑상선염을 유발하는 데 적용되어 왔으며 자가면역성 갑상선염의 발병기전을 연구하는 효과적인 방법이기도 합니다. 그러나 현재 EAT 모델의 구성 방법은 더 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 다른 실험실은 다른 예방 접종 방법과 주사 부위를 사용합니다. 또한, 유전적 배경이 다른 마우스는 유도 속도가 다르기 때문에 강력한 메커니즘을 밝히기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

그러나 SAT 모델에서 갑상선염의 발병은 요오드화 나트륨, 성적 이형성 및 양육 조건과 관련이 있습니다. SAT 모델에서자가 면역 갑상선염의 적절한 절차를 밝히기 위해이 기사에서는 다양한 조건에서자가 면역 갑상선염을 유도하는 방법을 설명했습니다. 또한, 이 질환의 여러 단계에서 자가면역 갑상선염의 발병기전 및 면역학적 진행을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

아래에 설명된 프로토콜은 쓰촨 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 제정한 관리 및 사용 지침에 의해 승인되었습니다.

1. 준비

1. 모든 마우스를 12시간 명암 주기(각각 오전 07:00 및 오후 07:00에 시작)에서 특정 병원체가 없는 조건에 수용합니다. 실내 온도를 22°C로 유지합니다. 매주 침구 재료를 교체하십시오. 적절한 양의 표준 설치류 차우와 물을 제공하십시오.
2. NaI의 원액을 물에 조제할 때, 화합물 2.5g을 칭량하여 볼텍싱하에 멸균된 순수 50mL에 용해시켜 5%의 원액을 얻었다. 이 스톡 용액을 빛을 피하고 4°C 냉동고에 최대 8주 동안 보관하십시오.
3. NaI의 작동 용액을 준비하기 위해 원액 2.5mL를 뽑아 NOD의 일일 음용수로 일반 물 250mL에 녹입니다. H-2H4 마우스를 0.05%의 작업용액으로 수득하였다.

2. 갑상선염 유도

1. SAT 모델
   1. NOD를 준비합니다. H-2h4 마우스(8주령)를 위해 연구를 위해 단일 성별(성적 이형성 없음)의 모든 마우스를 배리어 케이지(케이지 당 5마리)에 1.1단계에 기재된 섭식 조건으로 수용하였다.
   2. NOD에서 자가면역 갑상선염을 유도합니다. H-2h4 마우스는 모든 마우스에 8주 동안 0.05% NaI를 공급합니다. 매주 NaI 물을 교체하고 외모, 체중, 식욕, 정신 상태 및 이동성을 포함하여 매주 생쥐의 상태를 평가합니다.
2. EAT 모델
   1. 1.1단계에 설명된 섭식 조건으로 배리어 케이지(케이지당 5마리)에 단일 성별(성적 이형성 없음)의 모든 마우스를 수용하여 연구를 위해 BALB/c 마우스(8주령)를 준비합니다. 모든 마우스에 0.05% NaI를 8주 동안 공급합니다.
   2. 처음 2주 동안 일주일에 한 번 CFA와 Tg(200μL)의 혼합물을 피하 주사합니다.
   3. 3주째부터 IFA와 Tg(200μL)의 혼합물을 3주 동안 주 1회 피하 주사한다.

3. 측정

1. 말초 혈액 샘플의 준비
   1. 유도 후 0.01mL/g 용량의 마우스를 복강주사로 마취한다. 미다졸람(진정 40μg/100μL), 메데토미딘(진정 7.5μg/100μL) 및 부토르파놀 타르타르산염(진통제용 50μg/100μL)을 인산염 완충 식염수(PBS)에 혼합하여 마취제를 준비합니다.
      참고: 마취 혼합물의 각 성분의 특정 농도는 미다졸람 13.33μg/100μL, 메데토미딘 2.5μg/100μL 및 부토르파놀 16.7μg/100μL입니다. 생쥐에 사용되는 특정 용량의 경우 용량은 미다졸람 4μg/g, 메데토미딘 0.75μg/g 및 부토르파놀 1.67μg/g입니다. 마취 깊이는 마우스의 사지 근육이 이완되고 수염이 촉감 반응이 없으며 페달 반사가 상실되었을 때 확인되었습니다.
   2. 마우스를 마취시킨 후 한 손으로 마우스를 고정하고 안구 피부를 눌러 안구가 돌출되도록 말초 혈액 샘플을 준비합니다. 그런 다음 모세관을 눈의 안쪽 모서리에 삽입하고 콧 구멍의 평면에 30-45도 각도로 침투하십시오. 모세관을 부드럽게 돌리면서 압력을 가합니다. 혈액은 모세관 작용을 통해 튜브로 흐릅니다.
   3. 혈액을 4°C 냉장고에 2시간 동안 넣은 다음 1,000× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 샘플을 얻습니다. 추가 분석을 위해 나머지 샘플을 -80°C에서 보관합니다.
2. 갑상선 조직 샘플의 준비
   1. 제도적 정책에 따라 동물을 인도적으로 안락사시킵니다. 그런 다음 흉벽을 해부하여 심장을 노출시키고 우심방을 잘라낸 다음 조직이 하얗게 변할 때까지 20mL 주사기에 부착된 정맥 주입 바늘로 식염수를 좌심실에 주입합니다.
   2. 핀으로 해부 테이블에 마우스를 고정하십시오. 75 % 에탄올로 목을 소독하십시오. 조직 가위로 흉골 상단에서 아래턱까지 목의 중앙선을 따라 마우스의 피부를 잘라 목 조직을 완전히 노출시킵니다.
   3. 한 쌍의 분홍색 땀샘, 턱밑 땀샘을 관찰하고 그 아래에는 전방 기관 근육이 있습니다. 안과용 가위와 집게로 땀샘과 근육을 분리하여 기관과 갑상선 연골을 노출시킵니다.
   4. 구부러진 집게를 사용하여 연골과 기관을 함께 집어 올리고 연골 아래 조직을 분리합니다. 연골과 기관의 원위부와 근위부를 각각 잘라내어 기관과 함께 갑상선을 제거하십시오.
   5. 땀샘을 4 % 파라 포름 알데히드에 12-24 시간 동안 담그십시오. 그런 다음 조직을 70% 에탄올로 옮깁니다.
   6. 갑상선 생검 물질의 개별 엽을 처리 카세트에 넣고 다음 직렬 알코올 구배를 통해 탈수합니다: 각각 40분 동안 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 에탄올; 2 시간 동안 1/2 크실렌 + 1/2 절대 에탄올; 1.5 시간 동안 100 % 크실렌; 1.5 시간 동안 100 % 크실렌; 2시간 동안 1/2 크실렌 + 1/2 파라핀; 40 ° C에서 40 분 동안 오븐; 30분 동안 파라핀 I; 및 파라핀 II를 30분 동안 투여합니다. 파라핀 왁스 블록에 삽입하십시오.
   7. 염색 전에 5μm 두께의 갑상선 조직 절편을 크실렌(다음과 같이)으로 탈왁스하고 다음과 같은 감소된 농도의 에탄올을 통해 재수화합니다. 10분 동안 크실렌 II; 10분 동안 크실렌 III; 5분 동안 무수 에탄올 I; 5분 동안 무수 에탄올 II; 5 분 동안 90 % 알코올; 5 분 동안 80 % 알코올; 5 분 동안 70 % 알코올; 5 분 동안 50 % 알코올.
   8. 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 조직을 얼룩지게 합니다. 헤마톡실린으로 15분간 얼룩지게 하고 수돗물로 15분간 헹구고 1% 염산 에탄올을 10초 동안 넣고 흐르는 물로 헹군 다음 50%, 70%, 80% 에탄올로 각각 3분간 헹굽니다. 0.5% 에오신 에탄올 염색을 2분 동안 수행하고 흐르는 물로 헹굽니다. 파라핀 절편을 75% 에탄올에 2분, 85% 에탄올에 2분, 무수 에탄올에 5분, 자일렌에 5분 동안 연속적으로 놓습니다. 중성 껌과 유리 슬라이드로 슬라이스를 고정하십시오.
   9. 림프구성 갑상선염의 정도를 평가하기 위해, 갑상선 절편을 다음과 같이 점수화한다: 0: 갑상선 조직에 림프구 침윤이 거의 또는 전혀 없음; 1+ : 샘의 1/8 이상이 하나 또는 여러 개의 병소에 침투합니다. 2+ : 샘의 1/4 이상이 림프구로 침윤되지 않습니다. 3+: 샘의 1/4-1/2에 림프구가 침윤됩니다. 4+: 샘의 1/2 이상이 파괴됩니다.
      참고: 기관에서 제거하기에는 너무 작은 마우스 갑상선의 전체 구조를 유지하기 위해 갑상선 연골을 제거하는 것이 좋습니다.
3. TPOAb 측정
   참고: 마우스 TPO를 안정적으로 발현하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포가 우리 연구실에서 확립되었습니다. 마우스 TPO cDNA는 XbaI 및 NheI에 의해 절제되었다. 그런 다음 cDNA를 pcDNA5/FRT로 옮겼습니다. 플라스미드가 성공적으로 구축된 후 CHO 세포에 형질감염시키고 하이그로마이신 B(100g/mL)로 선택했습니다.
   1. mTPO-CHO 세포를 구축한 후 3.1.3단계(1:50)에서 마우스 혈청을 희석하고 mTPO-CHO 세포와 함께 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 프로피듐 요오드화물(1g/mL)로 세포 염색을 제외하고 플루오레세인 이소티오시아네이트 접합, 친화성 정제 염소 항-마우스 IgG를 사용하여 유세포 분석으로 샘플을 분석합니다. FSC-A 및 SSC-A 채널로 생존한 단세포 집단을 스크리닝하고 단일세포 집단에서 FITC 및 PI 태그가 부착된 세포를 선택한다²¹.
   2. IgG에 결합된 면역되지 않은 BALB/c 또는 C57BL/6 마우스의 혈청을 음성 대조군으로 포함합니다. 마우스 TPO²³을 인식하는 양성 대조군으로 인간 TPO²²에 대한 마우스 단클론 항체를 포함합니다. TPO 바인딩 데이터를 기하학적 평균으로 표현합니다.
4. TgAb 측정
   알림: ELISA 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 티로글로불린을 검출하십시오.
   1. 표준 샘플을 희석하십시오.amp지침에 따라 미세 원심분리기 튜브에 있습니다. 냉장고에서 키트를 꺼내 실온에서 30분 동안 보관하세요.
   2. 표준 웰, 블랭크 웰 및 테스트 웰을 설정합니다. 블랭크 웰은 버퍼만 얻는 반면 표준 웰은 표준 용액을 얻습니다. 10 μL의 샘플을 테스트 웰에 추가합니다. 샘플을 추가 할 때 웰 벽을 만지지 말고 플레이트를 부드럽게 흔들어 샘플을 웰 바닥으로 옮깁니다.
   3. 양성 대조군으로 Tg, CFA 및 IFA²⁴ 로 면역화된 BALB/c 마우스의 혈청과 8주령 NOD의 혈청을 포함합니다. H-2h4 마우스는 음성 대조군으로 일반 물에 있습니다.
   4. 샘플을 37°C 수조에서 30분 동안 인큐베이션합니다. 세척 완충액을 증류수로 1:30의 비율로 희석한다. 그런 다음 밀봉 필름을 제거하고 효소 플레이트 내부의 액체를 털어내고 흡수지에서 두드려 건조시킨 다음 350μL의 세척 완충액을 30초 동안 추가합니다. 이 과정을 다섯 번 반복한 다음 우물을 두드려 말립니다.
   5. 블랭크 웰을 제외한 각 웰에 효소 표지 시약 50μL를 첨가하고 37° 수조에서 30분 동안 배양합니다. 밀봉 필름을 제거하고 효소 플레이트 내부의 액체를 털어내고 흡수성 종이에 두드려 말립니다.
   6. 50 μL의 현상액 A를 각 웰에 첨가한 후 50 μL의 현상액 B를 첨가하고 웰을 부드럽게 흔들어 5분 동안 혼합합니다. 종결 용액 50μL를 각 웰에 15분 동안 첨가하여 반응을 중지합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm의 파장에서 각 웰의 흡광도(OD)를 측정합니다. TgAb 데이터를 490 nm에서의 광학 밀도(OD)로 제시합니다.
5. T4 및 갑상선 자극 호르몬(TSH) 측정
   참고: 제조업체의 지침에 따라 ELISA로 T4 및 TSH 수준(10μL 분취량)을 측정합니다.
   1. 효소 접합체를 분석 희석제로 1:11로 희석합니다. 측정할 샘플을 0.01 M PBS를 사용하여 희석(1:100)합니다.
   2. 표준물질과 시료 10μL를 해당 웰에 추가하고, 효소 접합체 100μL를 각 웰에 추가하고, 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
   3. 우물에 액체를 버리고 세척 완충액으로 세 번 세척하십시오.
   4. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 100μL를 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
   5. 정지 용액 50 μL를 넣고 15-20 초 동안 부드럽게 혼합합니다.
   6. 450nm 파장에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도(OD)를 측정하고 샘플 농도를 계산합니다.
   7. 통계 소프트웨어를 사용하여 t-검정 또는 순위 합계 검정을 수행하고 결과를 플로팅합니다.

결과

조직학적 변화는 여성과 남성, 요오드 섭취 기간, NaI 용액에서 현저하게 달랐습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 NOD의 ~10%. H-2h4 마우스는 24주령에 요오드 유도 없이도 SAT가 발생했고, 결국 모든 마우스에서 갑상선염이 발생했다. 일반 물을 투여했을 때 남성과 여성의 조직학적 변화에는 큰 차이가 없었습니다. 식수에 NaI를 추가하면 갑상선염의 발병이 가속화되었습니다. 0.005%, ...

토론

HT는 갑상선에 침투한 림프구로 인한 자가면역계 장애로 인해 발생하며, 갑상선 기능을 더욱 손상시키면서 갑상선 특이적 항체를 생성합니다. HT 환자의 혈청 TSH, TgAb 및 TPOAb 수치는 유의하게 상승했다²⁷. 현재 자가면역 갑상선염의 병인을 연구하기 위해 두 가지 주요 종류의 쥐 모델이 널리 사용됩니다: EAT와 SAT²⁹. EAT 마우스는 생체 내에서 비정상적인 면?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Butorphanol tartrate	Supelco	L-044
Dexmedetomidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well	Sigma-Aldrich	M9410-1CS
Ethanol	macklin	64-17-5
Freund’s Adjuvant, Complete	Sigma-Aldrich	F5881
Freund’s Adjuvant, Incomplete	Sigma-Aldrich	F5506
Goat anti-Mouse IgG	invitrogen	SA5-10275
Midazolam solution	Supelco	M-908
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA	Calbiotech	DKO045
Paraformaldehyde	macklin	30525-89-4
Propidium iodide	Sigma-Aldrich	P4864
Sodium Iodine	Sigma-Aldrich	7681-82-5
Thyroglobulin	Sigma-Aldrich	T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit	Thermo Scientific	EHTGX5
TSH ELISA	Calbiotech	DKO200
Xylene	macklin	1330-20-7