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요약

이 프로토콜은 손상된 PC12 세포를 치료하기 위해 두 허브의 조합 전략을 제공합니다. 이 프로토콜은 중국 전통 의학(TCM)의 최상의 적용 모드를 최적화하기 위한 참조를 제공합니다.

초록

뇌 허혈 치료에서 중국 전통 의학(TCM) 조합의 이점을 고려하여 손상된 PC12 세포를 치료하기 위한 두 가지 허브 조합 전략을 탐구하기 위해 제제 조합과 성분 조합 간의 효능 및 메커니즘의 차이를 연구했습니다. 글루코오스가 없는 배지와 결합된 염화코발트(CoCl2)를 사용하여PC12 세포의 산화적 손상을 유도하였다. 이어서, 황기몽홀리쿠 스(Ast)와 에리 게론 브레비스카푸 스(Eri) 주사제의 최적 조합을 선정하고, PC12 세포에 대한 안전하고 효과적인 농도를 스크리닝한 후 균일한 설계 방법에 따라 조합하였다. 또한, 스크리닝된 성분 조합은 2개의 허브에 10μM 아스트라갈로시드 A, 40μM 스쿠텔라린, 및 75μM 클로로겐산을 포함한다. 그런 다음 MTT, Annexin V-FITC / PI, 면역 형광 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 손상된 PC12 세포에서 제제 조합 및 성분 조합의 효능 및 메커니즘을 평가했습니다. 그 결과 세포 생존 촉진을 위한 최적의 제제 조합은 6:1.8(μM) 농도의 Ast 주사와 Eri 캡슐이었습니다. 성분 조합(10μM 아스트라갈로시드 A, 40μM 스쿠텔라린, 및 75μM 클로로겐산)이 제제 조합보다 더 효과적이었습니다. 두 조합 모두 세포 사멸 속도, 카스파제 -3의 형광 강도 및 세포 내 활성 산소 종 (ROS) 수준을 현저하게 감소시켰다. 한편, 그들은 p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax 및 Nrf2의 발현 수준을 상향 조절했다. 이러한 효과는 성분 조합에서 더 분명했습니다. 결론적으로, 두 조합 모두 PC12 세포 상의 무포도당 배지와 결합된CoCl2 에 의해 유도된 손상을 억제할 수 있고, 따라서 세포 생존을 촉진할 수 있다. 그러나, 제제 조합에 비해 성분 조합의 효율은 산화 스트레스 및 세포 사멸과 관련된 PI3K / Akt / Nrf2 신호 전달 경로의 더 강한 조절 때문일 수있다.

서문

뇌저관류로 인한 만성 뇌허혈은 중년 및 노인에게 흔한 질환입니다1. 장기 잠복성 허혈 질환으로서 진행성 또는 지속적인 신경 기능 장애로 이어질 수 있습니다. 주요 병리학 적 메커니즘에는 세포 사멸 및 산화 적 손상이 포함되며 진행성 또는 지속적인 신경 기능 장애를 유발합니다. 이것은 알츠하이머 병, 혈관성 치매 및 기타 질병의 병리학 적 기초이며 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미칩니다. 그러나 만성 뇌 허혈을 치료하기위한 현대 의학의 이상적인 약물은 여전히 부족합니다2. 동시에, 황기 몽홀리쿠 스(Ast)와 에리게론 브레비스카푸스 (Eri)의 조합은 중국 전통 의학(TCM)의 임상 실습에서 널리 사용되었습니다.4. 병용 전략은 뇌 허혈 후 신경 기능의 회복을 촉진하는 데 현저하게 개선되었으며, 이는 단일 약물보다 우수합니다. 그러나, 두 약물의 조합에서 투여 비율에는 큰 차이가 있습니다4. 효과적인 구성 요소와 작용 메커니즘이 잘 정의되어 있지 않아 임상 적용을 제한하는 핵심 문제입니다.

이전 연구는 쥐의 뇌 허혈 치료에서 Ast 주사와 Eri 주사의 제제 조합의 시너지 효과를 입증했습니다. p-Akt 단백질의 발현을 상향조절하고 B-림프모세포종 2(Bcl-2) 계열 단백질 중 하나인 Bcl-2 관련 사멸 촉진제(BAD) 단백질 5,6의 발현을 하향조절하여 세포사멸을 촉진하는 효과가 있습니다. 그러나 시너지 효과의 물질적 근거와 메커니즘은 명확하지 않습니다. 또한, PC12 세포의 손상 모델을CoCl2 조합 무포도당 배지로 확립하고, Ast 및 Eri에서의 최적 성분 조합을 스크리닝하고 7로 정의하였다.

이 연구에서, Ast 및 Eri의 유효 투여량은 손상된 PC12 세포 모델을 사용하여 스크리닝된다. 두 약물의 최적 조합은 균질 설계 방법과 결합 된이 모델을 사용하여 스크리닝됩니다. 세포 모델은 손상된 PC12 세포에서 제제 조합과 성분 조합의 효과 및 메커니즘의 차이를 추가로 평가하는 데 사용됩니다. 이 전략은 PI3K/Akt/Nrf2 신호 경로를 통해 손상된 PC12 세포에 대한 두 가지 유형의 조합의 보호 효과 및 조절 메커니즘을 탐색하여 최상의 조합 모드를 결정하는 것을 목표로 합니다. 이 연구는 TCM의 최상의 애플리케이션 모드를 최적화하기위한 참고 자료를 제공합니다.

프로토콜

1. 시약의 제조

  1. 125mL 멸균 배양 플라스크에 90mL의 DMEM 고당 배지, 10mL의 소 태아 혈청(FBS) 및 1mL의 페니실린-스트렙토마이신 용액을 추가하여 완전한 배지를 준비합니다. 전체 배지를 혼합하고, 폐쇄 조건 하에서 4°C에서 저장한다.
  2. DMEM 무설탕 배지 (완전히 용해 됨) 10mL에 0.02g의 CoCl2 분말 (정확하게 칭량)을 첨가하여 CoCl2 용액을 준비하여 8.4mM 원액을 얻습니다. 0.22μm 박테리아 필터로 용액을 여과하고 밀봉한 다음 빛으로부터 떨어진 4°C에서 보관합니다.
    알림: CoCl2 는 불안정하므로 빛으로부터 보호되는 밀폐 용기에 보관해야합니다. CoCl2 용액의 유효 기간은 7 일이다.
  3. 트리스-Hcl 완충염 용액 (TBST)을 준비하십시오.
    1. 8g의 염화나트륨, 0.2g의 염화칼륨 및 3g의 트리스 염기를 정확하게 측정합니다. 1L 비커에 넣은 다음 RO 물 1,000mL를 추가하여 혼합물을 녹입니다.
    2. pH를 7.4로 조정하고 트윈 20 1mL를 넣고 완전히 혼합하여 TBST 용액을 얻습니다.
      참고: 트윈 20은 항원에 대한 항체의 비특이적 결합을 감소시키는 계면활성제 역할을 하며 0.1% 농도에서 가장 잘 작동합니다.
  4. 5 mg / mL 원액을 얻기 위해 PBS 용액 20 mL에 MTT 분말 0.1 g을 칭량하여 MTT (3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 염) 용액을 준비합니다. 0.22μm 박테리아 필터로 용액을 여과하고 밀봉한 다음 빛으로부터 떨어진 4°C에서 대기 상태로 보관합니다.
    알림: MTT 분말은 불안정하고 수분을 쉽게 흡수하므로 빛을 피해 밀폐되고 건조한 곳에 보관해야 합니다. MTT 솔루션은 7일 후에 만료됩니다. MTT는 발암 효과가 있으므로 피부와의 직접적인 접촉을 피하십시오.
  5. 캡슐 쉘을 제거하고 DMEM 무설탕 배지 10mL에 0.18g의 함량을 정확하게 칭량하여 에리캡슐 용액을 제조하여 100μM 원액(스쿠텔라린 농도 기준)을 제조하였다. 0.2μm 박테리아 필터로 용액을 여과하고 밀봉한 후 4°C의 밀폐용기에 보관한다.
    참고: 스쿠텔라린은 에리게론 브레비스카푸스의 주요 활성 성분입니다. 캡슐 내의 스쿠텔라린의 농도는 HPLC-UV에 의해 2.56 mg/g, 즉 5.54 μmol/g8로 결정되었다. 제제의 농도는 스쿠텔라린 농도에 기초하여 계산된다. 이것은 제제 및 성분의 약리학 적 활성을 평가하는데 편리하다.
  6. 15mL 멸균 원심분리 튜브에 주사 5mL와 무설탕 DMEM 배지 5mL를 추가하여 Ast 주사 용액을 준비하여 60μM 원액을 준비합니다(아스트라갈로사이드 A 농도 기준). 0.2μm 박테리아 필터를 통해 용액을 여과하고 4°C의 밀폐용기에 보관한다.
    참고: 주사량은 각각 10mL이며 주사 중 아스트라갈로사이드 A의 농도는 HPLC-ELSD에 의해 0.094mg/mL(즉, 120μM)9로 결정되었습니다. 준비는 생물 안전 캐비닛에서 수행되어야하며 전체적으로 빛이 나는 방식으로 작동해야합니다. 주사액과 무설탕 배지의 부피를 정확하게 측정하고 잘 혼합해야 합니다.
  7. 아스트라갈로사이드 A 표준물질 7.85mg을 정확하게 칭량하여 아스트라갈로사이드 A 용액을 제조하고 이를 디메틸설폭사이드(DMSO) 2mL에 완전히 용해시켜 5,000μM 원액을 제조한다. 0.22μm 박테리아 필터로 여과하고 4°C에서 밀폐 보관합니다.
    알림: 아스트라갈로사이드 A 분말은 무설탕 배지에 녹지 않습니다. 용액을 준비할 때 적절한 양의 DMSO로 용해하여 DMSO의 최종 실험 농도를 0.1% 미만으로 유지하여 세포 독성이 없도록 합니다.
  8. 11.56mg의 스쿠텔라린 표준물질을 칭량하여 스쿠텔라린 용액을 정확하게 제조하고 이를 무설탕 DMEM 배지 5mL로 완전히 용해시켜 5,000μM 원액을 제조합니다. 0.22μm 박테리아 필터로 여과하고 4°C에서 밀폐 보관합니다.
  9. 클로로겐산 표준물질 8.86mg을 칭량하여 클로로겐산 용액을 무설탕 DMEM 배지 5mL에 정확하고 완전하게 용해시켜 제조하여 5,000μM 원액을 제조하였다. 0.22μm 박테리아 필터로 여과하고 4°C에서 밀폐 보관합니다.
    알림: 클로로겐산 분말은 불안정하고 물을 쉽게 흡수합니다. 빛으로부터 멀리 떨어진 4 °C에서 밀봉 및 보관해야합니다. 계량 중에 노출 시간을 최소화해야 합니다.

2. 세포 생존율 분석

  1. PC12 세포를 얻고 10% FBS, 100U/mL의 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 배양합니다.
    참고: 이 연구에서 세포는 중국 과학원에서 얻습니다. PC12 세포는 신경 내분비 세포의 일반적인 특성을 가지며 신경 생리학 및 신경 약리학에서 널리 사용되는 부착 세포입니다.
  2. 세포를 5%CO2 가 보충된 배양기에서 37°C에서 배양하고 2-3일마다 계대 배양한다. 모든 실험에 대해 계대 4-8의 세포를 사용하십시오.
  3. 세포 배양
    1. 대수 성장기(70%-80% 세포 밀도)의 PC12 세포를 1mL의 트립신(0.25%)으로 처리하고 현미경으로 세포를 관찰합니다. 세포가 둥글게되면 전체 배지 3mL를 추가하여 트립신 소화를 중지하십시오.
    2. 세포를 멸균된 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 840 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상청액을 버리고 전체 배지로 재현탁한 다음 세포 현탁액을 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 유세포 분석기를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
      1. 유세포분석 소프트웨어를 시작하고 계수 설정에서 세포 용액의 해당 희석 배수를 선택한 다음 1.5mL 미세 원심분리 튜브에서 세포 샘플을 로드한 후 밀도 차트를 클릭합니다.
      2. X축과 Y축에서 셀 모집단에 동그라미를 치고 그림 아래의 데이터 테이블을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 X, Y, 개수 및 Abs 개수를 선택합니다. 데이터 테이블의 Abs Count 아래에 있는 데이터는 셀 카운팅 결과를 제공합니다.
    3. 세포 농도를 1 x 10 5 cells/mL로 조정하고, 96웰 플레이트에 100μL/웰을 접종하고, 인큐베이터에서 37°C 및5 %CO2 에서 24시간 동안 배양합니다.
  4. 정상 PC12 세포에서 두 약물의 안전한 농도 스크리닝
    1. 단계 2.1-2.2에 설명된 대로 세포를 배양한다. 상청액을 버리고, 정상 세포를 상이한 최종 농도의 Ast 주사(4, 8, 12, 16, 20, 및 24 μM) 및 에리캡슐(0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 및 20 μM)로 처리하였다. 각 그룹의 6 개의 반복 웰을 24 시간 동안 처리합니다.
      참고: 약물의 최종 농도(2.4.1단계에서 언급)를 달성하기 위해 약물을 배지에 추가한 다음 동일한 부피의 배지를 각 웰에 추가합니다. 상청액을 흡인 할 때 피펫 팁은 웰 바닥의 세포와 접촉하지 않도록 웰 벽에 부드럽게 배치해야합니다. 다른 용액을 추가 할 때는 우물 가장자리를 따라 부드럽고 빠르게 추가하고 실험 결과에 영향을 미치지 않도록 피펫 건 헤드를 교체 할 때주의하십시오.
    2. 상청액을 버리고 각 웰에 120μL의 MTT 용액(1mg/mL)을 추가하고 37°C에서 4시간 동안 세포를 배양합니다.
    3. 배양 후 상청액을 다시 버리고 각 웰에 150μL의 DMSO를 추가합니다. 와류 발진기를 사용하여 10회/분(분당 수평 진동 횟수)의 속도로 240분 동안 플레이트를 흔듭니다.
    4. 마이크로플레이트 리더를 이용하여 490 nm에서 각 시료의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(%)을 계산하는데, 이는 처리군의 흡광도/정상군(대조군)의 흡광도 x 100입니다.
      참고: MTT 솔루션이 유효 기간 내에 있는지 확인하십시오. 색상이 짙은 녹색으로 변경된 경우 사용할 수 없습니다. 세포의 흡광도를 테스트 할 때 다른 시약의 간섭을 제거하기 위해 빈 우물 (세포 또는 약물이없는 배양 배지 및 MTT)을 설정해야합니다. 부피 150μL의 DMSO를 각 웰에 첨가하고 10분 동안 흔들어 청자색 결정을 더 잘 용해시킨다. 흡광도는 결과의 정확성을 보장하기 위해 가능한 한 빨리 감지되어야 합니다.
  5. 손상된 PC12 세포에 대한 두 약물의 유효 농도 스크리닝
    1. 2.1-2.2단계에서 언급한 대로 세포를 24시간 동안 배양하고 상청액을 버린 다음 무설탕 배지와 결합된 20μL/웰의CoCl2 (0.4mM)로 세포를 처리합니다.
    2. 37°C에서 100μL/웰의 Ast 주사(최종 농도는 2, 6, 8, 10 및 12μM) 또는 100μL의 Eri 캡슐(최종 농도는 1, 2, 3, 4 및 5μM)로 세포를 동시에 24시간 더 처리합니다. 120 μL/웰의 완전 배지를 대조군에 추가합니다.
      참고 : CoCl2 는 세포에서 저산소 상태를 유도합니다.
    3. MTT 방법으로 각 샘플의 흡광도를 측정하고 앞서 2.4.2단계 및 2.4.3단계에서 설명한 바와 같이 세포 생존율을 계산한다.
  6. 균질 설계 방법에 기반한 두 약물의 최적 조합 스크리닝
    참고: 황기 주사 및 브레비스카푸스 캡슐의 유효 농도 범위를 얻은 후 균일한 설계 방법 U 7(7 4) 표를 사용하여 두 약물의 6가지 다른 조합을 얻었습니다. 아스트 주입 : 에리 캡슐 : 1) 2 : 2.6 μM, 2) 4 : 5 μM, 3) 6 : 1.8 μM, 4) 8 : 4.2 μM, 5) 10 : 1 μM 및 6) 12 : 3.4 μM.
    1. 단계 2.3.1에서 상기와 같이 세포를 배양하고, 손상된 PC12 세포를 상기에서 언급한 바와 같이 Ast 주입:Eri 캡슐의 6가지 비율 농도로 처리한다.
    2. 세포를 24시간 동안 처리하고 2.4.2단계 및 2.4.3단계에서 이전에 설명한 대로 세포 생존율을 계산합니다.
  7. 손상된 PC12 세포에 대한 두 가지 최적 조합의 보호 효과 평가
    참고: 최적의 제제 조합(Ast 주사:6:1.8μM의 Eri 캡슐) 및 최적의 성분 조합7 (10μM 아스트라갈로시드 A, 40μM 스쿠텔라린 및 75μM 클로로겐산)을 얻은 후 손상된 PC12 세포에 대한 보호 효과를 확인하기 위해 추가 평가가 수행됩니다.
    1. 단계 2.3.1에서 전술한 바와 같이 세포를 배양하고, 손상된 PC12 세포를 상기 참고에 논의된 바와 같이 두 가지 유형의 약물 조합으로 처리한다.
    2. 세포를 24시간 동안 처리하고 2.4.2단계 및 2.4.3단계에서 이전에 설명한 대로 세포 생존율을 계산합니다.

3. 아폽토시스 속도에 대한 아넥신 V-FITC/PI 분석

  1. PC12 세포를 1.3 x 105 세포/웰의 농도로 12웰 플레이트에 시드하고 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
  2. 세포를 그룹화하십시오 : 대조군, 모델 그룹 및 두 가지 약물 조합. 대조군에 1.2mL/웰의 완전 배지를 추가하고, 0.4mM CoCl2를 포함하는 1.2mL/웰의 배지를 모델 그룹에 추가하고, 0.4mMCoCl2를 포함하는 두 조합 각각에 대해 1.2mL/웰을 추가합니다. 세포를 37°C에서 24시간 더 배양한다.
  3. 약물 처리 후 세포를 250μL/웰의 트립신으로 처리하고 세포를 15mL 원심분리 튜브에 옮기고 실온(RT)에서 5분 동안 840xg로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 펠렛을 결합 완충액 500 μL에 재현탁시킨다.
    1. RT에서 15분 동안 5μL의 아넥신 V-FITC와 10μL의 프로피듐 요오드화물(PI)로 세포를 어둠 속에서 배양한 다음 유세포 분석으로 세포자멸사를 확인합니다. 각 그룹에 세 개의 반복 웰을 설정합니다.
      참고: EDTA는 칼슘 이온과 결합하기 위해 아넥신 V와 경쟁하고 PI에 대한 아넥신의 친화력에 영향을 미치는 금속 이온 킬레이트제이기 때문에 이 테스트에 사용된 트립신은 EDTA를 포함할 수 없습니다. 세포 사멸이 발생하면 원래 세포막의 안쪽에있는 포스 포 세린이 세포 표면으로 바깥쪽으로 향하고 Annexin V-FITC는 막 외부의 포스 포 세린에 선택적으로 결합하여 녹색 형광을 나타냅니다.
    2. 시작 메뉴에서 자동 보정을 클릭하고 선택 채널에서 FITC, PE, PerCP 및 APC를 선택한 다음 보정 위치: 높이를 선택합니다. 통계 항목에서 확인을 클릭합니다: 중앙값. 2.3.2단계에서 언급한 것과 동일한 세포 계수 방법을 사용하여 세포 샘플을 수집하고 밀도 맵을 클릭한 다음 유효 세포 집단에 동그라미를 칩니다.
    3. FITC 형광을 X축 파라미터로 사용하고 다른 형광 파라미터를 Y축 파라미터로 사용하여 밀도 맵을 생성합니다. 시작 메뉴에서 보상 매트릭스를 클릭하고 오버플로 매트릭스에서 계수를 클릭합니다. 밀도 맵 정보는 세포사멸률의 분석을 위해 표시됩니다.

4. 카스파제-3 세대의 면역형광 검출

  1. PC12 셀을 8 x 104 셀/커버슬립의 밀도로 커버슬립에 시드하고 37°C에서 24시간 동안 24웰 플레이트에 넣습니다. 단계 3.2에서 위에서 언급 한 바와 같이 세포를 그룹화하십시오. 각 그룹에 대해 세 개의 반복 커버슬립을 설정합니다.
  2. 약물 치료 후 커버슬립을 PBS(37°C)로 각각 5분 동안 두 번 헹구고 4% 파라포름알데히드로 15분 동안 고정하고 RT에서 0.5% 트리톤 X-100으로 20분 동안 투과합니다.
  3. 세포를 다시 헹구고 RT에서 1 시간 동안 10 % 염소 혈청으로 차단하십시오.
  4. 각 커버슬립을 1x TBST에서 1:250의 농도로 희석한 200μL의 1차 항체 카스파제-3(세포자멸사의 핵심 실행 단백질)과 함께 4°C에서 밤새 배양합니다. 1x TBST (각 3 분 동안 3 회)로 세척하고 200 μL의 2 차 항체 (1x TBST에서 1 : 300 희석)와 함께 어두운 곳에서 RT에서 1 시간 동안 배양합니다.
    참고: 형광은 쉽게 소멸됩니다. 따라서, 2 차 항체의 배양 후, 슬라이드는 빛으로부터 멀리 유지되어야한다. 1차 및 2차 항체는 빛으로부터 떨어진 4°C에서 보관해야 합니다.
  5. 300μL의 DAPI(0.5μg/mL)를 커버슬립(핵 검출용)에 10분 동안 추가하고 각각 5분 동안 1x TBST로 세포를 3회 세척합니다.
  6. 형광 현미경으로 커버슬립을 관찰하고 이미지10을 캡처합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 형광 강도의 통계 분석을 수행합니다.
    알림: 사용된 슬라이드와 커버슬립은 깨끗하고 멸균되어야 합니다. 염색 할 때 염색 용액의 pH, 농도 및 온도에주의하고 형광 담금질을 피하십시오. 형광 현미경은 수은 램프를 예열하기 위해 최소 15분 전에 켜고 다시 켜기 전에 30분 동안 꺼야 합니다. 이미지를 획득할 때 동일한 실험 배치에서 동일한 염료의 노출 매개변수는 결과의 정확성을 보장하기 위해 일관되어야 합니다.

5. ROS 수준의 면역형광 분석

  1. 세포를 배양하고 단계 4.1에 논의된 바와 같이 처리한다.
  2. 약물 처리 후 각 커버슬립을 PBS로 3회 3회 세척하고 37°C에서 20분 동안 400μL의 DCFH-DA(10μM)와 함께 배양합니다.
    참고: DCPH-DA는 산화 스트레스의 보편적인 지표입니다. 세포막 투과성과 형광이 없습니다. 일단 세포에 들어가면 에스테라아제에 의해 가수 분해되어 2',7'- 디클로로 디 하이드로 플루오 레세 인 (DCFH)을 생성 한 다음 빠르게 산화되어 강력한 형광 생성물을 생성합니다.
  3. 세포를 무혈청 DMEM(각각 3분 동안 2회)으로 다시 세척하고 형광 현미경으로 형광 소광제를 첨가한 후 커버슬립을 즉시 관찰합니다. 이미징 소프트웨어로 상대 형광 강도를 계산합니다.
    알림: DCFH-DA 프로브를 로드한 후 셀에 들어가지 않는 잔류 프로브를 청소하십시오. 그렇지 않으면 배경이 높아집니다.

6. Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 및 Bax 11,12의 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 검출

  1. PC12 세포를 1 x 10 6 세포/웰의 농도로6 웰 플레이트에 접종하고 37°C에서 24시간 동안 배양합니다. 단계 4.1에서 전술한 바와 같이 세포를 그룹화하고, 처리하고, 각 그룹에 3개의 반복 웰을 설정하였다.
  2. 24시간 동안 약물 처리 후, 세포를 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척하고 준비된 용해 완충액에서 30분 동안 얼음 위에서 배양한다. 용해 후, 세포를 16,000 x g 및 4°C에서 20분 동안 원심분리하고 상청액을 수집한다.
  3. 단백질 농도를 검출하고 Bradford 분석을 통해 지침에 따라 조정합니다. 샘플을 희석하고 100°C에서 10분 동안 변성시킨다.
    참고: 용해 완충액은 포스파타제 억제제, 프로테아제 억제제 및 RIPA 용해물로 1:1:50의 부피비로 구성됩니다. 대조군에서는 200 μL/웰의 용해 완충액이 필요하고, 다른 그룹에서는 100 μL/웰의 용해 완충액이 필요합니다. 일반적으로 대조군, 모델 및 두 가지 유형의 조합 그룹의 단백질 농도는 각각 0.45 mg / mL, 0.25 mg / mL 및 0.32-0.39 mg / mL입니다. 로딩 완충액으로 희석 한 후 단백질 농도는 각각 0.36, 0.2 및 0.256-0.312 mg / mL입니다.
  4. 분자량이 다른 단백질을 검출하려면 각 레인에 25μg의 단백질을 로드하고 12% SDS-PAGE 전기영동을 실행한 다음 젤을 PVDF 멤브레인으로 옮깁니다.
    참고 : SDS 젤을 준비하는 동안 기포나 불용성 입자없이 완전히 혼합되어야합니다. 그렇지 않으면 고르지 않거나 불규칙한 밴드가 발생할 수 있습니다. 멤브레인을 옮길 때 PVDF 멤브레인과 젤 사이에 기포가 없는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 스트립에 흰색 점이 나타납니다. 또한이 단계는 저온에서 수행해야하며 얼음 주머니는 30 분마다 교체해야합니다.
  5. RT에서 1.5 시간 동안 5 % 무 지방 우유로 막을 차단하고 4 ° C에서 24 시간 동안 상응하는 1 차 항체 (Nrf2 1 : 1,000, Akt 1 : 2,000, p-Akt 1 : 2,000, Bcl-2 1 : 5,000 및 Bax 1 : 1,000)의 5mL와 함께 배양합니다. β-액틴(1:5,000) 항체를 내부 대조군으로 사용합니다.
  6. TBST로 멤브레인을 세척한 다음(각각 10분 동안 3회) RT에서 2시간 동안 5mL의 2차 HPR 접합 항체(1:5,000)와 함께 배양합니다.
    참고: 항체의 희석 비율은 임의로 변경되어서는 안 되며, 밴드의 배경색이 너무 검은색이 되지 않도록 요구 사항에 따라 TBST로 막을 충분히 세척해야 합니다.
  7. 마지막으로, TBST로 멤브레인을 다시 세척하고, 단백질 밴드 검출을 위해 화학발광 HRP 기질(제조업체의 지침에 따라)로 처리한다. 화학발광 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 캡처하고 이미징 소프트웨어를 사용하여 단백질의 회색 값을 정량화하며, β-액틴을 비교 내부 대조군으로 사용합니다.

결과

Ast 주사와 Eri 캡슐의 최적 조합의 스크리닝은 그림 1에 나와 있습니다. 정상 PC12 세포에 대한 Ast 주사 및 Eri 캡슐의 세포 생존율은 도 1A에 나타내었다. 세포 생존율은 12 μM 이상의 농도에서 Ast 주사 (그림 1A) 및 5 μM 이상의 농도에서 Eri 캡슐 (그림 1A)에서 95 %보다 낮았으며, 이는 최대 무독성 농도가 각각 12 μ...

토론

현대 임상 실습에서 뇌 허혈 치료를위한 이상적인 약물은 여전히 부족합니다2. 기를 보충하고 혈액 순환 방법을 활성화시키는 지침에 따라 Ast, Eri 및 기타 제제가 TCM의 임상 실습에서 병용되어 왔으며 우수한 종합 이점을 달성했습니다13,14,15. 많은 연구에 따르면 Ast는 혈액 뇌 장벽의 투과성을 향상시키고 뇌 ...

공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 쓰촨성 과학기술부(2020YFS0325)의 주요 R&D 프로젝트에서 자금을 지원받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1300 series class II biosafety cabinetThermo Fisher Scientific Instruments Company1374
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromideGuangzhou saiguo biotech Company1334GR001MTT
ACEA NovoExpress 1.4.0ACEA Biosciences, Inc-
AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc10176-2-AP
Analytical flow cytometryThermo Fisher Scientific Instruments Company62-2-1810-1027-0
Annexin V-FITC apoptosis detection kitBeyotime Biotechnology CompanyC1062L
Astragalus injectionHeilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical CompanyA03190612144Ast injection
Astragaloside AChongqing Gao Ren Biotechnology Company84687-43-4
BaxWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc60267-1-Ig
BCA protein quantification kitBeyotime Biotechnology CompanyP0012
Bcl-2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc26593-1-AP
Carbon dioxide incubatorsThermo Fisher Scientific Instruments Company0816-2014
Caspase-3Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc19677-1-AP
Chlorogenic acidChongqing Gao Ren Biotechnology Company327-97-9
Cobalt chloride hexahydrateMerck Biotechnology, Inc.7791-13-1CoCl2
Dimethyl sulfoxideGuangzhou saiguo biotech Company2020112701DMSO
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrateChengdu Kolon Chemical Company2020090101
DMEM high sugar mediumThermo scientific Hyclone2110050
DMEM sugar free mediumBeijing Solarbio life sciences Company2029548
ECL luminous fluidLianshuo Biological CompanyWBKLS0500
Electronic balanceHaozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, ChinaFA1204
Electrophoresis instrumentBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1658026
Erigeron breviscapus capsuleYunnan Biogu Pharmaceutical CompanyZ53021671Eri capsule
Fetal bovine serumFour Seasons Institute of Biological Engineering20210402FBS
Fluorescent microscopeOlympms CorporationIX71-F32PH
Gel imagerBio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd1708265
Goat anti-mouse secondary antibodyWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001-1
Goat anti-rabbit secondary antibodyWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001- 2
IBM SPSS Statistics version 26.0International Business Machines Corporation, USA-
ImageJ 1.8.0National Institutes of Health, USA-imaging software
Immunol fluorescence staining kitBeyotime Biotechnology CompanyP0196
KClChengdu Kolon Chemical Company2021070901
MarkerThermo Fisher Scientific Instruments Company26616
Microplate readerPerkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co.HH35L2018296
Motic Inverted microscopeNanda Scientific Instruments Co.AE2000LED
NaClChengdu Kolon Chemical Company2014081301
Nonfat milkBeyotime Biotechnology CompanyP0216
Nrf2Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc16396-1-AP
P-AktWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66444-1-Ig
PC12 cellsChinese Academy of SciencesCBP60430
Penicillin-Streptomycin solutionThermo scientific HycloneSV30010
Phosphatase protease inhibitor mixtureBeyotime Biotechnology CompanyP1045
Potassium dihydrogen phosphateChengdu Kolon Chemical Company2015082901
Reactive oxygen species assay kitBeyotime Biotechnology CompanyS0033S
RI-PA lysis solutionBeyotime Biotechnology CompanyP0013B
ScutellarinChongqing Gao Ren Biotechnology Company27740-01-8
SDS-PAGE sample loading buffer, 5xBeyotime Biotechnology CompanyP0015L
Sterile filter tips (0.22 µm)Merck Biotechnology, Inc.SLGP033RB
Tris-baseGuangzhou saiguo biotech Company1115GR500 TBS
TrypsinThermo scientific HycloneJ190013
Tween-20Chengdu Kolon Chemical Company2021051301
Vortex oscillatorOHAUS International Co., Ltd., Shanghai, ChinaVXMNAL
β-actinWuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc66009-1-Ig

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